專利名稱：一種篩選水產(chǎn)源氣單胞菌的簡(jiǎn)便方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一種篩選水產(chǎn)源氣單胞菌的簡(jiǎn)便方法。
背景技術(shù)：
:氣單胞菌屬于氣單胞菌科，廣泛分布在水環(huán)境，也常在人體、水產(chǎn)動(dòng)物和食物中檢出。水產(chǎn)動(dòng)物源氣單胞菌主要有嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌等，同時(shí)也是常見(jiàn)的人魚(yú)共患病原菌，能引起人的食物中毒、腹瀉、敗血癥等。氣單胞菌具有廣泛的致病性，在高溫季節(jié)，容易單獨(dú)或者混合感染包括魚(yú)蝦類、貝類、爬行兩棲類等多種水產(chǎn)動(dòng)物，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中一種危害性較高的病原菌，容易引起水生動(dòng)物多種細(xì)菌病的暴發(fā)，且危害程度高于其它細(xì)菌性疾病，成為我國(guó)淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要威脅(唐江芳，氣單胞菌及其在水產(chǎn)中的危害，2007)。而臨床上的盲目用藥，使病原菌在大范圍藥物選擇壓力下，漸漸保留了氣單胞菌耐藥菌株，甚至是多重耐藥菌株，致使抗生素療效下降(蔡麗娟，等，水產(chǎn)致病性嗜水氣單胞菌耐藥性比較與分析，水產(chǎn)科學(xué)，2011)。這不僅導(dǎo)致藥物對(duì)水生動(dòng)物疾病的防控能力大大減弱，同時(shí)也嚴(yán)重影響水產(chǎn)動(dòng)物源性食品的質(zhì)量安全，還存在將耐藥性傳播給人類致病菌的潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此，監(jiān)測(cè)養(yǎng)殖動(dòng)物和養(yǎng)殖水體中氣單胞菌的存在及其耐藥性是防治相關(guān)水產(chǎn)動(dòng)物疾病和保證食品安全的重要措施，而如何高效簡(jiǎn)便的篩選出氣單胞菌是目前最需解決的問(wèn)題。目前篩選氣單胞菌的技術(shù)有:1、通過(guò)普通培養(yǎng)基培養(yǎng)純化單菌落后利用細(xì)菌快速自動(dòng)鑒定系統(tǒng)進(jìn)行篩選，該法需要昂貴的儀器設(shè)備和技術(shù)熟練的操作人員；2、通過(guò)普通培養(yǎng)基培養(yǎng)純化單菌落后利用核酸的檢測(cè)技術(shù)，包括DNA和PCR技術(shù)(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù))，雖然具有快速、簡(jiǎn)潔和靈敏的特點(diǎn)，但該法需要昂貴的儀器設(shè)備和技術(shù)熟練的操作人員；3、經(jīng)典的生理生化鑒定方法，該法不僅繁瑣、耗時(shí)，且要求操作人員有良好的專業(yè)素質(zhì)。4、目前也有些商品化的氣單胞菌培養(yǎng)基，如RS培養(yǎng)基、AHM培養(yǎng)基和APM培養(yǎng)基等，但分離率和準(zhǔn)確率不高(凌紅麗，等，嗜水氣單胞菌選擇性培養(yǎng)基鑒別效果的比較，1998)。 發(fā)明內(nèi)容:本發(fā)明的目的是提供一種篩選水產(chǎn)源氣單胞菌的簡(jiǎn)便方法，利用該方法能夠簡(jiǎn)便分離出水產(chǎn)源氣單胞菌，且成本低，準(zhǔn)確率高，不需特殊儀器，為篩選分離水產(chǎn)源氣單胞菌提供了極大的方便。本發(fā)明的非疾病診斷和治療目的的篩選水產(chǎn)源氣單胞菌的簡(jiǎn)便方法，其特征在于，將待檢測(cè)樣品在無(wú)鹽堿性蛋白胨水中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為水產(chǎn)源氣單胞菌的常規(guī)培養(yǎng)條件；然后將增菌液接種到RS培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為水產(chǎn)源氣單胞菌的常規(guī)培養(yǎng)條件，如若在RS培養(yǎng)基平板上呈黃色且光滑的菌落，則為氣單胞菌疑似菌；將氣單胞菌疑似菌接種至胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為水產(chǎn)源氣單胞菌的常規(guī)培養(yǎng)條件，再測(cè)試培養(yǎng)好的菌落的氧化酶活性；如果菌落能夠在無(wú)鹽堿性蛋白胨水中生長(zhǎng)良好，且菌落在RS培養(yǎng)基平板上呈黃色且光滑，氧化酶試驗(yàn)呈陽(yáng)性，則判斷菌落為水產(chǎn)源氣單胞菌，則待檢測(cè)樣品中含有水產(chǎn)源氣單胞菌。本發(fā)明的待檢測(cè)樣品可以為底泥、環(huán)境水樣或者動(dòng)物的組織樣品，當(dāng)是底泥的時(shí)候，可以取3g底泥加入到2ml的無(wú)菌水中混勻并靜止IOmin后取100 μ L上層液體，接種到3ml無(wú)鹽堿性蛋白胨水中進(jìn)行增菌培養(yǎng)；當(dāng)是環(huán)境水樣的時(shí)候，可以取100 μ L水樣，接種到3ml無(wú)鹽堿性蛋白胨水中進(jìn)行增菌培養(yǎng)；當(dāng)是動(dòng)物組織樣品的時(shí)候，如是動(dòng)物的鰓、肝臟或病灶，可以取綠豆大小的動(dòng)物組織接種于3ml無(wú)鹽堿性蛋白胨水中進(jìn)行增菌培養(yǎng)。所述的水產(chǎn)源氣單胞菌的常規(guī)培養(yǎng)條件優(yōu)選，當(dāng)在無(wú)鹽堿性蛋白胨水中進(jìn)行增菌培養(yǎng)時(shí)，其為28°C振蕩培養(yǎng)18 20h，當(dāng)在RS培養(yǎng)基平板或胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，其為28°C靜置培養(yǎng)18 20h。測(cè)試菌落的氧化酶活性，可以將菌落劃線于氧化酶試紙上，Imin內(nèi)觀察，若劃線處呈紫色或紫紅色，則為氧化酶陽(yáng)性，如果不是，則氧化酶陰性。本發(fā)明的無(wú)鹽堿性蛋白胨水、RS培養(yǎng)基和胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基都是現(xiàn)有技術(shù)中已知的培養(yǎng)基，可以從試劑公司購(gòu)買到。本發(fā)明是在研究分析現(xiàn)有選擇性培養(yǎng)基特性和氣單胞菌不同生理生化特性的基礎(chǔ)上建立的。通過(guò)增加一個(gè)用無(wú)鹽堿性蛋白胨水將嗜鹽嗜酸性細(xì)菌排除掉，初篩后的細(xì)菌經(jīng)RS培養(yǎng)基培養(yǎng)和氧化酶試驗(yàn)后，如果細(xì)菌在無(wú)鹽堿性蛋白胨水生長(zhǎng)，并在RS培養(yǎng)基上呈黃色且光滑，氧化酶試驗(yàn)呈陽(yáng)性，則可判斷該細(xì)菌為水產(chǎn)源氣單胞菌。利用該方法能簡(jiǎn)便分離出水產(chǎn)源氣單胞菌，且成本低，不需特殊儀器，為篩選分離水產(chǎn)源氣單胞菌提供了極大的方便。
具體實(shí)施方式
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以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。無(wú)菌水:將去離子水121°C高壓滅菌15min，置冰箱4°C保存?zhèn)溆?。無(wú)鹽堿性蛋白胨水,配方:每升含有蛋白胨20g,硝酸鉀0.1g,結(jié)晶碳酸鈉0.2g,蒸餾水1000ml，將蛋白胨、硝酸鉀、結(jié)晶碳酸鈉稱量好之后，使其溶于IOOOml蒸餾水中，121°C高壓滅菌15min，或從試劑公司購(gòu)買，按照其說(shuō)明書(shū)配制，4°C保存?zhèn)溆?。胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基,配方:每升含有胰蛋白胨15g，植物蛋白胨5g，氯化鈉5g,瓊脂15g，蒸餾水1000ml，將胰蛋白胨，植物蛋白胨,氯化鈉,瓊脂稱量好之后,使其溶于IOOOml蒸餾水中，121°C高壓滅菌15min，或從試劑公司購(gòu)買，按照其說(shuō)明書(shū)配制。然后倒平板，4°C保存?zhèn)溆?。RS培養(yǎng)基，可以從試劑公司購(gòu)買，按照其說(shuō)明書(shū)配制，121°C高壓滅菌15min。然后倒平板，4°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例1:對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分離保存的已鑒定的細(xì)菌進(jìn)行篩選鑒定。實(shí)驗(yàn)步驟:1、打開(kāi)菌株凍干保存管，接種至3ml無(wú)鹽堿性蛋白胨水中進(jìn)行增菌，28°C振蕩培養(yǎng)18 20h，獲得增菌液。2、用接種環(huán)蘸取增菌液，接種于RS培養(yǎng)基平板上，28°C靜置培養(yǎng)18 20h。若菌落在RS培養(yǎng)基平板上呈黃色且光滑，則初步判斷為氣單胞菌疑似菌。3、挑取RS培養(yǎng)基平板上氣單胞菌疑似菌菌落,接種至胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)，28°C靜置培養(yǎng)18 20h，然后將長(zhǎng)出的菌落劃于氧化酶試紙條，Imin內(nèi)觀察，若劃線處呈紫色或者紫紅色，為氧化酶陽(yáng)性，否則則氧化酶陰性。4、結(jié)果記錄若菌株在無(wú)鹽堿性蛋白胨水生長(zhǎng)良好，記為“ + ”，不生長(zhǎng)記為菌落在RS培養(yǎng)基平板上呈黃色且光滑記為“ + ”，不生長(zhǎng)或菌落為綠色或綠黃色記為;氧化酶試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性記為“ + ”，陰性記為三個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為“ + ”則可判斷該試驗(yàn)菌株為水產(chǎn)源氣單胞菌。試驗(yàn)所使用的90株細(xì)菌中，有77株為水產(chǎn)源氣單胞菌，其中嗜水氣單胞菌43株，溫和氣單胞菌5株,維氏氣單胞菌10株,脆弱氣單胞菌3株,豚鼠氣單胞菌6株,簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌3株,中間氣單胞菌I株,A.aquariorum (氣單胞菌屬的國(guó)內(nèi)暫無(wú)譯文的菌株)5株,其他未定種的氣單胞菌屬菌株I株；金黃色葡萄球菌等非水產(chǎn)源氣單胞菌14株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,除了 2株A.aquariorum和I株脆弱氣單胞菌、I株維氏氣單胞菌在無(wú)鹽堿性蛋白胨水不生長(zhǎng)外，其他73株水產(chǎn)源氣單胞菌均能篩選出來(lái)，分離準(zhǔn)確率為94.80% ;其他13株非水產(chǎn)源氣單胞菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均不符合本發(fā)明所判定的水產(chǎn)源氣單胞菌。結(jié)果見(jiàn)表1:表1:實(shí)驗(yàn)室分離保存的已鑒定的細(xì)菌篩選鑒定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種非疾病診斷和治療目的的篩選水產(chǎn)源氣單胞菌的簡(jiǎn)便方法，其特征在于，將待檢測(cè)樣品在無(wú)鹽堿性蛋白胨水中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為水產(chǎn)源氣單胞菌的常規(guī)培養(yǎng)條件；然后將增菌液接種到RS培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為水產(chǎn)源氣單胞菌的常規(guī)培養(yǎng)條件，如若在RS培養(yǎng)基平板上呈黃色且光滑的菌落，則為氣單胞菌疑似菌；將氣單胞菌疑似菌接種至胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為水產(chǎn)源氣單胞菌的常規(guī)培養(yǎng)條件，再測(cè)試培養(yǎng)好的菌落的氧化酶活性； 如果菌落能夠在無(wú)鹽堿性蛋白胨水中生長(zhǎng)良好，且菌落在RS培養(yǎng)基平板上呈黃色且光滑，氧化酶試驗(yàn)呈陽(yáng)性，則判斷菌落為水產(chǎn)源氣單胞菌，則待檢測(cè)樣品中含有水產(chǎn)源氣單胞菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的簡(jiǎn)便方法，其特征在于，所述的待檢測(cè)樣品為底泥、環(huán)境水樣或者動(dòng)物的組織樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的簡(jiǎn)便方法，其特征在于，所述的水產(chǎn)源氣單胞菌的常規(guī)培養(yǎng)條件，當(dāng)在無(wú)鹽堿性蛋白胨水中進(jìn)行增菌培養(yǎng)時(shí)，其為28°C振蕩培養(yǎng)18 20h，當(dāng)在RS培養(yǎng)基平板或胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，其為28°C靜置培養(yǎng)18 20h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的簡(jiǎn)便方法，其特征在于，測(cè)試菌落的氧化酶活性，是將菌落劃線于氧化酶試紙上，Imin內(nèi)觀察，若劃線處呈紫色或紫紅色，則為氧化酶陽(yáng)性，如果不是，則氧化酶陰性。 ·
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種篩選水產(chǎn)源氣單胞菌的簡(jiǎn)便方法。它是將待檢測(cè)樣品在無(wú)鹽堿性蛋白胨水中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為水產(chǎn)源氣單胞菌的常規(guī)培養(yǎng)條件；然后將增菌液接種到RS培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為水產(chǎn)源氣單胞菌的常規(guī)培養(yǎng)條件，如若在RS培養(yǎng)基平板上呈黃色且光滑的菌落，則為氣單胞菌疑似菌；將氣單胞菌疑似菌接種至胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為水產(chǎn)源氣單胞菌的常規(guī)培養(yǎng)條件，再測(cè)試培養(yǎng)好的菌落的氧化酶活性；如果菌落能夠在無(wú)鹽堿性蛋白胨水中生長(zhǎng)良好，且菌落在RS培養(yǎng)基平板上呈黃色且光滑，氧化酶試驗(yàn)呈陽(yáng)性，則判斷菌落為水產(chǎn)源氣單胞菌，則待檢測(cè)樣品中含有水產(chǎn)源氣單胞菌。
文檔編號(hào)C12R1/01GK103194404SQ20131007338
公開(kāi)日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月7日
發(fā)明者鄧玉婷, 吳雅麗, 譚愛(ài)萍, 姜蘭, 羅理, 王偉利, 趙飛, 梁愛(ài)玲 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所