專利名稱：高水平人二倍體細(xì)胞培養(yǎng)水痘-帶狀皰疹疫苗病毒方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高水平人二倍體細(xì)胞培養(yǎng)水痘-帶狀皰疹疫苗病毒方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有水痘-帶狀皰疹病毒疫苗生產(chǎn)產(chǎn)量低，不能適用于規(guī)?；a(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可以得到較高的減毒水痘-帶狀皰疹病毒疫苗產(chǎn)量，便于帶狀皰疹疫苗的大量制備，適用于規(guī)?；a(chǎn)的高水平人二倍體細(xì)胞培養(yǎng)水痘-帶狀皰疹疫苗病毒方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:
一種高水平人二倍體細(xì)胞培養(yǎng)水痘-帶狀皰疹疫苗病毒方法，其特征是:包括下列步
驟:
(I)建立主體細(xì)胞庫(MCB)，按照美國FDA標(biāo)準(zhǔn)(21CFR211和21CFR600)。取ATCC(CCL171)細(xì)胞株(來自美國權(quán)威的細(xì)胞保存機(jī)構(gòu)ATCC，細(xì)胞株由美國FDA專門指定，交由美國ATCC管理)，起始為第17代，經(jīng)過20天左右共3-5次傳代培養(yǎng)，收獲大約20億多個細(xì)胞，每支冷凍管大約I千萬細(xì)胞，93-96%成活率，約200支在液氮保存。(2)工作細(xì)胞庫(W·CB)細(xì)胞培養(yǎng)，經(jīng)過12-15天共3_5次傳代培養(yǎng)，傳代在GLP實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，按照準(zhǔn)備臨床實(shí)驗(yàn)材料(CTM)要求(21CFR58)進(jìn)行和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄，液氮和深凍(-80°C )保存(即部分用液氮保存、部分深凍保存)。(3)為保證疫苗病毒的高滴度，同時進(jìn)行二倍體細(xì)胞群體倍增水平(PDL)同步監(jiān)測，疫苗生產(chǎn)選用二倍體細(xì)胞群體倍增水平(PDL) 2.5以上的細(xì)胞株，正常二倍體細(xì)胞I3DL值為2.0左右。約20%細(xì)胞株符合達(dá)到倍增水平(PDL) 2.5以上要求(圖1)。上述步驟中的傳代培養(yǎng)采用下列二倍體細(xì)胞培養(yǎng)液:采用MEM細(xì)胞培養(yǎng)基，加有相當(dāng)于二倍體細(xì)胞培養(yǎng)液體積8-15%的小牛血清，每升二倍體細(xì)胞培養(yǎng)液中含有1-5 mM的L-谷氨酰胺，每毫升二倍體細(xì)胞培養(yǎng)液中含100-200單位青霉素、50-100微克鏈霉素及20-40納克兩性霉素，二倍體細(xì)胞培養(yǎng)液中含有12種非必需氨基酸。12種非必需氨基酸采用GIBCO BRL生產(chǎn)的100倍濃縮液，且在每升二倍體細(xì)胞培養(yǎng)液中的加入量為10ml。本發(fā)明可以得到較高的減毒水痘-帶狀皰疹病毒疫苗產(chǎn)量，該方法便于帶狀皰疹疫苗的大量制備，適用于規(guī)?；a(chǎn)。本方法也可以用作其它活體疫苗，如:甲肝疫苗、狂犬病疫苗、麻疹、天花等工業(yè)化生產(chǎn)。
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。圖1是工作細(xì)胞庫二倍體細(xì)胞群體倍增水平測定示意圖；其中X軸:工作細(xì)胞(WCB)編號(1-50)，Y軸:細(xì)胞群體倍增水平(DPL)；
圖2是二倍體細(xì)胞群體倍增水平不同的工作細(xì)胞所收獲的疫苗病毒的滴度比較示意圖；其中X軸:工作細(xì)胞名(LD1-2，MD1-2，HD1-2)，Y軸:疫苗病毒的滴度(噬菌斑/毫升)，黑斜線為疫苗病毒的滴度的增長趨勢直線。
具體實(shí)施例方式一種高水平PDL人二倍體細(xì)胞培養(yǎng)水痘-帶狀皰疹疫苗病毒方法，包括下列步驟:
(I)建立主體細(xì)胞庫(MCB)，按照美國FDA標(biāo)準(zhǔn)(21CFR211和21CFR600):取ATCC(CCL171)細(xì)胞株(來自美國權(quán)威的細(xì)胞保存機(jī)構(gòu)ATCC，細(xì)胞株由美國FDA專門指定，交由美國ATCC管理)，起始為第17代，經(jīng)過20天左右共3-5次傳代培養(yǎng)，收獲大約20億多個細(xì)胞，每支冷凍管大約I千萬細(xì)胞，93-96%成活率，約200支在液氮保存。(2)工作細(xì)胞庫(WCB)細(xì)胞培養(yǎng)，經(jīng)過12-15天共3_5次傳代培養(yǎng)，傳代在GLP實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，按照準(zhǔn)備臨床實(shí)驗(yàn)材料(CTM)要求(21CFR58)進(jìn)行和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄，液氮和深凍(-80°C )保存(即部分用液氮保存、部分深凍保存)。(3)為保證疫苗病毒的高滴度，同時進(jìn)行二倍體細(xì)胞群體倍增水平(PDL)同步監(jiān)測，疫苗生產(chǎn)選用二倍體細(xì)胞群體倍增水平(PDL) 2.5以上的細(xì)胞株，正常二倍體細(xì)胞I3DL值為2.0左右。約20%細(xì)胞株符合達(dá)到倍增水平(PDL) 2.5以上要求(圖1)。上述步驟中的傳代培養(yǎng)采用下列二倍體細(xì)胞培養(yǎng)液:采用MEM細(xì)胞培養(yǎng)基，加有相當(dāng)于二倍體細(xì)胞培養(yǎng)液體積8-15%的小牛血清，每升二倍體細(xì)胞培養(yǎng)液中含有1-5 mM的L-谷氨酰胺，每毫升二倍體細(xì)胞培養(yǎng)液中含100-200單位青霉素、50-100微克鏈霉素及20-40納克兩性霉素，二倍體細(xì)胞培養(yǎng)液中含有12種非必需氨基酸。
12種非必需氨基酸采用GIBCO BRL生產(chǎn)的100倍濃縮液，且在每升二倍體細(xì)胞培養(yǎng)液中的加入量為10ml。12種非必需氨基酸的用量(體積)相等或不等。二倍體細(xì)胞群體倍增水平不同的工作細(xì)胞LD1，LD2 (PDL值為1.7-2.0)，MD1，MD2(PDL值為2.1-2.4)，HDl，HD2 (PDL值為2.5-2.7)用來培養(yǎng)VZV疫苗病毒，收獲的疫苗病毒的滴度高低與PDL值成正比(圖2)。
權(quán)利要求
1.一種高水平人二倍體細(xì)胞培養(yǎng)水痘-帶狀皰疹疫苗病毒方法，其特征是:包括下列步驟: (1)建立主體細(xì)胞庫:按照美國FDA標(biāo)準(zhǔn)，取ATCC(CCL171)細(xì)胞株，起始為第17代，經(jīng)過20天左右共3-5次傳代培養(yǎng)，收獲的細(xì)胞用冷凍管在液氮保存； (2)工作細(xì)胞庫細(xì)胞培養(yǎng):將步驟(I)得到的細(xì)胞再經(jīng)過12-15天共3-5次傳代培養(yǎng)，按照準(zhǔn)備臨床實(shí)驗(yàn)材料要求進(jìn)行和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄，液氮和深凍保存； (3)為保證疫苗病毒的高滴度，同時進(jìn)行二倍體細(xì)胞群體倍增水平同步監(jiān)測，選用二倍體細(xì)胞群體倍增水平2.5以上的細(xì)胞株生產(chǎn)疫苗； 上述步驟中的傳代培養(yǎng)采用下列二倍體細(xì)胞培養(yǎng)液:采用MEM細(xì)胞培養(yǎng)基，加有相當(dāng)于二倍體細(xì)胞培養(yǎng)液體積8-15%的小牛血清，每升二倍體細(xì)胞培養(yǎng)液中含有1-5 mM的L-谷氨酰胺，每毫升二倍體細(xì)胞培養(yǎng)液中含100-200單位青霉素、50-100微克鏈霉素及20-40納克兩性霉素，二倍體細(xì)胞培養(yǎng)液中含有12種非必需氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高水平人二倍體細(xì)胞培養(yǎng)水痘-帶狀皰疹疫苗病毒方法，其特征是:12種非必需氨基酸采用GIBCO BRL生產(chǎn)的100倍濃縮液，且在每升二倍體細(xì)胞培養(yǎng)液中的加入量為10ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高水平人二倍體細(xì)胞培養(yǎng)水痘-帶狀皰疹疫苗病毒方法，包括建立主體細(xì)胞庫按照美國FDA標(biāo)準(zhǔn)，取ATCC(CCL171)細(xì)胞株，起始為第17代，經(jīng)過20天左右共3-5次傳代培養(yǎng)，收獲的細(xì)胞用冷凍管在液氮保存；工作細(xì)胞庫細(xì)胞培養(yǎng)；進(jìn)行二倍體細(xì)胞群體倍增水平同步監(jiān)測，選用二倍體細(xì)胞群體倍增水平2.5以上的細(xì)胞株生產(chǎn)疫苗；本發(fā)明可以得到較高的減毒水痘-帶狀皰疹病毒疫苗產(chǎn)量，該方法便于帶狀皰疹疫苗的大量制備，適用于規(guī)?；a(chǎn)。本方法也可以用作其它活體疫苗，如甲肝疫苗、狂犬病疫苗、麻疹、天花等工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12R1/93GK103074304SQ201310031329
公開日2013年5月1日 申請日期2013年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月28日
發(fā)明者莫呈鈞 申請人:江蘇健安生物科技有限公司