專利名稱：一種珊瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)增殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種珊瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)增殖方法。
背景技術(shù)：
植物組織培養(yǎng)包括器官培養(yǎng)、愈傷組織培養(yǎng)、莖尖組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)等。其中愈傷組織培養(yǎng)最常見，因?yàn)槌o尖分生組織培養(yǎng)和少數(shù)器官培養(yǎng)外，其它類型都要經(jīng)歷愈傷組織階段才能產(chǎn)生再生植株，其原理是利用植物細(xì)胞的全能性，愈傷組織的形成在組織培養(yǎng)技術(shù)中有著至關(guān)重要的地位，許多藥用植物中的活性成分可直接通過愈傷組織進(jìn)行合成。珊瑚菜是生長在北太平洋沿海地區(qū)沙灘地的一種傘形科多年生草藥。在我國分布于遼寧、山東、江蘇等地，生長于海邊沙灘或人工栽培，原為海灘沙生植物群落的建群種之一，對海岸固沙和鹽堿土改良具重要作用，但隨著海灘的濫用開發(fā)和對該植物的過度采挖，使其數(shù)量日趨減少，已經(jīng)處于瀕臨滅絕的境地，被列為中國珍稀瀕危保護(hù)植物。而人工栽培技術(shù)要求高，種子萌發(fā)率低，生長周期長，掠奪式的采集野生資源又會危及生態(tài)平衡。珊瑚菜具有較高的藥用價值，其根狀莖和根可作生藥，被收入日本和中國藥典。珊瑚菜根(北沙參)中含有多種香豆素和香豆素苷，主要有歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯、佛手素、花椒毒酚、花椒毒素、補(bǔ)骨脂素、東莨菪素、紫花前胡苷元等。其中補(bǔ)骨脂素、歐前胡素和異歐前胡素三種香豆素的含量可作為評價北沙參不同部位質(zhì)量及產(chǎn)地加工方法的標(biāo)準(zhǔn)。研究表明，北沙參在體內(nèi)具有抗癌作用的主要活性成分為呋喃香豆素，其中濃度為50μ g/mL的歐前胡素和異歐前胡素抑制活性最強(qiáng)。大多數(shù)藥用植物的根不僅可提供生物藥學(xué)成分，而且也是農(nóng)藥、風(fēng)味調(diào)料、染料和香料的重要來源，而根中的有效成分是植物的次級代謝產(chǎn)物，具有較高的應(yīng)用價值，因此利用根的體外培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物越來越受到學(xué)者們的關(guān)注。毛狀根培養(yǎng)技術(shù)是20世紀(jì)80年代后期，在植物細(xì) 胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域中發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)，目前美國、英國、加拿大、日本、中國及韓國都在對藥用植物毛狀根的誘導(dǎo)培養(yǎng)進(jìn)行著大量的基礎(chǔ)研究，研究表明，毛狀根具有細(xì)胞培養(yǎng)和一般器官培養(yǎng)所不能兼?zhèn)涞奶攸c(diǎn)，幾乎所有雙子葉植物中由根部合成的次級代謝物質(zhì)都可以通過毛狀根來生產(chǎn)，這一生物技術(shù)為植物有用成分的大量生產(chǎn)提供了新的途徑，日益引起人們的關(guān)注。利用發(fā)根農(nóng)桿菌感染誘導(dǎo)藥用植物形成毛狀根，并對毛狀根進(jìn)行離體培養(yǎng)增殖，是對藥用資源植物可持續(xù)利用的有效途徑之一。毛狀根具有生長速度快、培養(yǎng)增殖不需要加入激素、分化程度高、產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的能力強(qiáng)、可以通過基因工程的手段來增加次生代謝產(chǎn)物的含量、并能夠合成某些懸浮細(xì)胞培養(yǎng)所不能合成的次生代謝產(chǎn)物等優(yōu)點(diǎn)，越來越受諸多專家研究者的重視。但是目前對于珊瑚菜活性物質(zhì)的誘導(dǎo)及生產(chǎn)還處于利用常規(guī)組織培養(yǎng)及細(xì)胞培養(yǎng)手段的水平，關(guān)于珊瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)尚未有人研究
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種珊瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)增殖方法，利用本發(fā)明所述方法誘導(dǎo)的珊瑚菜毛狀根具有生長迅速，周期短，次級代謝產(chǎn)物相對產(chǎn)量高等特點(diǎn)，可用于工業(yè)化生產(chǎn)珊瑚菜香豆素。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):一種珊瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)增殖方法，它包括以下步驟:(I)獲得珊瑚菜無菌苗；(2)培養(yǎng)供感染用的發(fā)根農(nóng)桿菌；(3)轉(zhuǎn)化外植體進(jìn)行共培養(yǎng):取長勢較好的珊瑚菜無菌苗，切取根、葉柄或葉片作為外植體，在其表面劃出傷口用于感染，放入發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中浸泡，然后放入MS固體培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，直至外植體周邊出現(xiàn)菌斑；(4)誘導(dǎo)毛狀根發(fā)生:將出現(xiàn)菌斑的外植體清洗后，放入含有頭孢噻肟鈉的1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，定期更換1/2MS培養(yǎng)基，在更換的培養(yǎng)基中逐步降低頭孢噻肟鈉的濃度，直到在完全除掉頭孢噻肟鈉的1/2MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，獲得除菌的毛根系；(5)毛狀根的培養(yǎng)增殖:將除菌完全、生長快速的毛狀根接種在1/2MS液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)增殖，獲得大量毛狀根。對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(I)中選擇飽滿的珊瑚菜種子，滅菌，后接種于MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得無菌苗。對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(2)中所用菌種為發(fā)根農(nóng)桿菌1.2556。
對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(2)中發(fā)根農(nóng)桿菌的感染菌液最佳濃度為 OD600=0.08。對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(3)中所述外植體優(yōu)選為無菌苗的根，其次為葉柄，再次為葉片。對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(3)中珊瑚菜無菌苗放入發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中浸泡15-30min。對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(3)中共培養(yǎng)時間為2-5d。對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(4)中將外植體放入含有頭孢噻肟鈉300mg/L的1/2MS培養(yǎng)基中，于25°C黑暗培養(yǎng)13_16d。對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(4)中在1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)每7-10d換一次培養(yǎng)基，最初頭孢噻肟鈉的濃度為300mg/L，逐步降低Cef的濃度為每換一次培養(yǎng)基降低50mg/L頭孢噻肟鈉。對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):利用分光光度法測定珊瑚菜毛狀根中香豆素含量的波長為325nm。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:本發(fā)明以珊瑚菜葉片為實(shí)驗(yàn)材料，誘導(dǎo)愈傷組織的生成，并利用石蠟切片技術(shù)對其發(fā)生進(jìn)行了跟蹤觀察，為珊瑚菜組織培養(yǎng)提供理論依據(jù)，并為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明利用已形成的愈傷組織，通過調(diào)節(jié)激素濃度篩選不定根的最佳誘導(dǎo)條件，以探索獲得大量珊瑚菜不定根的組織培養(yǎng)條件，并對形成的不定根進(jìn)行了擴(kuò)增培養(yǎng)，為提高珊瑚菜藥用活性部位的產(chǎn)量及工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。本發(fā)明利用發(fā)根農(nóng)桿菌感染誘導(dǎo)珊瑚菜毛狀根的形成，并建立離體毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)，分析測定了珊瑚菜毛狀根中主要藥用成分香豆素的含量，并與不定根和人工栽培的珊瑚菜根中香豆素的含量進(jìn)行了對比，以毛狀根中香豆素的含量最高，珊瑚菜毛狀根具有生長迅速，周期短，次級代謝產(chǎn)物相對產(chǎn)量高等特點(diǎn)，在不含激素的條件下一個多月便可獲得大量的毛狀根，可用于工業(yè)化生產(chǎn)珊瑚菜香豆素；為將來利用毛狀根工業(yè)化生產(chǎn)珊瑚菜次級代謝產(chǎn)物提供了新的途徑，從另一方面保護(hù)該瀕危植物，有利于維護(hù)生態(tài)平衡。結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明的具體實(shí)施方式
后，本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將變得更加清楚。
圖1為珊瑚菜葉片在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)過程的照片，表明珊瑚菜葉片形成愈傷組織過程中外部形態(tài)變化，其中圖1-1、1-2、1-3、1-4分別為培養(yǎng)時間7d、14d、20d和40d的照片。圖2為珊瑚菜愈傷組織誘導(dǎo)不定根的照片，其中2-1表明含IBA3mg/L的1/2MS培養(yǎng)基上不定根的生長情況；其中2-2表明含IBA5mg/L的1/2MS培養(yǎng)基上不定根的生長情況；其中2-3表明不定根在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)IOd的生長狀態(tài)；其中2-4表明不定根在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)50d的生長狀態(tài)。圖3為珊瑚菜種子的萌發(fā)情況，其中3-1為培養(yǎng)IOd的種子，示胚芽突破種子開始萌發(fā)；3-2為培養(yǎng)20d的種子，示兩片子葉逐漸從種子中冒出；3-3為培養(yǎng)25d的種子，示第一片真葉；3_4為培養(yǎng)40d的種子，示珊瑚菜無菌苗。3-5為誘導(dǎo)培養(yǎng)15d的外植體，白色透明的毛狀根；3_6為高濃度菌液處理下外植體生長情況，示褐化死亡的外植體。圖4為毛狀根在液體培養(yǎng)基中的生長過程，4-1為培養(yǎng)IOd的毛狀根，4-2為培養(yǎng)20d的毛狀根，4-3為培養(yǎng)35d的毛狀根，4-4為毛狀根PCR檢測結(jié)果，圖中M為Marker，I為發(fā)根農(nóng)桿菌1.2556T-DNA PCR擴(kuò)增條帶，2為毛狀根DNA PCR擴(kuò)增條帶，3為不定根DNA PCR擴(kuò)增條帶，4為無菌苗DNA PCR擴(kuò)增條帶。圖5為傘形花內(nèi)酷標(biāo)準(zhǔn)品溶液的光譜掃描圖。圖6為珊瑚菜毛狀根溶液的光譜掃描圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。實(shí)施例1一、珊瑚菜葉片愈傷組織發(fā)生1、實(shí)驗(yàn)材料植物材料選用無病蟲害的珊瑚菜葉片。MS (Murashige and Skoog)培養(yǎng)基中蔗糖濃度為30g/L，瓊脂含量為8g/L。愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2, 4-D0.15mg/L+6_BAl.8mg/L+NAA0.2mg/L。2、生化試劑和主要儀器MS培養(yǎng)基所用各成分以及酒精、甲醛、冰乙酸、二甲苯等試劑為國產(chǎn)分析純試劑。細(xì)胞分裂素6-BA以及生長素NAA、2，4_D均為上海生物工程公司化學(xué)分析純產(chǎn)品。組織培養(yǎng)常用儀器:無菌操作臺、手提式壓力蒸汽消毒器、HPG-280B光照培養(yǎng)箱坐寸O3、實(shí)驗(yàn)方法3.1外植體的處理方法取珊瑚菜葉片若干，洗凈表面塵土，放入燒杯中，流水沖洗lh，再用無菌水沖洗2-3次，將經(jīng)過上述處理的葉片放在無菌操作臺上，用濾紙吸干表面的水分，用75%的酒精消毒20s，無菌水沖洗3-5次，然后放入含有3-4滴吐溫20的10%的次氯酸鈉(有效氯1%)中消毒15min，無菌水沖洗3-5次，將葉片放在無菌濾紙上，切割成0.25cm2大小備用。3.2愈傷組織的誘導(dǎo)采用常規(guī)的組織培養(yǎng)方法(潘瑞熾.植物組織培養(yǎng).第三版.廣州:廣東高等教育教出版社，2003，64)培養(yǎng)珊瑚菜葉片，誘導(dǎo)愈傷組織生成。愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2, 4-D0.15mg/L+6-BAl.8mg/L+NAA0.2mg/L，光照周期為 16h:8h(光 / 暗)，其中光照溫度為25±2°C，黑暗溫度為20±2°C。4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果離體培養(yǎng)和外源激素是形成愈傷組織的關(guān)鍵條件，珊瑚菜葉片經(jīng)含有2，4-D0.15mg/L+6-BAl.8mg/L+NAA0.2mg/L的MS培養(yǎng)基成功誘導(dǎo)培養(yǎng)出淺黃色透明的愈傷組織。葉片經(jīng)培養(yǎng)3d后吸水膨脹，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，7d左右長出顆粒狀愈傷組織(圖
1-1);隨后愈傷組織逐漸積累(圖1-2) ;20d左右形成愈傷組織團(tuán)(圖1-3) ;40d后形成疏松的愈傷組織團(tuán)(圖1-4)。二、珊瑚菜不定根的誘導(dǎo)1、實(shí)驗(yàn)材料以上述獲得的長勢均勻健康的珊瑚菜葉片愈傷組織為實(shí)驗(yàn)材料。1/2MS培養(yǎng)基為大量元素減半，其它元素不變的MS培養(yǎng)基，蔗糖濃度為30g/L，瓊脂含量為6g/L。不定根誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為含不同濃度IBA的1/2MS培養(yǎng)基。2、生化試劑和主要儀器MS培養(yǎng)基所用各成分等常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純試劑。IBA為上海生物工程公司化學(xué)分析純產(chǎn)品。主要儀器:無菌操作臺、手提式壓力蒸汽消毒器、HPG-280B光照培養(yǎng)箱等組織培養(yǎng)常用儀器。3、實(shí)驗(yàn)方法采用常規(guī)組織培養(yǎng)方法，通過含不同濃度IBA的1/2MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織形成不定根，IBA分為5個濃度梯度，分別為:l、2、3、4、5mg/L，并以不含IBA的1/2MS培養(yǎng)基作對照，每個濃度及對照分別培養(yǎng)30塊大小均勻的愈傷組織塊，并設(shè)三個平行。黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25±2°C。記錄各條件下最早生根時間，并培養(yǎng)至生根穩(wěn)定，統(tǒng)計不同條件下愈傷組織塊的生根率及平均根長，獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行方差分析。4、結(jié)果與分析將愈傷組織切割轉(zhuǎn)移至對照及不同濃度IBA的1/2MS培養(yǎng)基中，各培養(yǎng)條件下均生成了不定根。IOd左右愈傷組織在含有各濃度IBA的培養(yǎng)基上相繼長出不定根，濃度較高的培養(yǎng)基生根時間相對較早，對照組生成不定根的時間最晚。記錄最早生根時間，45d后生根率穩(wěn)定，不再有新的不定根生成，統(tǒng)計各濃度下生根率及平均根長，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表I。表I不同IBA濃度下珊瑚菜不定根的誘導(dǎo)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種珊瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)增殖方法，其特征在于它包括以下步驟: (1)獲得珊瑚菜無菌苗； (2)培養(yǎng)供感染用的發(fā)根農(nóng)桿菌； (3)轉(zhuǎn)化外植體進(jìn)行共培養(yǎng):取長勢較好的珊瑚菜無菌苗，切取根、葉柄或葉片作為外植體，在其表面劃出傷口用于感染，放入發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中浸泡，然后放入MS固體培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，直至外植體周邊出現(xiàn)菌斑； (4)誘導(dǎo)毛狀根發(fā)生:將出現(xiàn)菌斑的外植體清洗后，放入含有頭孢噻肟鈉的1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，定期更換1/2MS培養(yǎng)基，在更換的培養(yǎng)基中逐步降低頭孢噻肟鈉的濃度，直到在完全除掉頭孢噻肟鈉的1/2MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，獲得除菌的毛根系； (5)毛狀根的培養(yǎng)增殖:將除菌完全、生長快速的毛狀根接種在1/2MS液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)增殖，獲得大量毛狀根。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的珊 瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)增殖方法，其特征在于:所述步驟(I)中選擇飽滿的珊瑚菜種子，滅菌，后接種于MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得無菌苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的珊瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)增殖方法，其特征在于:所述步驟(2)中所用菌種為發(fā)根農(nóng)桿菌1.2556。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的珊瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)增殖方法，其特征在于:所述步驟(2)中發(fā)根農(nóng)桿菌的感染菌液最佳濃度為OD6tltl=0.08。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的珊瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)增殖方法，其特征在于:所述步驟(3)中所述外植體優(yōu)選為無菌苗的根，其次為葉柄，再次為葉片。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的珊瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)增殖方法，其特征在于:所述步驟(3)中珊瑚菜無菌苗放入發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中浸泡15-30min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的珊瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)增殖方法，其特征在于:所述步驟(3)中共培養(yǎng)時間為2-5d。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的珊瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)增殖方法，其特征在于所述步驟(4)中將外植體放入含有頭孢噻肟鈉300mg/L的1/2MS培養(yǎng)基中，于25°C黑暗培養(yǎng)13_16d。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的珊瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)增殖方法，其特征在于所述步驟(4)中在1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)每7-10d換一次培養(yǎng)基，最初頭孢噻肟鈉的濃度為300mg/L，逐步降低頭孢噻肟鈉的濃度為每換一次培養(yǎng)基降低50mg/L頭孢噻肟鈉。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的珊瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)增殖方法，其特征在于:利用分光光度法測定珊瑚菜毛狀根中香豆素含量的波長為325nm。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種珊瑚菜毛狀根的誘導(dǎo)增殖方法，它包括獲得珊瑚菜無菌苗；培養(yǎng)供感染用的發(fā)根農(nóng)桿菌；轉(zhuǎn)化外植體進(jìn)行共培養(yǎng)；誘導(dǎo)毛狀根發(fā)生和毛狀根的培養(yǎng)增殖。本發(fā)明利用發(fā)根農(nóng)桿菌感染誘導(dǎo)珊瑚菜毛狀根的形成，建立離體毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)，并分析測定了其藥用成分香豆素的含量，與不定根和人工栽培的珊瑚菜根中香豆素的含量進(jìn)行了對比，以毛狀根中香豆素的含量最高，本發(fā)明中珊瑚菜毛狀根具有生長迅速，周期短，次級代謝產(chǎn)物相對產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，可用于工業(yè)化生產(chǎn)珊瑚菜香豆素；為將來利用毛狀根工業(yè)化生產(chǎn)珊瑚菜次級代謝產(chǎn)物提供了新的途徑，從另一方面保護(hù)該瀕危植物，有利于維護(hù)生態(tài)平衡。
文檔編號C12N5/04GK103146638SQ20131008163
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月14日
發(fā)明者辛華, 馬蓓蓓, 劉漢柱 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)