專利名稱：一種鼠李糖乳桿菌大豆酸乳直投式發(fā)酵劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鼠李糖乳桿菌大豆酸乳直投式發(fā)酵劑的制備方法，屬于發(fā)酵乳制品及植物蛋白加工技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
益生菌系指與人和動(dòng)植物體保持共生關(guān)系的對(duì)宿主具有健康促進(jìn)作用的一大類微生物的總稱。目前，國(guó)際公認(rèn)的與人體共生的典型的益生乳酸菌主要包括:以雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌為代表的第一代益生乳酸菌和以鼠李糖乳桿菌和干酪乳桿菌為代表的第二代新型益生乳酸菌。較之第一代益生乳酸菌，第二代新型益生乳酸菌更耐氧、耐胃酸、耐膽鹽；發(fā)酵性能更好、存活力更高。目前，鼠李糖乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)品主要為牛乳產(chǎn)品，而其發(fā)酵植物蛋白酸乳產(chǎn)品，在國(guó)內(nèi)外尚處于研究起步階段，且缺乏生產(chǎn)性能優(yōu)良的專用菌種。我國(guó)具有天然的大豆資源優(yōu)勢(shì)，大豆不僅在營(yíng)養(yǎng)保健的各種功能性成分和促進(jìn)益生菌繁殖的生長(zhǎng)因子方面可與牛乳相媲美，而且不含膽固醇和乳糖。因此，研制開(kāi)發(fā)出綜合益生菌和大豆的有益特性于一身、集感官風(fēng)味和多種營(yíng)養(yǎng)保健功能于一體的第二代新型益生菌(如鼠李糖乳桿菌)發(fā)酵大豆乳產(chǎn)品，是當(dāng)今發(fā)酵乳制品工業(yè)和大豆加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展方向與新的增長(zhǎng)點(diǎn)，必將引領(lǐng)市場(chǎng)與消費(fèi)者對(duì)健康食品需求的新潮流。發(fā)酵劑的制備是研制開(kāi)發(fā)新型發(fā)酵乳制品的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和首要任務(wù)。傳統(tǒng)培養(yǎng)型發(fā)酵劑存在活菌含量低(IO7 108cfu/mL)、接種量大(2% 5%)、保藏期短(4°C，I 2d)、生產(chǎn)工序多、勞動(dòng)強(qiáng)度大、培養(yǎng)周期長(zhǎng)、菌種極易退化和污染等弊端，這將直接導(dǎo)致發(fā)酵乳制品產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)和生產(chǎn)效率低下。因而，新型發(fā)酵劑——高效濃縮型直投式發(fā)酵劑應(yīng)運(yùn)而生。高效濃縮型直投式發(fā)酵劑系乳酸菌經(jīng)液體深層高密度培養(yǎng)、濃縮分離、與保護(hù)劑介質(zhì)混溶、再經(jīng)冷凍或冷凍干燥、無(wú)菌包裝，制成直投式凍藏發(fā)酵劑或直投式凍干發(fā)酵劑。具有活菌含量高(101° 1012cfu /g)、保藏期長(zhǎng)(凍干發(fā)酵劑4°C，>1年)、接種量較傳統(tǒng)培養(yǎng)型發(fā)酵劑降低1000 10000倍、在發(fā)酵乳制品生產(chǎn)中省略了發(fā)酵劑的制備工序、減少了菌種車(chē)間的投資和空間、防止了菌種的退化和污染，可使發(fā)酵乳制品工業(yè)的勞動(dòng)生產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量大大提高。直投式凍藏發(fā)酵劑在應(yīng)用中，維持冷凍費(fèi)用較高，運(yùn)輸不方便，對(duì)發(fā)酵劑中心的依賴性過(guò)強(qiáng)。而直投式凍干發(fā)酵劑，保藏和運(yùn)輸方便，機(jī)械化程度高，便于工業(yè)化批量生產(chǎn)，是今后直投式發(fā)酵劑的主要發(fā)展方向。影響高效濃縮型直投式凍干發(fā)酵劑細(xì)胞存活率及貯藏穩(wěn)定性的主要因素有:菌種特性、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件與收獲期、起始細(xì)胞濃度、凍干保護(hù)劑及其PH值、冷凍速度、干燥過(guò)程、殘留水分、包裝形式、保藏溫度等。其中，優(yōu)化篩選廉價(jià)增菌培養(yǎng)基和高效凍干保護(hù)劑是研制開(kāi)發(fā)直投式凍干發(fā)酵劑的關(guān)鍵技術(shù)。研究表明:乳酸菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求十分苛刻，實(shí)驗(yàn)室常用的乳酸菌培養(yǎng)基(如MRS、M17等)，成分復(fù)雜，制作繁瑣，價(jià)格昂貴。目前，常用的脫脂乳培養(yǎng)基和乳清培養(yǎng)基雖然經(jīng)濟(jì)易得，價(jià)格低廉，但脫脂乳培養(yǎng)基粘度大，不易濃縮分離菌體；而乳清培養(yǎng)基在加熱滅菌過(guò)程中易發(fā)生乳清蛋白的熱變性而產(chǎn)生沉淀。因此，根據(jù)我國(guó)資源優(yōu)勢(shì)，積極尋求來(lái)源廣泛，經(jīng)濟(jì)易得的廉價(jià)原料，優(yōu)化篩選適合乳酸菌大量生長(zhǎng)的增菌培養(yǎng)基，是實(shí)現(xiàn)我國(guó)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)直投式凍干發(fā)酵劑的關(guān)鍵技術(shù)之一。凍干保護(hù)劑是最為復(fù)雜、最難選擇的關(guān)鍵因素，它不僅影響乳酸菌在凍干過(guò)程中的細(xì)胞存活率，也影響保藏期間的細(xì)胞穩(wěn)定性，其配方及其制備方法屬于商業(yè)機(jī)密。因此，優(yōu)化篩選高效凍干保護(hù)劑是研制開(kāi)發(fā)直投式凍干發(fā)酵劑的關(guān)鍵技術(shù)之二。綜上可見(jiàn)，積極研制開(kāi)發(fā)可替代進(jìn)口產(chǎn)品的具有自主創(chuàng)新的高效濃縮型直投式益生菌大豆酸乳發(fā)酵劑，對(duì)于提高發(fā)酵大豆乳制品產(chǎn)品的質(zhì)量和功能性，推動(dòng)我國(guó)高效濃縮型直投式益生菌發(fā)酵劑產(chǎn)業(yè)化的技術(shù)進(jìn)步，促進(jìn)我國(guó)發(fā)酵大豆乳制品及植物蛋白加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，具有重要意義。申請(qǐng)?zhí)枮?00710156323.X的中國(guó)發(fā)明公開(kāi)了 “一種嗜酸乳桿菌、用該菌種發(fā)酵豆乳的方法及發(fā)酵豆乳飲料”，是將一株嗜酸乳桿菌進(jìn)行豆乳及豆乳飲料的發(fā)酵，但其所用發(fā)酵劑形式為脫脂乳培養(yǎng)的傳統(tǒng)液態(tài)發(fā)酵劑。申請(qǐng)?zhí)枮?00910040265.3的中國(guó)發(fā)明公開(kāi)了“直投式干酪乳桿菌鼠李糖亞種凍干粉的制備方法”，但其所用MRS培養(yǎng)基成分復(fù)雜，制作繁瑣，成本較高；真空干燥時(shí)間需18 20h ;且未明確該菌也是否適用于發(fā)酵大豆酸乳。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鼠李糖乳桿菌大豆酸乳直投式發(fā)酵劑的制備方法，以實(shí)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌直投式發(fā)酵劑的工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。本申請(qǐng)人進(jìn)行了大量新型益生菌的收集、分離篩選工作，對(duì)新型益生菌在大豆乳中的生長(zhǎng)、發(fā)酵特性等進(jìn)行了詳細(xì)研究，發(fā)現(xiàn)來(lái)自于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的鼠李糖乳桿菌ASl.2466，在大豆乳培養(yǎng)基中具有良好的生長(zhǎng)和發(fā)酵特性，培養(yǎng)12小時(shí)活菌數(shù)可達(dá)109cfu/mL，并對(duì)其進(jìn)行了后續(xù)大豆酸乳直投式發(fā)酵劑制備方法的研究。本申請(qǐng)人針對(duì)乳酸菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求苛刻的特點(diǎn)，通過(guò)大量試驗(yàn),選擇價(jià)廉易得的半野生植物一菊芋為原料，研究了菊芋汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備工藝；并以鼠李糖乳桿菌ASl.2466為試驗(yàn)菌株，研究了在菊芋汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加單一營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)鼠李糖乳桿菌細(xì)胞生長(zhǎng)量的影響，進(jìn)一步利用正交試驗(yàn)優(yōu)化篩選出鼠李糖乳桿菌的菊芋汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基；通過(guò)研究接種量、培養(yǎng)溫度、基質(zhì)起始pH值、培養(yǎng)方式等因素對(duì)鼠李糖乳桿菌細(xì)胞生長(zhǎng)量的影響，進(jìn)一步利用正交試驗(yàn)優(yōu)化確定了鼠李糖乳桿菌增殖培養(yǎng)的工藝條件；研究了離心力、離心時(shí)間對(duì)細(xì)胞離心損失率和存活率的影響，確定了最高活菌收得率的最適離心工藝條件；與此同時(shí)，本申請(qǐng)人在大量試驗(yàn)基礎(chǔ)上，研究了不同的復(fù)合保護(hù)劑對(duì)鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響，優(yōu)化篩選出了抗冷凍干燥的復(fù)合保護(hù)劑配方；對(duì)優(yōu)化篩選出的抗冷凍干燥的復(fù)合保護(hù)劑配方制成的鼠李糖乳桿菌凍干粉劑，通過(guò)細(xì)胞加速試驗(yàn)，進(jìn)一步篩選出既抗冷凍干燥又耐貯藏的優(yōu)良復(fù)合保護(hù)劑配方。通過(guò)研究添加復(fù)合保護(hù)劑的鼠李糖乳桿菌菌懸液在冷凍過(guò)程中冷凍速度對(duì)細(xì)胞存活率的影響，確定了合理可行的冷凍干燥工藝；通過(guò)研究鼠李糖乳桿菌凍干發(fā)酵劑在不同封存方式(常壓封存、真空封存)下包裝、在不同溫度(_18°C、4°C)下貯藏的活菌數(shù)和發(fā)酵活力的變化，確定了凍干發(fā)酵劑的保藏條件和保藏期。具體的，本發(fā)明的鼠李糖乳桿菌大豆酸乳直投式發(fā)酵劑的制備方法，包括以下步驟:
(O鼠李糖乳桿菌的增殖培養(yǎng) ①鼠李糖乳桿菌廉價(jià)增菌培養(yǎng)基的制備
a.鼠李糖乳桿菌菊芋汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備 原料:菊芋，蒸餾水；
制備工藝:(a)菊芋清洗、稱重；(b)原料菊芋與水的質(zhì)量體積比為1:1 ; (C)加熱滅酶:加熱至100°C，煮沸5min ； (d)加水搗碎:補(bǔ)加適量80°C熱水，在搗碎機(jī)中將菊芋和水搗碎成漿狀；(e)過(guò)濾:用100目濾布擠壓過(guò)濾；(f)濾渣加水壓榨:濾渣補(bǔ)加適量80°C熱水?dāng)D壓過(guò)濾；(g)濾汁混合定容:將兩次過(guò)濾的濾汁混合，用蒸餾水定容至Ikg菊芋生產(chǎn)IL汁(定義為100%的菊芋汁)；(h)調(diào)配:加熱濃縮至含糖量為10% ;用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，備用；
b.鼠李糖乳桿菌復(fù)合增菌培養(yǎng)基的制備
原料配比:鼠李糖乳桿菌菊芋汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基IOOmL,牛肉膏0.3 0.6g，蛋白胨0.3
0.5g,大豆蛋白胨0.3 0.6g,玉米衆(zhòng)0.2 0.4g,甘油0.1mL, pH6.5 7.0 ;
制備工藝:在菊芋汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加牛肉膏、蛋白胨、大豆蛋白胨、玉米漿、甘油，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.5 7.0，121°C、15min滅菌冷卻備用；
②鼠李糖乳桿菌增殖培養(yǎng)
鼠李糖乳桿菌ASl.2466經(jīng)MRS (Man Rogosa Sharpe)液體培養(yǎng)基活化后，以0.1%
0.5% (約I X 106cfu/mL 5X106cfu/mL)接種量接入pH值為6.5 7.0的菊芋汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基中，在有氧條件下35 37°C培養(yǎng)16h 18h至對(duì)數(shù)末期或穩(wěn)定初期，活菌數(shù)可達(dá)4 5X 109cfu/mL，獲得鼠李糖乳桿菌的高濃度培養(yǎng)物；
(2)鼠李糖乳桿菌細(xì)胞的濃縮分離
將鼠李糖乳桿菌高濃度培養(yǎng)物在常溫下5000 7500r/min(2550g 5738g)離心10 20min進(jìn)行細(xì)胞濃縮分離，離心后棄去上清液，獲得活菌收得率為高于95%的鼠李糖乳桿菌濃縮細(xì)胞；
(3)在鼠李糖乳桿菌濃縮細(xì)胞中添加復(fù)合保護(hù)劑
復(fù)合保護(hù)劑配方:蒸懼水IOOmL,脫脂乳粉IOg,乳糖3 4g,鹿糖3 4g,吐溫80 I
1.2g，甘油0.1 0.2g，酵母粉I 1.2g，血清0.8 L Ig,維生素E 0.3 0.6g，pH值
6.8 7.0，過(guò)濾或加熱除菌即可；
復(fù)合保護(hù)劑制備工藝:①在蒸餾水中添加脫脂乳粉、乳糖、蔗糖、吐溫80、甘油、酵母粉，加熱溶解混勻，冷卻至室溫；②用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8 7.0 ;③112 115°C滅菌lOmin，冷卻至室溫；④無(wú)菌條件下加入經(jīng)過(guò)濾除菌后的血清和維生素E，混勻即可；復(fù)合保護(hù)劑添加工藝:在鼠李糖乳桿菌濃縮細(xì)胞中添加菌株高濃度培養(yǎng)物體積20 30%的復(fù)合保護(hù)劑，制成鼠李糖乳桿菌菌懸液，混勻；
(4)鼠李糖乳桿菌直投式發(fā)酵劑的凍干工藝
將添加了保護(hù)劑的鼠李糖乳桿菌菌懸液分裝于凍干盤(pán)或瓶?jī)?nèi)，厚度0.75cm，-20°C冷凍12h ;在冷凍干燥機(jī)中于真空度3 lOPa、冷阱溫度-55 _45°C下真空冷凍干燥11 13h，制成鼠李糖乳桿菌凍干發(fā)酵劑成品，凍干發(fā)酵劑的活菌數(shù)可達(dá)lX10ncfu/g以上、含水量為2 3% ο本發(fā)明取得的有益效果如下:
1.本發(fā)明制備的鼠李糖乳桿菌大豆酸乳直投式發(fā)酵劑，其活菌含量可達(dá)lX10ncfU/g以上；常壓封存、4°C下保藏I年，其活菌含量仍在101(lCfU/g以上，仍保持較高的發(fā)酵活力。2.本發(fā)明制備的鼠李糖乳桿菌大豆酸乳直投式發(fā)酵劑，可作為生產(chǎn)大豆酸乳的直投式發(fā)酵劑使用，接種量較傳統(tǒng)培養(yǎng)型發(fā)酵劑降低10000 100000倍，在工業(yè)生產(chǎn)中省略了發(fā)酵劑的制備工序，減少了菌種車(chē)間的投資和空間，防止了菌種的退化和污染，可提高發(fā)酵乳制品工業(yè)和植物蛋白加工產(chǎn)業(yè)的勞動(dòng)生產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量。3.本發(fā)明制備的鼠李糖乳桿菌大豆酸乳直投式發(fā)酵劑，以萬(wàn)分之一以下的接種量進(jìn)行37°C大豆酸奶發(fā)酵，4 5h即可凝乳，其發(fā)酵的大豆酸奶制品，酸度達(dá)到70 80 °T、pH值為4.6左右，感官風(fēng)味好?？捎糜诎l(fā)酵乳制品工業(yè)和植物蛋白加工產(chǎn)業(yè)。
圖1為實(shí)施例1、2、3制備的鼠李糖乳桿菌大豆酸乳直投式發(fā)酵劑常壓封存后在4°C和-18°C條件下貯藏I年的活菌數(shù)變化。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1 一種鼠李糖乳桿菌大豆酸乳直投式發(fā)酵劑的制備方法，該方法是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)的:
(O鼠李糖乳桿菌的增殖培養(yǎng)
①鼠李糖乳桿菌廉價(jià)增菌培養(yǎng)基的制備
a.鼠李糖乳桿菌菊芋汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備 原料配比:菊芋，蒸餾水；
制備工藝:(a)菊芋清洗、稱重；(b)料水的質(zhì)量體積比為1:1 ;(c)加熱滅酶:加熱至100°C，煮沸5min ； (d)加水搗碎:補(bǔ)加適量80°C熱水，在搗碎機(jī)中將菊芋和水搗碎成漿狀；(e)過(guò)濾:用100目濾布擠壓過(guò)濾；(f)濾渣加水壓榨:濾渣補(bǔ)加適量80°C熱水?dāng)D壓過(guò)濾；
(g)混合濾汁定容:將兩次過(guò)濾的濾汁混合，用蒸餾水定容至Ikg菊芋生產(chǎn)IL汁(定義為100%的菊芋汁)；(h)調(diào)配:加熱濃縮至含糖量為10%左右；用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0左右；
b.鼠李糖乳桿菌復(fù)合增菌培養(yǎng)基的制備
原料配比:鼠李糖乳桿菌菊芋汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基IOOmL,牛肉膏0.6g，蛋白胨0.3g，大豆蛋白胨 0.3g,玉米衆(zhòng) 0.4g,甘油 0.1mL, pH6.5 7.0 ;
制備工藝:在IOOmL菊芋汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加牛肉膏0.6g、蛋白胨0.3g、大豆蛋白胨
0.3g、玉米漿0.4g、甘油0.1mL,用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.5 7.0,121。。15min滅菌冷卻備用；
②鼠李糖乳桿菌增殖培養(yǎng)的工藝條件
鼠李糖乳桿菌經(jīng)MRS液體培養(yǎng)基活化后，以0.5% (約5X 106cfu/mL)接種量接入pH值為6.5 7.0的菊芋汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基中，在有氧條件下37°C培養(yǎng)16h至對(duì)數(shù)末期或穩(wěn)定初期，活菌數(shù)可達(dá)4.1 X 109cfu/mL,獲得鼠李糖乳桿菌的高濃度培養(yǎng)物；
(2)鼠李糖乳桿菌細(xì)胞的濃縮分離
鼠李糖乳桿菌高濃度培養(yǎng)物采用在常溫下7500r/min (5738g)離心10 20min進(jìn)行細(xì)胞濃縮分離，離心后棄去上清液，獲得活菌收得率為95.08%的鼠李糖乳桿菌濃縮細(xì)胞；
(3)在鼠李糖乳桿菌濃縮細(xì)胞中添加復(fù)合保護(hù)劑
復(fù)合保護(hù)劑配方:蒸懼水IOOmL,脫脂乳粉IOg,乳糖3g,鹿糖4g,吐溫80 1.2g,甘油0.2g，酵母粉1.0g,血清0.8g，維生素E 0.6g，pH值6.8 7.0，過(guò)濾或加熱除菌即可；
復(fù)合保護(hù)劑配方的制備工藝:①在IOOmL蒸餾水中添加脫脂乳粉10g，乳糖3g，蔗糖4g，吐溫801.2g，甘油0.2g，酵母粉1.0g,加熱溶解混均，冷卻至室溫；②用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8 7.0 ;③112 115°C滅菌lOmin，冷卻至室溫；@采用無(wú)菌操作加入經(jīng)過(guò)過(guò)濾除菌后的血清0.Sg和維生素E 0.6g，混勻即可；
在鼠李糖乳桿菌濃縮細(xì)胞中添加復(fù)合保護(hù)劑工藝:在鼠李糖乳桿菌濃縮細(xì)胞中添加菌株高濃度培養(yǎng)物體積30%的復(fù)合保護(hù)劑，制成鼠李糖乳桿菌菌懸液，混勻；
(4)鼠李糖乳桿菌直投式發(fā)酵劑的凍干工藝
將添加保護(hù)劑的鼠李糖乳桿菌菌懸液分裝凍干盤(pán)/瓶，厚度0.75cm，-20°C冷凍12h ;在冷凍干燥機(jī)中于真空度3 lOPa、冷阱溫度-55 _45°C下真空冷凍干燥13h，制成鼠李糖乳桿菌凍干發(fā)酵劑。凍干發(fā)酵劑的活菌數(shù)可達(dá)1.llX10ncfu/g以上、含水量為2.0%。實(shí)施例2 —種鼠李糖乳桿菌大豆酸乳直投式發(fā)酵劑的制備方法，該方法是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)的:
(O鼠李糖乳桿菌的增殖培養(yǎng)
①鼠李糖乳桿菌廉價(jià)增菌培養(yǎng)基的制備
a.鼠李糖乳桿菌菊芋汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基的原料配比和制備工藝同實(shí)施例1.b.鼠李糖乳桿菌復(fù)合增菌培養(yǎng)基的制備
原料配比:鼠李糖乳桿菌菊芋汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基IOOmL,牛肉膏0.5g，蛋白胨0.5g，大豆蛋白胨 0.5g,玉米衆(zhòng) 0.3g,甘油 0.1mL, pH6.5 7.0 ;
制備工藝:在IOOmL菊芋汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加牛肉膏0.5g、蛋白胨0.5g、大豆蛋白胨0.5g、玉米衆(zhòng)0.3g、甘油0.1mL,用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.5 7.0,121°C 15min滅菌冷卻備用；
②鼠李糖乳桿菌增殖培養(yǎng)的工藝條件
鼠李糖乳桿菌經(jīng)MRS液體培養(yǎng)基活化后，以0.1% (約5X 106cfu/mL)接種量接入pH值為6.5 7.0的菊芋汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基中，在有氧條件下35°C培養(yǎng)18h至對(duì)數(shù)末期或穩(wěn)定初期，活菌數(shù)可達(dá)4.5X109cfu/mL,獲得鼠李糖乳桿菌的高濃度培養(yǎng)物；
(2)鼠李糖乳桿菌細(xì)胞的濃縮分離
鼠李糖乳桿菌高濃度培養(yǎng)物采用在常溫下5000r/min (2550g)離心20min進(jìn)行細(xì)胞濃縮分離，離心后棄去上清液，獲得活菌收得率為97.58%的鼠李糖乳桿菌濃縮細(xì)胞；
(3)在鼠李糖乳桿菌濃縮細(xì)胞中添加復(fù)合保護(hù)劑
復(fù)合保護(hù)劑配方:蒸懼水IOOmL,脫脂乳粉IOg,乳糖3g,鹿糖3g,吐溫80 1.0g,甘油0.1g,酵母粉1.0g,血清1.0g,維生素E 0.6g，pH值6.8 7.0，過(guò)濾或加熱除菌即可；
復(fù)合保護(hù)劑配方的制備工藝:①在IOOmL蒸餾水中添加脫脂乳粉10g，乳糖3g，蔗糖3g，吐溫80 1.0g,甘油0.1g,酵母粉1.0g,加熱溶解混均，冷卻至室溫；②用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8 7.0 ;③112 115°C滅菌lOmin，冷卻至室溫；@采用無(wú)菌操作加入經(jīng)過(guò)過(guò)濾除菌后的血清1.0g和維生素E 0.5g，混勻即可；在鼠李糖乳桿菌濃縮細(xì)胞中添加復(fù)合保護(hù)劑工藝:在鼠李糖乳桿菌濃縮細(xì)胞中添加菌株高濃度培養(yǎng)物體積20%的復(fù)合保護(hù)劑，制成鼠李糖乳桿菌菌懸液，混勻；
(4)鼠李糖乳桿菌直投式發(fā)酵劑的凍干工藝
將添加保護(hù)劑的鼠李糖乳桿菌菌懸液分裝凍干盤(pán)/瓶，厚度0.75cm，-20°C冷凍12h ;在冷凍干燥機(jī)中于真空度3 lOPa、冷阱溫度-55 _45°C下真空冷凍干燥12h，制成鼠李糖乳桿菌凍干發(fā)酵劑。凍干發(fā)酵劑的活菌數(shù)可達(dá)1.42X10ncfu/g以上、含水量為2.3%。實(shí)施例3 —種鼠李糖乳桿菌大豆酸乳直投式發(fā)酵劑的制備方法，該方法是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)的:
(O鼠李糖乳桿菌的增殖培養(yǎng)
①鼠李糖乳桿菌廉價(jià)增菌培養(yǎng)基的制備
a.鼠李糖乳桿菌菊芋汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基的原料配比和制備工藝同實(shí)施例1.b.鼠李糖乳桿菌復(fù)合增菌培養(yǎng)基的制備
原料配比:鼠李糖乳桿菌菊芋汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基IOOmL,牛肉膏0.3g，蛋白胨0.5g，大豆蛋白胨 0.3g,玉米衆(zhòng) 0.4g,甘油 0.1mL, pH6.5 7.0 ;
制備工藝:在IOOmL菊芋汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加牛肉膏0.3g、蛋白胨0.5g、大豆蛋白胨
0.3g、玉米漿0.4g、甘油0.1mL,用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.5 7.0,121°C 15min滅菌冷卻備用；
②鼠李糖乳桿菌增殖培養(yǎng)的工藝條件
鼠李糖乳桿菌經(jīng)MRS液 體培養(yǎng)基活化后，以0.3% (約5X 106cfu/mL)接種量接入pH值為6.5 7.0的菊芋汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基中，在有氧條件下37°C培養(yǎng)17h至對(duì)數(shù)末期或穩(wěn)定初期，活菌數(shù)可達(dá)4.2X109cfu/mL,獲得鼠李糖乳桿菌的高濃度培養(yǎng)物；
(2)鼠李糖乳桿菌細(xì)胞的濃縮分離
鼠李糖乳桿菌高濃度培養(yǎng)物采用在常溫下6000r/min (3672g)離心15min進(jìn)行細(xì)胞濃縮分離，離心后棄去上清液，獲得活菌收得率為96.14%的鼠李糖乳桿菌濃縮細(xì)胞；
(3)在鼠李糖乳桿菌濃縮細(xì)胞中添加復(fù)合保護(hù)劑
復(fù)合保護(hù)劑配方:蒸懼水IOOmL,脫脂乳粉IOg,乳糖4g,鹿糖3g,吐溫80 1.1g,甘油
0.1g,酵母粉1.0g,血清1.1g,維生素E 0.3g, pH值6.8 7.0,過(guò)濾或加熱除菌即可；復(fù)合保護(hù)劑配方的制備工藝:①在IOOmL蒸餾水中添加脫脂乳粉10g，乳糖4g，蔗糖3g，吐溫80 1.1g,甘油0.1g,酵母粉1.0g,加熱溶解混均，冷卻至室溫；②用NaOH溶液調(diào)節(jié) !1值至6.8 7.0;@1151:滅菌101^11，冷卻至室溫；@采用無(wú)菌操作加入經(jīng)過(guò)過(guò)濾除菌后的血清1.1g和維生素E 0.3g，混勻即可；
在鼠李糖乳桿菌濃縮細(xì)胞中添加復(fù)合保護(hù)劑工藝:在鼠李糖乳桿菌濃縮細(xì)胞中添加菌株高濃度培養(yǎng)物體積25%的復(fù)合保護(hù)劑，制成鼠李糖乳桿菌菌懸液，混勻；
(4)鼠李糖乳桿菌直投式發(fā)酵劑的凍干工藝
將添加保護(hù)劑的鼠李糖乳桿菌菌懸液分裝凍干盤(pán)/瓶，厚度0.75cm，-20°C冷凍12h ;在冷凍干燥機(jī)中于真空度3 lOPa、冷阱溫度-55 _45°C下真空冷凍干燥llh，制成鼠李糖乳桿菌凍干發(fā)酵劑。凍干發(fā)酵劑的活菌數(shù)可達(dá)1.17X10ncfu/g以上、含水量為2.7%。表I
權(quán)利要求
1.一種鼠李糖乳桿菌大豆酸乳直投式發(fā)酵劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)鼠李糖乳桿菌的增殖培養(yǎng) ①鼠李糖乳桿菌廉價(jià)增菌培養(yǎng)基的制備 a.鼠李糖乳桿菌菊芋汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備 原料:菊芋，蒸餾水； 制備工藝:(a)菊芋清洗、稱重；(b)原料菊芋與水的質(zhì)量體積比為1:1 ; (C)加熱滅酶:加熱至100°C，煮沸5min ； (d)加水搗碎:補(bǔ)加適量80°C熱水，在搗碎機(jī)中將菊芋和水搗碎成漿狀；(e)過(guò)濾:用100目濾布擠壓過(guò)濾；(f)濾渣加水壓榨:濾渣補(bǔ)加適量80°C熱水?dāng)D壓過(guò)濾；(g)濾汁混合定容:將兩次過(guò)濾的濾汁混合，用蒸餾水定容至Ikg菊芋生產(chǎn)IL汁；(h)調(diào)配:加熱濃縮至含糖量為10% ;用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，備用； b.鼠李糖乳桿菌復(fù)合增菌培養(yǎng)基的制備 原料配比:鼠李糖乳桿菌菊芋汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基IOOmL,牛肉膏0.3 0.6g，蛋白胨0.3 .0.5g,大豆蛋白胨0.3 0.6g,玉米衆(zhòng)0.2 0.4g,甘油0.1mL, pH6.5 7.0 ; 制備工藝:在菊芋汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加牛肉膏、蛋白胨、大豆蛋白胨、玉米漿、甘油，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.5 7.0，121 °C、15min滅菌冷卻，備用； ②鼠李糖乳桿菌增殖培養(yǎng) 鼠李糖乳桿菌ASl.2466經(jīng)MRS液體培養(yǎng)基活化后，以0.1% 0.5%接種量接入pH值為6.5 7.0的菊芋汁復(fù)合增菌培養(yǎng)基中，在有氧條件下35 37°C培養(yǎng)16h 18h至對(duì)數(shù)末期或穩(wěn)定初期，獲得鼠李糖乳桿菌的高濃度培養(yǎng)物； (2)鼠李糖乳桿菌細(xì)胞的濃縮分離 將鼠李糖乳桿菌高濃度培養(yǎng)物在常溫下5000 7500r/min離心10 20min進(jìn)行細(xì)胞濃縮分離，離心后棄去上清液，獲得活菌收得率為高于95%的鼠李糖乳桿菌濃縮細(xì)胞； (3)在鼠李糖乳桿菌濃縮細(xì)胞中添加復(fù)合保護(hù)劑 復(fù)合保護(hù)劑配方:蒸懼水IOOmL,脫脂乳粉IOg,乳糖3 4g,鹿糖3 4g,吐溫80 I .1.2g，甘油0.1 0.2g，酵母粉I 1.2g，血清0.8 L Ig,維生素E 0.3 0.6g，pH值.6.8 7.0，過(guò)濾或加熱除菌； 復(fù)合保護(hù)劑制備工藝:①在蒸餾水中添加脫脂乳粉、乳糖、蔗糖、吐溫80、甘油、酵母粉，加熱溶解混勻，冷卻至室溫；②用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8 7.0 ;③112 115°C滅菌lOmin，冷卻至室溫；④無(wú)菌條件下加入經(jīng)過(guò)濾除菌后的血清和維生素E，混勻； 復(fù)合保護(hù)劑添加工藝:在鼠李糖乳桿菌濃縮細(xì)胞中添加菌株高濃度培養(yǎng)物20 30%的復(fù)合保護(hù)劑，制成鼠李糖乳桿菌菌懸液，混勻； (4)鼠李糖乳桿菌直投式發(fā)酵劑的凍干工藝 將添加了保護(hù)劑的鼠李糖乳桿菌菌懸液分裝于凍干盤(pán)或瓶?jī)?nèi)，厚度0.75cm，-20°C冷凍12h ;在冷凍干燥機(jī)中于真空度3 10Pa、冷阱溫度-55 _45°C下真空冷凍干燥11 13h，制成鼠李糖乳桿菌大豆酸乳直投式發(fā)酵劑成品。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種鼠李糖乳桿菌大豆酸乳直投式發(fā)酵劑的制備方法。鼠李糖乳桿菌經(jīng)廉價(jià)增菌培養(yǎng)基高密度培養(yǎng)、離心濃縮分離、與高效復(fù)合保護(hù)劑混溶、再經(jīng)冷凍干燥，制成鼠李糖乳桿菌直投式凍干發(fā)酵劑。所制備的發(fā)酵劑的活菌含量可達(dá)1×1011cfu/g以上；常壓封存、4℃下保藏1年，其活菌含量仍在1010cfu/g以上，仍保持較高的發(fā)酵活力；以萬(wàn)分之一以下的接種量進(jìn)行37℃大豆酸乳發(fā)酵，4～5h即可凝乳，其發(fā)酵的大豆酸奶制品，酸度達(dá)到70～80oT、pH值為4.6左右，感官風(fēng)味好。本發(fā)明可用于發(fā)酵乳制品工業(yè)和植物蛋白加工產(chǎn)業(yè)。
文檔編號(hào)A23C11/10GK103141722SQ201310079280
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月13日
發(fā)明者田洪濤, 谷新晰, 李晨, 楊雪聰, 田晶晶, 李麗微, 檀建新, 王羽 申請(qǐng)人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)