專利名稱：一種淋病奈瑟菌的轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)微生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種淋病奈瑟菌的轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)感染泌尿生殖系統(tǒng)引起淋病,此病是一種常見的性傳播疾病(Sexual Transmitted Disease, STD)。近年來淋病發(fā)病率居我國性傳播疾病首位，危害十分嚴(yán)重。淋病奈瑟菌經(jīng)性行為傳播，多侵襲泌尿生殖道黏膜，主要引起男性尿道炎、前列腺炎和女性盆腔炎、子宮內(nèi)膜炎等。由于淋病奈瑟菌耐藥性現(xiàn)象的日趨嚴(yán)重，淋病的治療也出現(xiàn)了新的難題。因此，對淋病奈瑟菌感染機(jī)制及疫苗的研究成為預(yù)防和控制淋病流行傳播的重要措施。淋病奈瑟菌(NG)生長較慢，對培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求非常高，常用巧克力(色)血瓊脂培養(yǎng)基，需要在5%C02環(huán)境下才能生長良好。普通轉(zhuǎn)化需要新鮮的液體培養(yǎng)物且不易轉(zhuǎn)化成功。目前尚缺少適宜淋病奈瑟菌的轉(zhuǎn)化方法從而實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)，這在很大程度上限制了對淋病奈瑟菌的研究。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種適合淋病奈瑟菌的轉(zhuǎn)化方法，其中包括制備適宜轉(zhuǎn)化用的淋病奈瑟菌感受態(tài)，探索淋病奈瑟菌的轉(zhuǎn)化條件，實(shí)現(xiàn)外源基因在淋病奈瑟菌中的表達(dá)。本發(fā)明所使用的技術(shù)方案是淋病奈瑟菌分別經(jīng)液體及固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，收集細(xì)菌于離心管中，細(xì)菌經(jīng)洗滌懸浮后制得淋病奈瑟菌感受態(tài)作為轉(zhuǎn)化用受體菌備用；通過電轉(zhuǎn)化方法將原核表達(dá)載體petl-EGFP轉(zhuǎn)入備用的淋病奈瑟菌中，用酶切和PCR方法篩選鑒定重組淋病奈瑟菌(rNG);熒光顯微鏡觀察rNG外源蛋白的表達(dá)情況。rNG經(jīng)固體培養(yǎng)基多次傳代及凍存3、6、9、12月后對其穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià)。構(gòu)建的rNG為進(jìn)一步研究淋病奈瑟菌的感染免疫機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明中淋病奈瑟 菌培養(yǎng)時(shí)，先液體培養(yǎng)，后轉(zhuǎn)為固體培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)到對數(shù)生長期。上述方法中，制備淋病奈瑟菌感受態(tài)是冰浴靜置后用超純水洗滌。上述方法中所述的轉(zhuǎn)化為電轉(zhuǎn)化，細(xì)菌經(jīng)孵育后直接轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)后再涂板。上述原核表達(dá)載體petl-EGFP，其結(jié)構(gòu)是在質(zhì)粒pet_30a的BamHI和HindII雙酶切位點(diǎn)插入EGFP序列。本發(fā)明通過優(yōu)化淋病奈瑟菌的培養(yǎng)條件，制備了淋病奈瑟菌感受態(tài)，建立了淋病奈瑟菌的轉(zhuǎn)化方法，此轉(zhuǎn)化方法簡便易行，獲得的重組菌性質(zhì)穩(wěn)定，為今后淋病奈瑟菌感染機(jī)制和疫苗效果的研究奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，該轉(zhuǎn)化方法的建立進(jìn)一步拓寬了淋病奈瑟菌的研究領(lǐng)域，因而具有廣闊的市場前景。
圖1為熒光顯微鏡下觀察到的表達(dá)EGFP的淋病奈瑟菌圖像。
具體實(shí)施例方式1、電轉(zhuǎn)化用淋病奈瑟菌感受態(tài)的制備淋病奈瑟菌經(jīng)液體及固體培養(yǎng)基每升液體培養(yǎng)基含有哥倫比亞培養(yǎng)基基礎(chǔ)(35g),酵母抽提物(5g),葡萄糖(5g),新胨蛋白胨(2. 5g),氯化血紅素(終濃度O. 015%。)，吐溫-80 (終濃度O. 05%)，吡哆醛(終濃度O. 006%。)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(終濃度
O.015%。)；每升固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入瓊脂粉(終濃度2%)培養(yǎng)到對數(shù)生長期后(先液體培養(yǎng)，后轉(zhuǎn)為固體培養(yǎng))，用O. OlM PBS緩沖液輕輕洗下固體培養(yǎng)基上的細(xì)菌收集于離心管中置于冰浴中。細(xì)菌再經(jīng)預(yù)冷的超純水充分洗滌、懸浮，100 μ I分裝后即用于電轉(zhuǎn)化試驗(yàn)或凍存于_80°C備用。2、電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒petl-EGFP的小量制備根據(jù)EGFP序列設(shè)計(jì)引物，上下游引物序列為cgggatccgtgagcaagggcgaggag(SEQ ID NO.1),cccaagcttcggccgctt tacttgtacag(SEQ IDNO. 2)。引物中分別引入BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)。以質(zhì)粒pEGFP-Nl (Clontech公司)為模板，PCR擴(kuò)增EGFP，經(jīng)TA克隆獲得重組質(zhì)粒T-EGFP。用BamHI和HindIII分別雙酶切質(zhì)粒T-EGFP和pet_30 a (Novagen公司)，將EGFP片段與pet_30a片段連接、轉(zhuǎn)化獲得重組質(zhì)粒 petl-EGFP。取2 μ I的小提質(zhì)粒petl-EGFP加入100 μ I淋病奈瑟菌感受態(tài)細(xì)胞中，混勻靜置后進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。設(shè)置電轉(zhuǎn)化條件(電擊參數(shù)設(shè)置為1.2-1.8kV，25yF)。電轉(zhuǎn)化結(jié)束后將細(xì)菌混合物置于37°C培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng),細(xì)菌培養(yǎng)物經(jīng)離心后涂布于卡那霉素平板靜置培養(yǎng)。取單個(gè)菌落擴(kuò)增和提取質(zhì)粒后用PCR和酶切篩選鑒定重組菌rNG。3、外源蛋白表達(dá)鑒定正確的rNG轉(zhuǎn)接于卡那霉素平板(含終濃度lmmol/L IPTG)，待長出菌苔后通過熒光顯微鏡觀察，可見綠色熒光，如圖1。rNG經(jīng)固體培養(yǎng)基多次傳代后能穩(wěn)定表達(dá)EGFP，經(jīng)凍存3、6、9、12月后仍穩(wěn)定表達(dá)EGFP。表達(dá)菌株提取質(zhì)粒后，酶切和PCR鑒定正確。構(gòu)建的重組菌rNG為研究淋病奈瑟菌的感染免疫機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。淋病奈瑟菌轉(zhuǎn)化方法的建立進(jìn)一步拓寬了淋病奈瑟菌的研究領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1.一種淋病奈瑟菌的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于包括以下步驟淋病奈瑟菌分別經(jīng)液體及固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，收集細(xì)菌于離心管中；細(xì)菌經(jīng)冰浴靜置、充分洗滌和懸浮后制得淋病奈瑟菌感受態(tài)作為轉(zhuǎn)化用受體菌備用；通過電轉(zhuǎn)化方法將原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到上述備用的淋病奈瑟菌感受態(tài)中，用酶切和PCR方法篩選鑒定重組淋病奈瑟菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述淋病奈瑟菌的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于淋病奈瑟菌培養(yǎng)時(shí)，先液體培養(yǎng)，后轉(zhuǎn)為固體培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)到對數(shù)生長期。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述淋病奈瑟菌的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于制備淋病奈瑟菌感受態(tài)是冰浴靜置后用超純水洗滌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述淋病奈瑟菌的轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的轉(zhuǎn)化為電轉(zhuǎn)化，細(xì)菌經(jīng)孵育后直接轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)后再涂板。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)微生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種淋病奈瑟菌的轉(zhuǎn)化方法。該方法是將淋病奈瑟菌分別經(jīng)液體及固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，收集細(xì)菌于離心管中；細(xì)菌經(jīng)冰浴靜置、充分洗滌和懸浮后制得淋病奈瑟菌感受態(tài)作為轉(zhuǎn)化用受體菌備用；通過電轉(zhuǎn)化方法將原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到上述備用的淋病奈瑟菌感受態(tài)中，用酶切和PCR方法篩選鑒定重組淋病奈瑟菌。本發(fā)明通過優(yōu)化淋病奈瑟菌的培養(yǎng)條件，制備了淋病奈瑟菌感受態(tài)，建立了淋病奈瑟菌的轉(zhuǎn)化方法，此轉(zhuǎn)化方法簡便易行，獲得的重組菌性質(zhì)穩(wěn)定，為今后淋病奈瑟菌感染機(jī)制和疫苗效果的研究奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，該轉(zhuǎn)化方法的建立進(jìn)一步拓寬了淋病奈瑟菌的研究領(lǐng)域。
文檔編號C12R1/36GK103060363SQ201310031718
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月28日
發(fā)明者焦紅梅, 賀麗, 陳瑾, 李國才, 陳紅菊, 潘興元, 田芳, 季明春 申請人:揚(yáng)州大學(xué)