一種海帶內(nèi)生堅強芽孢桿菌蛋白及其在抗腫瘤方面的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種海帶內(nèi)生堅強芽孢桿菌蛋白，按如下步驟制備：取海帶內(nèi)生堅強芽孢桿菌，該菌株在pH=9的蔗糖蛋白胨液體培養(yǎng)基中25℃發(fā)酵6天，所述蔗糖蛋白胨液體培養(yǎng)基中蔗糖和蛋白胨的質(zhì)量所占的百分比分別為5%和1%；在8000r/min條件下離心去除菌體，在上清液中加入硫酸銨，硫酸銨的飽和終濃度為90%，4℃靜置過夜，過濾將沉淀用蒸餾水溶解后，再用截留分子量為3600道爾頓的透析袋透析4天，取透析袋中物冷凍干燥，得海帶內(nèi)生堅強芽孢桿菌蛋白。該蛋白抗腫瘤活性強，制備工藝簡單、成本低廉。
【專利說明】一種海帶內(nèi)生堅強芽孢桿菌蛋白及其在抗腫瘤方面的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種海帶內(nèi)生堅強芽孢桿菌蛋白及其在抗腫瘤方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]海帶QMmirmria Japonica Aresch)是一種在低溫海水中生長的大型海生褐藻植物。它生長于水溫較低的海洋中，分布于中國北部沿海及朝鮮、日本和蘇聯(lián)太平洋地區(qū)沿岸，在中國北部及東南沿海有大量養(yǎng)殖。海帶主要是自然生長，也有人工養(yǎng)殖，多以干制品行銷于市，質(zhì)量以色褐、體短、質(zhì)細而肥厚者為佳。海帶有“長壽菜”、“海上之蔬” “含碘冠
軍”的美譽。
[0003]海帶作為一種重要的海洋資源，其食用與藥用價值早為世人所知。從海帶中提取的有效成分具有降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗HIV和增強免疫功能，對治療心腦血管疾病和中、早期慢性腎衰等均有一定的作用。海帶中還含有一些共附微生物，但這些微生物及其代謝產(chǎn)物迄今未止還沒有被充分利用。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的是提供一種制備工藝簡單、成本低廉的海帶內(nèi)生堅強芽孢桿菌蛋白及其在抗腫瘤方面的應(yīng)用，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0005]本發(fā)明的海帶內(nèi)生堅強芽孢桿菌蛋白，按如下步驟制備:
1)取海帶內(nèi)生堅強芽孢桿菌DNN7(Bacillus firmus DNN7)，該菌株已于2012年12月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號:CGMCCNo: 7076 ；
2)以海帶內(nèi)生堅強芽孢桿菌DNN7為材料，該菌株在pH9的蔗糖蛋白胨液體培養(yǎng)基中25°C發(fā)酵6天，所述蔗糖蛋白胨液體培養(yǎng)基中蔗糖和蛋白胨的質(zhì)量所占的百分比分別為5% 和 1% ；
3)在8000 r/min條件下離心去除菌體，在上清液中加入硫酸銨，硫酸銨的飽和終濃度為90%，4°C靜置過夜，過濾將沉淀用蒸餾水溶解后，再用截留分子量為3600道爾頓的透析袋透析4天，取透析袋中物冷凍干燥，得海帶內(nèi)生堅強芽孢桿菌蛋白。
[0006]本發(fā)明的海帶內(nèi)生堅強芽孢桿菌蛋白在抗腫瘤方面的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的海帶內(nèi)生堅強芽孢桿菌蛋白即從海帶內(nèi)生堅強芽孢桿菌DNN7菌株的發(fā)酵液中所提取的抗腫瘤活性蛋白，具有抑制肝癌細胞HePG2、乳腺癌細胞MDA-MB-231、白血病細胞K562和神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y多種腫瘤細胞的活性，抗腫瘤活性強，并可促進腫瘤細胞NO的產(chǎn)生，并對海蝦無節(jié)幼體具有一定毒性，可應(yīng)用于制備抗腫瘤藥品，具有產(chǎn)業(yè)價值。本發(fā)明的制備工藝簡單、成本低廉。
[0008]本發(fā)明中的海帶內(nèi)生堅強芽孢桿菌菌株已于2012年12月31日保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號:CGMCC No: 7076【專利附圖】
【附圖說明】
[0009]圖1是本發(fā)明的蛋白對白血病細胞K562的影響示意圖；
圖2是本發(fā)明的蛋白對乳腺癌細胞MDA-MB-231的影響示意圖。
【具體實施方式】
[0010]本發(fā)明實施例依次按如下步驟進行:
a.將剛打撈的新鮮海帶，在超凈工作臺內(nèi)用無菌水清洗5遍后，再用75%酒精漂洗30-90s (30s 一個梯度)，無菌水沖洗；0.1%氯化汞漂洗6-18s (6s 一個梯度)，無菌水沖洗多次。將不同滅菌時間梯度的海帶片都分成兩份，一份用滅菌研缽研碎后接種到培養(yǎng)皿上作為實驗組，另一份直接放入空白培養(yǎng)基做對照組。倒置于37°C溫室中培養(yǎng)5~14天，觀察選取較好的實驗條件，即選擇實驗組中內(nèi)生菌生長良好，而對照組中無菌落長出的滅菌時間梯度作為海帶表面滅菌條件。海帶表面滅菌充分研磨后，將200 μ L研磨液均勻涂布于牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上，25°C恒溫培養(yǎng)5~7天。 [0011]b.挑取單個形態(tài)各異的菌落反復(fù)劃線培養(yǎng)至出現(xiàn)純菌株，用濾紙片法檢測各純菌株的抑菌活性作為初步篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到活性菌株DNN7，該菌株已于2012年12月31日保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號:CGMCC No: 7076。
[0012]通過耐鹽性試驗、對溶菌酶抗性試驗、V.P實驗、苯丙氨酸、丙二酸鹽實驗、檸檬酸鹽利用、產(chǎn)糊精結(jié)晶、油脂水解、淀粉水解、二羥丙酮的形成、過氧化氫酶、酪氨酸水解、產(chǎn)硫化氫、明膠水解、對溶菌酶抗性、石蕊牛乳實驗、糖發(fā)酵、硝酸鹽還原、產(chǎn)生吲哚、動力實驗、卵磷脂酶、甲基紅實驗、酪素水解等生理生化試驗將其鑒定到種，該活性菌株為堅強芽孢桿菌。
[0013]c.以抑菌圈平均直徑為指標(biāo)，優(yōu)化堅強芽孢桿菌DNN7的次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的較佳條件，結(jié)果表明較佳培養(yǎng)條件為在PH 9的蔗糖蛋白胨液體培養(yǎng)基中25°C發(fā)酵6天，所述蔗糖蛋白胨液體培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比分別為5%和1%。
[0014]d.將上述發(fā)酵液8000 r/min離心去除菌體，在上清液中加入硫酸銨，硫酸銨的飽和終濃度為90%，4°C靜置過夜，過濾，將沉淀用蒸餾水溶解后，再用至少3600道爾頓的透析袋透析4天，取透析袋中物冷凍干燥，SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，冷凍干燥的透析袋中物質(zhì)為蛋白質(zhì)。
[0015]e.取凍干樣品用DMEM溶解，培養(yǎng)腫瘤細胞(肝癌細胞HePG2、乳腺癌細胞MDA-MB-231、白血病細胞K562和神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y，樣品設(shè)定濃度梯度，用MTT法測蛋白作用后腫瘤細胞存活率。具體操作如下:
O抗腫瘤活性的檢測:首先培養(yǎng)腫瘤細胞，將肝癌細胞HePG2、乳腺癌細胞MDA-MB-231、白血病細胞K562和神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y復(fù)蘇到20%的血清培養(yǎng)集中，培養(yǎng)4飛天，接種到六孔板中，換成10%培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞密度達到2*106后接種到96孔板中，每空100 yL，過夜；將蛋白用DMEM溶液溶解，然后用DMEM做梯度稀釋(10、20、30、40、60、80、100、150、200、300 μ g/mL)，將96孔板中培養(yǎng)基棄掉加入蛋白樣品孵育6小時，空白對照只加DMEM。配制MTT，6小時后每空加入10 μ L MTT，孵育4小時，然后將孔內(nèi)液體棄掉，每空加入100 μ L DMSO溶解紫色結(jié)晶，37°C水浴保持20分鐘。然后用酶標(biāo)儀在490nm下測吸光度值進而處理數(shù)據(jù)計算細胞存活率。結(jié)果以對白血病細胞K562的影響和對乳腺癌細胞MDA-MB-231的影響為例作圖(如圖1、圖2所示)。
[0016]實驗結(jié)果表明，該菌株蛋白在低劑量范圍內(nèi)(10 yg/mL)就開始有一定的抑制活性，抑制效果有一定的劑量效應(yīng)，當(dāng)在300 μ g/mL時對肝癌細胞HePG2、乳腺癌細胞MDA-MB-231、白血病細胞K562的抑制率分別為42.9%, 85.7%, 96.47% ;在180 μ g/mL時對神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y的抑制率為70.49%。該蛋白具有作為粉劑或針劑用于抗腫瘤藥物制備的潛力。
[0017]2)海蝦毒性實驗:取本發(fā)明蛋白樣品(8 mg/mL)0.05mL加到3個帶刻度的試管中，再在每試管中加入約4 mL海水和10只健康的海奸無節(jié)幼體,最后用海水加至5 mL ;取3只試管，也加入10只健康的海蝦無節(jié)幼體，再用海水加至5 mL，作為空白對照。24°C置日光燈下，24 h后計數(shù)存活海蝦。每個實驗重復(fù)三次。實驗結(jié)果表明小蝦存活率為5%，而空白對照無一死亡，因此該蛋白具有一定的海蝦毒性活性。海蝦幼蟲曾被許多活性測試系統(tǒng)應(yīng)用，有研究發(fā)現(xiàn)海蝦毒性法和9KB (人鼻咽癌)細胞毒性實驗呈現(xiàn)很好的相關(guān)性(P =01036，kappa = 0156)。細胞毒的ED50 —般是海蝦毒LD50的I/ 10，可用海蝦毒性法代替昂貴而繁雜的體內(nèi)體外抗腫瘤實驗，指導(dǎo)對具細胞毒和3PS ( P388，體內(nèi)老鼠白血病)活性提取物的分離。海蝦毒性法具快速(24h)、便宜和簡單(如不需無菌操作)等優(yōu)點，實驗結(jié)果表明:本發(fā)明實施例所制備的DNN7菌株蛋白質(zhì)有抗腫瘤活性，可應(yīng)用于抗腫瘤藥物的制備。
[0018]3)對神經(jīng)母 細胞瘤NO的影響
腫瘤細胞接種在含有10%小牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)液中，在培養(yǎng)基中加入100國際單位青霉素和鏈霉素，PH7.1，置于37 °C>5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞呈單層生長達到70% -80%密度飽和時，進行傳代，傳代時用0.25%胰酶消化。
[0019]標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0、1、2、5、10、20、40、60、100 ymol/L，酶標(biāo)儀在540nm下測吸光值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的OD54tl值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
實驗分為陰性對照組(未經(jīng)試樣處理的細胞懸液)，實驗組加入不同濃度的蛋白溶液(10，30，90，180和360 μ g/mL)，每個濃度做5個復(fù)孔。取對數(shù)生長期的腫瘤細胞，調(diào)細胞濃度I~3X IO4個/mL，將細胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，每孔100 yL，于飽和濕度37 0C 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細胞完全貼壁后，實驗組加入蛋白溶液150 μ L(對照為無菌水)，飽和濕度37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，每孔取50 μ L上清于新的96孔培養(yǎng)板中，每孔加入50 μ L室溫下Griess Reagent I和Griess Reagent II,在脫色搖床上混勻，用酶標(biāo)儀于540 nm波長處測定各孔的OD值。結(jié)果表明蛋白在180 yg/mL和360 μ g/mL時能明顯增加NO的量，因此該蛋白的抗腫瘤做用至少部分通過NO信號途徑起作用。
【權(quán)利要求】
1.一種海帶內(nèi)生堅強芽孢桿菌蛋白，其特征在于:按如下步驟制備: 1)取海帶內(nèi)生堅強芽孢桿菌DNN7(.Bacillus firmus DNN7)，該菌株已于2013年I月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號:CGMCC No:7076 ； 2)以海帶內(nèi)生堅強芽孢桿菌DNN7為材料，該菌株在pH9的蔗糖蛋白胨液體培養(yǎng)基中25°C發(fā)酵6天，所述蔗糖蛋白胨液體培養(yǎng)基中蔗糖和蛋白胨的質(zhì)量所占的百分比分別為5% 和 1% ； 3)在8000 r/min條件下離心去除菌體，在上清液中加入硫酸銨，硫酸銨的飽和終濃度為90%，4°C靜置過夜，過濾將沉淀用蒸餾水溶解后，再用截留分子量為3600道爾頓的透析袋透析4天，取透析袋中物冷凍干燥 ，得海帶內(nèi)生堅強芽孢桿菌蛋白。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的海帶內(nèi)生堅強芽孢桿菌蛋白在抗腫瘤方面的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/07GK103966284SQ201310034683
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年1月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月30日
【發(fā)明者】張付云, 徐鳳, 楊陽, 王維才, 何云海 申請人:大連海洋大學(xué), 張付云