專利名稱：一種改造已知載體多克隆位點(diǎn)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于克隆技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種改造已知載體多克隆位點(diǎn)的方法。
背景技術(shù)：
應(yīng)用雙酶切對目標(biāo)序列進(jìn)行定向克隆是載體構(gòu)建過程中最常用的方法。這一方法能極大地減少重組過程中的載體本身自連現(xiàn)象，提高構(gòu)建效率。然而，在很多情況下，尤其是待克隆的目標(biāo)DNA片段較長時(shí),很難在已知載體的多克隆位點(diǎn)multiple cloning sites(簡稱MCS)中找到2個(gè)合適 的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。另外，在雙酶切過程中，有些限制性內(nèi)切酶之間的組合會(huì)嚴(yán)重降低彼此或其中之一的酶切效率，最終影響構(gòu)建效率。因此，對載體的多克隆位點(diǎn)進(jìn)行改造是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的常見情況，而這時(shí)便需要一種簡便、高效的多克隆位點(diǎn)改造方法。目前，對載體的多克隆位點(diǎn)進(jìn)行改造的方法主要有3種:I)直接合成一段雙鏈DNA片段，雙酶切消化、回收后連接至原載體。由于合成的片段較短，該方法在膠回收過程中的得率通常較低。2)基于連接子linker技術(shù)的方法，合成兩個(gè)含所需酶切位點(diǎn)的互補(bǔ)的寡核苷酸序列，常規(guī)引物5’末端為羥基，用于連接子的引物5’末端需磷酸化，在PCR反應(yīng)中通過退火獲得具有粘性末端的雙鏈的DNA片段，爾后不經(jīng)過膠回收，直接與待改造的載體進(jìn)行常規(guī)的酶切連接反應(yīng)，完成原載體多克隆位點(diǎn)的改造。然而，由于不經(jīng)過膠回收，導(dǎo)致原退火反應(yīng)中的緩沖液殘留會(huì)影響下一步連接酶的連接效率。3)以另一載體的多克隆位點(diǎn)為來源，通過酶切、回收、再連接至待改造載體的多克隆位點(diǎn)中。然而，由于載體中的多克隆位點(diǎn)序列通常較短，為IOObp左右，使得酶切后的片段在膠回收中的得率通常不高，導(dǎo)致構(gòu)建效率低。牛麟等提出在載體的MCS中插入一段238bp的輔助片段，爾后再用此MCS取代待被改造載體的MCS，最后再切除插入的輔助片段，完成載體的改造，但是該方法需要有原始的MCS模板序列，導(dǎo)致操作靈活性較低。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種改造已知載體多克隆位點(diǎn)的方法，以實(shí)現(xiàn)簡便快捷、可操作性強(qiáng)、效率高地改造已知載體多克隆位點(diǎn)。為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種改造已知載體多克隆位點(diǎn)的方法，即銜接子引物-PCR法，其特征在于包括以下步驟:步驟一，設(shè)計(jì)銜接子引物，用銜接子引物對目標(biāo)片段進(jìn)行擴(kuò)增；步驟二，利用原載體已知酶切位點(diǎn)分別對擴(kuò)增片段與原載體進(jìn)行雙酶切，酶切后進(jìn)行凝膠電泳，切膠后采用凝膠回收試劑盒回收目標(biāo)片段，片段回收后通過T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)；步驟三，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，驗(yàn)證新引入的酶切位點(diǎn)的正確性。所述步驟一中設(shè)計(jì)銜接子引物的方法為:以實(shí)驗(yàn)中現(xiàn)有的在動(dòng)植物或昆蟲等物種基因組中擴(kuò)增效率較好的引物對為基礎(chǔ)引物，避免基礎(chǔ)引物及其擴(kuò)增序列中包含所要添加的酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增序列長度在IKb以內(nèi)；在基礎(chǔ)引物對的前引物5’端依次添加酶切保護(hù)堿基、待改造載體多克隆位點(diǎn)中的某一酶切位點(diǎn)序列以及需添加的酶切位點(diǎn)序列，獲得銜接子iu引物序列；在基礎(chǔ)引物對的后引物5’端依次添加保護(hù)喊基、待改造載體多克隆位點(diǎn)中另一酶切位點(diǎn)序列以及需添加的酶切位點(diǎn)序列，獲得銜接子后引物序列；以銜接子前后引物對，擴(kuò)增原基礎(chǔ)引物擴(kuò)增的基因組DNA即模板DNA，獲得目標(biāo)片段。所述銜接子引物-PCR法的反應(yīng)體系為20 μ 1，包含2 μ I即IOOng模板DNA、2 μ I的IOX聚合酶緩沖液、0.4μ I的IOmM dNTP ；0.4μ I的10 μ M銜接子前后引物各，I μ I的高保真聚合酶、13.8 μ I的超純水；PCR方法的過程為:在94°C下預(yù)變性5分種；在94°C下變性30秒，在55°C下退火30秒，在72°C延伸I分種，循環(huán)35次；在72°C下延伸5分鐘；12°C保溫2小時(shí)；退火溫度根據(jù)所設(shè)計(jì)引物的基礎(chǔ)引物退火溫度作相應(yīng)調(diào)整。所述步驟二中雙酶切體系中各試劑及用量分別為:擴(kuò)增片段酶切體系為60ul，試劑包括20 μ I的銜接子引物擴(kuò)增片段、6.0 μ I的IOX內(nèi)切酶緩沖液、1.0 μ I的內(nèi)切酶1、Ι.Ομ I的內(nèi)切酶II和32 μ I的超純水；載體酶切體系為60ul，試劑包括15 μ I即600ng的載體、6.0μ I的IOX內(nèi)切酶緩沖液、Ι.Ομ I的內(nèi)切酶Ι、1.0μ I的內(nèi)切酶II和37 μ I的超純水。采用1%瓊脂糖凝膠對所述酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。對符合預(yù)期大小的原載體酶切片段、銜接子引物擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切片段，采用Promga公司的凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。將各片段的回收產(chǎn)物采用Τ4 連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。所述步驟二中連接反應(yīng)體系中各試劑及用量分別為:銜接子引物擴(kuò)增片段酶切回收產(chǎn)物4.0 μ 1，原載體酶切回收產(chǎn)物2.0 μ 1，10ΧΤ4連接緩沖液1.0 μ 1，Τ4連接酶1.0 μ I和超純水2.0 μ I;連接條件為在溫度16°C下，連接8小時(shí)。所述步驟三中感受態(tài)細(xì)胞為:大腸桿菌菌株DH5 α或ToplO ;正確的重組質(zhì)粒為在使用新的限制性內(nèi)切酶雙酶切后，在凝膠電泳中出現(xiàn)2條電泳條帶，其中一條與原載體片段大小接近，另一條帶與原基礎(chǔ)引物擴(kuò)增片段大小接近。連接產(chǎn)物大腸桿菌轉(zhuǎn)化與PCR陽性檢測。采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法，將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株DH5 α或Τ0Ρ10感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有相應(yīng)抗生素(與原載體中在細(xì)菌中篩選的抗生素相同)的LB平板上，37°C過夜培養(yǎng)。挑取平板中長出的單克隆菌落，進(jìn)行單克隆PCR檢測，檢測用引物為原基礎(chǔ)引物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，電泳結(jié)果中出現(xiàn)與原基礎(chǔ)引物擴(kuò)增片段大小相同的電泳條帶的單克隆為陽性克隆。對陽性克隆在含有相應(yīng)抗生素的LB液體中進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37°C，時(shí)間12小時(shí)，采用Promga公司的質(zhì)粒提取試劑盒提取培養(yǎng)產(chǎn)物中的質(zhì)粒DNA (或載體DNA)。采用與單克隆PCR陽性檢測的相同方法對質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR檢測，保存正確的重組質(zhì)粒DNA或改造后的載體DNA。對改造后的載體進(jìn)行酶切驗(yàn)證，確定新添加的酶切點(diǎn)有效。具體為:采用新添加的兩個(gè)限制性內(nèi)切酶對改造后的載體進(jìn)行雙酶切，酶切結(jié)果采用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測；正確的改造載體的酶切產(chǎn)物在凝膠電泳中應(yīng)該出現(xiàn)2條電泳條帶，其中一條與原載體片段大小接近，另一條帶與原基礎(chǔ)引物擴(kuò)增片段大小接近。本步驟中的雙酶切體系為20ul，包括如下組分:
試劑I用量(μ I)—
權(quán)利要求
1.一種改造已知載體多克隆位點(diǎn)的方法，即銜接子引物-PCR法，其特征在于包括以下步驟: 步驟一，設(shè)計(jì)銜接子弓I物，用銜接子引物對目標(biāo)片段進(jìn)行擴(kuò)增； 步驟二，利用原載體已知酶切位點(diǎn)分別對擴(kuò)增片段與原載體進(jìn)行雙酶切，酶切后進(jìn)行凝膠電泳，切膠后采用凝膠回收試劑盒回收目標(biāo)片段，片段回收后通過T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)； 步驟三，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，驗(yàn)證新引入的酶切位點(diǎn)的正確性。
2.一種如權(quán)利要求1所述的改造已知載體多克隆位點(diǎn)的方法，其特征在于所述步驟一中設(shè)計(jì)銜接子引物的方法為:以實(shí)驗(yàn)中現(xiàn)有的在動(dòng)植物或昆蟲等物種基因組中擴(kuò)增效率較好的引物對為基礎(chǔ)引物，避免基礎(chǔ)引物及其擴(kuò)增序列中包含所要添加的酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增序列長度在IKb以內(nèi)；在基礎(chǔ)引物對的前引物5’端依次添加酶切保護(hù)堿基、待改造載體多克隆位點(diǎn)中的某一酶切位點(diǎn)序列以及需添加的酶切位點(diǎn)序列，獲得銜接子前引物序列；在基礎(chǔ)引物對的后引物5’端依次添加保護(hù)堿基、待改造載體多克隆位點(diǎn)中另一酶切位點(diǎn)序列以及需添加的酶切位點(diǎn)序列，獲得銜接子后引物序列；以銜接子前后引物，擴(kuò)增原基礎(chǔ)引物擴(kuò)增的基因組DNA (即模板DNA)，獲得目標(biāo)片段。
3.—種如權(quán)利要求1或2所述的改造已知載體多克隆位點(diǎn)的方法，其特征在于:所述銜接子引物-PCR法的反應(yīng)體系為20μ 1，包含2μ I即IOOng模板DNA、2y I的IOX聚合酶緩沖液、0.4μ I的IOmM dNTP ；0.4μ I的10 μ M銜接子前后引物各，I μ I的高保真聚合酶、13.8 μ I的超純水；PCR方法的過程為:在94°C下預(yù)變性5分種；在94°C下變性30秒，在55°C下退火30秒，在72°C延伸I分種，循環(huán)35次；在72°C下延伸5分鐘；12°C保溫2小時(shí)；退火溫度根據(jù)所設(shè)計(jì)引物的基礎(chǔ)引物退火溫度作相應(yīng)調(diào)整。
4.一種如權(quán)利要求1所述改造已知載體多克隆位點(diǎn)的方法，其特征在于所述步驟二中雙酶切體系中各試劑及用量分別為:擴(kuò)增片段酶切體系為60ul，試劑包括20μ I的銜接子引物擴(kuò)增片段、6.0μ I的IOX內(nèi)切酶緩沖液、1.0μ I的內(nèi)切酶Ι、1.0μ I的內(nèi)切酶II和32 μ I的超純水；載體酶切體系為60ul，試劑包括15 μ I即600ng的載體、6.0 μ I的IOX內(nèi)切酶緩沖液、1.0y I的內(nèi)切酶1、1.0μ I的內(nèi)切酶II和37μ I的超純水。
5.一種如權(quán)利要求1所述改造已知載體多克隆位點(diǎn)的方法，其特征在于所述步驟二中連接反應(yīng)體系中各試劑及用量分別為:銜接子引物擴(kuò)增片段酶切回收產(chǎn)物4.0 μ 1，原載體酶切回收產(chǎn)物2.0μ 1，10ΧΤ4連接緩沖液Ι.Ομ 1，Τ4連接酶Ι.Ομ 1，超純水2.0μ I;連接條件為在溫度16°c下，連接8小時(shí)。
6.一種如權(quán)利要求1所述改造已知載體多克隆位點(diǎn)的方法，其特征在于所述步驟三中的感受態(tài)細(xì)胞為:大腸桿菌菌株DH5a或ToplO ;正確的重組質(zhì)粒為在使用新的限制性內(nèi)切酶雙酶切后，在凝膠電泳中出現(xiàn)2條 電泳條帶，其中一條與原載體片段大小接近，另一條帶與原基礎(chǔ)引物擴(kuò)增片段大小接近。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種改造已知載體多克隆位點(diǎn)的方法，即銜接子引物-PCR法，包括以下步驟應(yīng)用一對5’末端分別添加了多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的銜接子引物擴(kuò)增任一物種中的已知DNA片段；用擴(kuò)增片段兩端的限制性內(nèi)切酶雙酶切，再用T4DNA連接酶將其連接至待改造載體的多克隆位點(diǎn)中；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證改造的載體是否帶有新的酶切位點(diǎn)，保留正確的質(zhì)粒載體。本發(fā)明能在已知載體多克隆位點(diǎn)中快速、便捷的添加新的酶切位點(diǎn)，以滿足具體實(shí)驗(yàn)的需要，成本低廉，靈活性高，可應(yīng)用于改造已知載體多克隆位點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/66GK103194474SQ20131011996
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月9日
發(fā)明者左示敏, 薛薌, 李磊, 張亞芳, 潘學(xué)彪, 陳宗祥 申請人:揚(yáng)州大學(xué)