專利名稱：一種基于連接酶反應(yīng)的多特異位點(diǎn)dna甲基化電化學(xué)檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種DNA甲基化測(cè)定分析方法，具體涉及一種基于連接酶反應(yīng)的多特異位點(diǎn)DNA甲基化電化學(xué)檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
DNA甲基化是一種廣泛存在于高等生物的重要基因表觀遺傳修飾方式，也是外遺傳體系的一種重要表達(dá)調(diào)控機(jī)制。DNA甲基化主要發(fā)生在5’-CpG-3’的C，生成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。大量研究表明，DNA甲基化是在不改變基因堿基序列的情況下，通過改變CpG島的甲基化程度，在轉(zhuǎn)錄水平上實(shí)現(xiàn)調(diào)控基因表達(dá)，消除潛在危險(xiǎn)DNA序列，調(diào)節(jié)發(fā)育過程和各種生理反應(yīng)等功能。相反，DNA低甲基化和CpG島高甲基化等異常的基因組甲基化，不僅會(huì)導(dǎo)致DNA復(fù)制延遲、染色體壓縮、轉(zhuǎn)錄抑制等，而且會(huì)影響疾病的易感性、發(fā)生發(fā)展、預(yù)后和轉(zhuǎn)歸等。近年發(fā)現(xiàn)，基因組DNA異常甲基化與多種疾病尤其是年齡相關(guān)的慢性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。由于DNA甲基化在維持正常細(xì)胞功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育以及人類腫瘤發(fā)生中起著重要作用，建立準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)單的DNA甲基化檢測(cè)方法，對(duì)疾病的早期診治和社區(qū)干預(yù)等具有十分重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。
DNA甲基化的檢測(cè)研究可分為三個(gè)層次:(1)基因組整體甲基化水平檢測(cè)，(2)特異位點(diǎn)甲基化水平檢測(cè)，(3)新甲基化位點(diǎn)的尋找。常規(guī)的DNA甲基化的檢測(cè)方法主要依賴甲基化敏感性內(nèi)切酶在各自識(shí)別位點(diǎn)對(duì)5-mC和C不同的敏感性進(jìn)行區(qū)分，或重亞硫酸鹽對(duì)甲基化和非甲基化胞嘧啶的化學(xué)活性不同使DNA包含的甲基化信息轉(zhuǎn)變?yōu)樾蛄械牟町愋畔?。方法主要包括甲基化結(jié)合蛋白柱層層析，MSssI甲基轉(zhuǎn)移酶分析和氯乙醛反應(yīng)法，甲基化特異性PCR (MSP),甲基化敏感性單鏈構(gòu)象分析，重亞硫酸氫鈉聯(lián)合限制性內(nèi)切酶分析法(COBRA),甲基化敏感性斑點(diǎn)分析，甲基化敏感性變性梯度凝膠電泳，甲基化敏感單核苷酸引物延伸法(MS-SNuPE)，PCR熒光變性曲線分析，變性高效液相色譜法(DHPLC)，甲基化熒光檢測(cè)(MethyLight)，甲基化特異性多連接依賴性探針擴(kuò)增(MS-MLPA)，DNA甲基化微陣列芯片技術(shù)等。雖然甲基化檢測(cè)方法得到很大發(fā)展，但各種方法存在著明顯的限制性。重亞硫酸鹽法要求大量的克隆測(cè)序，過程繁瑣、昂貴，同時(shí)處理不完全時(shí)容易導(dǎo)致假陽(yáng)性；甲基化敏感性單核苷酸引物衍生技術(shù)則存在著實(shí)驗(yàn)步驟略復(fù)雜，若要檢測(cè)多個(gè)位點(diǎn)時(shí)，需要設(shè)計(jì)多個(gè)引物和存在放射性污染及重亞硫酸鹽處理不完全的問題；甲基化敏感性鏈解曲線分析技術(shù)等則存在著靈敏度太低的缺點(diǎn)；依賴基因測(cè)序或多步的PCR擴(kuò)增使分析步驟復(fù)雜，檢測(cè)需時(shí)長(zhǎng)，測(cè)定成本高；使用限制性內(nèi)切酶只能獲得特殊酶切位點(diǎn)的甲基化水平，不能確定樣品DNA中其它位點(diǎn)的甲基化情況。因此，需要尋找更加簡(jiǎn)單、快速的方法。電化學(xué)方法具有快速，靈敏，不受溶液濁度影響，且儀器簡(jiǎn)單、操作方便，使用成本低，無需復(fù)雜的前處理過程，易于微型化和實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等特點(diǎn)，在DNA甲基化檢測(cè)方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。近年來，DNA甲基化的電化學(xué)檢測(cè)方法取得了一定的突破，但從文獻(xiàn)報(bào)道來看，DNA甲基化的電化學(xué)檢測(cè)主要集中在DNA整體甲基化水平的檢測(cè)，對(duì)特異位點(diǎn)的甲基化水平檢測(cè)和新位點(diǎn)尋找的電化學(xué)方法鮮有報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于連接酶反應(yīng)的多特異位點(diǎn)DNA甲基化電化學(xué)檢測(cè)方法。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種多特異性位點(diǎn)DNA甲基化檢測(cè)方法，包括如下步驟:
(1)根據(jù)目標(biāo)DNA序列上的每個(gè)特異性甲基化位點(diǎn)的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)一組核酸探針，每組核酸探針由一條分離探針和一條信號(hào)探針組成，分離探針用固相載體修飾，信號(hào)探針用量子點(diǎn)修飾，檢測(cè)不同甲基化位點(diǎn)所使用的信號(hào)探針上修飾的量子點(diǎn)不同；
(2)目標(biāo)DNA樣品用重亞硫酸鹽處理，使未被甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶；
(3)將分離探針和信號(hào)探針加入步驟(2)處理后的目標(biāo)DNA溶液中進(jìn)行雜交；
(4)收集固相載體，清洗后加入DNA連接酶反應(yīng)液進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行解鏈反應(yīng)，解鏈結(jié)束后，趁熱將固相載體與反應(yīng)液分離；
(5)收集固相載體，清洗后利用溶出伏安法測(cè)定固相載體上連接的量子點(diǎn)的電化學(xué)信
號(hào);
(6)根據(jù)電化學(xué)信號(hào)的歸屬和強(qiáng)度確定甲基化的位點(diǎn)和甲基化程度。所述分離探針的長(zhǎng)度為35 45 bp,信號(hào)探針的長(zhǎng)度為10 15 bp,以保證雜交的選擇性。所述固相載體為磁性微球、聚四氟乙烯微球、金片、或表面修飾有羧基或氨基的微米材料。分離探針的制備方法如下:固相載體分別用100 mM咪唑緩沖溶液和EDC/NHS溶液處理后，加入核酸分子，35 45°C下振蕩反應(yīng)I 3小時(shí),分尚，分別用2XSSC緩沖溶液(0.5% SDS)和65°C高純水清洗，得到分離探針。信號(hào)探針的制備方法如下:量子點(diǎn)水溶液與核酸分子混合，在N2保護(hù)下攪拌16 24 小時(shí)，逐滴加入 PBS (pH 7.4,0.24 M NaCl, 0.1% NaN3)后在 PBS (pH 7.4,0.2 M NaCl)中透析36 48小時(shí)，離心收集制備的信號(hào)探針。步驟(3)所述雜交的條件為:35 45°C下雜交I 3小時(shí)。步驟(4)所述連接酶反應(yīng)液的組成為:30 mM Tris-HCl,4 mM MgCl2,10 mM(NH4)2SO4j0.005% BSA, 0.2 mM NAD 和 0.5 U/L Ecoli DNA 連接酶。連接反應(yīng)的條件為:35 40°C下反應(yīng)I 2小時(shí)。解鏈的條件為:85 95°C下解鏈5 15分鐘。步驟(5)測(cè)定溶出伏安曲線的條件為:玻碳電極在300 500 ii g/L鉍溶液中，一
0.9 一 1.1 V沉積10分鐘。本發(fā)明方法的原理如 下:
如圖1所示，根據(jù)目標(biāo)DNA鏈上的甲基化位點(diǎn)A的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)一組核酸探針(Pl和P2)甲基化位點(diǎn)B的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)一組核酸探針(P3和P4)，Pl和P4分別標(biāo)記CdS和PbS量子點(diǎn)作為信號(hào)探針(PbS-Pl，CdS-P4)，探針P2和P3 —起固定在固相載體(磁珠)上作為分離載體(MB-P2P3)。
如圖2所示，含目標(biāo)DNA鏈的待測(cè)樣品溶液首先經(jīng)重亞硫酸鹽處理，目標(biāo)DNA鏈中沒有發(fā)生甲基化的C脫氨基轉(zhuǎn)化為U，而5-mC保持不變。該待測(cè)溶液與MB-P2P3雜交并磁性分離，目標(biāo)DNA鏈被選擇性雜交到固相載體(MB)表面，與溶液中共存的DNA片段分離。進(jìn)一步將該MB與PbS-Pl和CdS-P4雜交，量子點(diǎn)PbS和CdS被連接到MB表面。加入疋col1.DNA連接酶，該DNA連接酶在間隙位置(圖1中箭頭所指位置)發(fā)生作用，識(shí)別錯(cuò)配位點(diǎn)。當(dāng)目標(biāo)鏈上位點(diǎn)發(fā)生甲基化時(shí)，對(duì)應(yīng)的相鄰兩條探針鏈與目標(biāo)鏈完全互補(bǔ)，連接酶將該兩條探針鏈連接成一條新的核酸鏈。反之，當(dāng)位點(diǎn)沒有發(fā)生甲基化時(shí)，對(duì)應(yīng)的相鄰兩條探針鏈與目標(biāo)鏈形成單堿基錯(cuò)配，連接酶不能發(fā)生作用。所得磁珠于緩沖溶液中加熱解鏈，磁性分離，甲基化位點(diǎn)上的標(biāo)記量子點(diǎn)通過DNA鏈與磁珠相連,而非甲基化位點(diǎn)上的標(biāo)記量子點(diǎn)則被解鏈分離。向解鏈后的磁珠中加入I M硝酸，利用溶出伏安法測(cè)定磁珠上連接的量子點(diǎn)的電化學(xué)信號(hào)。根據(jù)電信號(hào)的歸屬和強(qiáng)度確定甲基化的位點(diǎn)和甲基化程度。本發(fā)明的有益效果是:
該方法利用特異性免疫反應(yīng)和標(biāo)記抗體的酶在二氧化鈦溶膠凝膠膜上表現(xiàn)的直接電化學(xué)響應(yīng)，發(fā)展了新穎的無試劑免疫分析方法并制備了免疫傳感器。利用二氧化鈦溶膠凝膠氣相沉積法固定抗原分子，并利用競(jìng)爭(zhēng)免疫分析方法，通過直接測(cè)定反應(yīng)到免疫傳感器表面上標(biāo)記抗體的酶的直接電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)的降低直接得到待測(cè)抗原的濃度。該方法較現(xiàn)有的免疫分析方法，具有以下優(yōu)點(diǎn):
(1)溶出伏安法具有富集和溶出過程，靈敏度高，是一種很好的檢測(cè)痕量金屬離子濃度的電化學(xué)方法；
(2)秘膜電極代替?zhèn)鹘y(tǒng)的萊電極,秘金屬本身毒性較小，環(huán)境友好，而且具有與萊電極相媲美的電化學(xué)性能，如電勢(shì)窗口大，靈敏度高，檢測(cè)限低等；
(3)無需進(jìn)行繁瑣的基因測(cè)序步驟，簡(jiǎn)化了分析體系，降低測(cè)定成本；
(4)無需PCR擴(kuò)增步驟，簡(jiǎn)化了分析的操作步驟，縮短了分析時(shí)間，適用于臨床上在線快速檢測(cè)；`
(5)無需使用限制性內(nèi)切酶，對(duì)特異位點(diǎn)的甲基化研究具有普適性，縮短了分析時(shí)間，避免了限制性內(nèi)切酶的缺點(diǎn)；
(6)根據(jù)電化學(xué)信號(hào)的峰電位和峰電流，實(shí)現(xiàn)多特異甲基化位點(diǎn)的同時(shí)測(cè)定，
(7)該方法表現(xiàn)出很好的精確性，重復(fù)性和穩(wěn)定性，可發(fā)展成為試劑盒并向市場(chǎng)推廣。
圖1為核酸探針與目標(biāo)DNA的互補(bǔ)配對(duì)關(guān)系 圖2為基于連接酶反應(yīng)的多特異位點(diǎn)DNA甲基化電化學(xué)檢測(cè)方法原理 圖3為實(shí)施例1核酸探針與目標(biāo)DNA的互補(bǔ)配對(duì)關(guān)系 圖4為雜交溫度和雜交時(shí)間對(duì)甲基化電化學(xué)測(cè)定的影響(A.雜交溫度，B.雜交時(shí)間)；圖5為解鏈溫度和解鏈時(shí)間對(duì)甲基化電化學(xué)測(cè)定的影響(A.解鏈溫度，B.解鏈時(shí)間)；圖6為沉積電位、沉積時(shí)間、溶液中鉍離子濃度和電極預(yù)處理時(shí)間對(duì)甲基化電化學(xué)測(cè)定的影響(A.沉積電位，B.沉積時(shí)間，C.溶液中鉍離子濃度，D.電極預(yù)處理時(shí)間)；
圖7為實(shí)施例1目標(biāo)DNA鏈不同甲基化位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式下面以p53腫瘤抑制基因片段的甲基化檢測(cè)為例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。一、制備核酸探針
1、目標(biāo)基因片段的處理
用重亞硫酸鹽處理P53腫瘤抑制基因片段，步驟如下:
根據(jù)重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒說明，適量重亞硫酸鹽混合物用800 UL去核糖核酸酶的水在60 °C溶解完全。在200 uL PCR管中加入15 u L DNA樣品溶液(I ng - 2 u g),5UL去核糖核酸酶的水，85 UL重亞硫酸鹽混合物溶液，35 uL DNA保護(hù)緩沖溶液。蓋上PCR管蓋子，充分混合重亞硫酸鹽反應(yīng)液，室溫下保存。在PCR儀中95°C變性5 min,60 V溫育25 min，繼續(xù)在95 °C變性5 min,60 °C溫育85 min，再在95 °C變性5 min，在60 V溫育175 min，在20 °C保存過夜。處理前的基因片段為:
5’ -CC CAC CAT GAG CGC TGC TCA GAT AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG CAT CTTATCCGA GTG GAA ACA-3’ (SEQ ID NO:1)。處理后的基因片段為:
5’ -UU UAU UAT GAG CGU TCU TUA GAT AGU GAT GGT UTG GUU UUT UUT UAG UAT UTTATU CGA GTG GAA AUA-3’ (SEQ ID NO:2)。2、設(shè)計(jì)核酸探針
根據(jù)目標(biāo)基因經(jīng)重亞硫酸鹽修飾后的堿基序列(SEQ ID N0:2)，以甲基化位點(diǎn)為分界線設(shè)計(jì)相應(yīng)核酸探針(見圖3)。核酸探針I(yè) (Pl)與第一甲基化位點(diǎn)5’端序列(5’ -UU UAU UAT GAG C-3’)互補(bǔ)；核酸探針2 (P2)與第一甲基化位點(diǎn)3’端到目標(biāo)基因序列中點(diǎn)的序列(5’-GU TCU TUA GATAGU GAT GGT UTG-3’)互補(bǔ)；核酸探針3 (P3)與目標(biāo)基因序列中點(diǎn)到第二甲基化位點(diǎn)的序列(5，-GUU UUT UUT UAG UAT UTT ATU C-3’)互補(bǔ)；核酸探針4 (P4)是第二甲基化位點(diǎn)3’端到目標(biāo)基因3’端序列(5’ -GA GTG GAA AUA-3’)互補(bǔ)。其中，P2和P3在設(shè)計(jì)時(shí)，除了與待測(cè)DNA序列互補(bǔ)外，P2的5’端和P3的3’端有6-8 bp序列互補(bǔ)，形成樹杈結(jié)構(gòu)的頸部，中間有6-8 bp惰性序列形成三角區(qū)減少雜交的張力。同時(shí)，考慮DNA連接酶反應(yīng)，Pl和P4的5’端磷酸基修飾，P2和P3的3’端羥基修飾。四條核酸探針序列如下:
Pl 5，-P-GCTCATGGTGGG-C6-SH-3，(SEQ ID NO: 3)
P2 5’ -NH2-C6-ACA CAC CAT GCA TGA CAA CAA CAA CAA CAC GCT ATC TGA GCAGC-0H-3’ (SEQ ID NO:4)
P3 5’-P-GAT MG ATG CTG AGG ACA ACA CAC ACA ACA CAT GCA TGA CAC AC-C6-NH2_3’(SEQ ID N0:5)
P4 5’ -SH-C6-TGTTTCCACTCG-0H-3’ (SEQ ID NO:6) 3、量子點(diǎn)標(biāo)記信號(hào)探針Pl和P4
Pl用量子點(diǎn)PbS修飾，步驟為:1 mg/ml的量子點(diǎn)(PbS)水溶液與8 OD/ml核酸探針Pl混合，在N2保護(hù)下攪拌24小時(shí)。逐滴加入PBS(pH 7.4,0.24 M NaCl,0.1% NaN3)后在PBS(pH 7.4,0.2 M NaCl)中透析48小時(shí)。離心收集制備的PbS-Pl，加入PBS (pH 7.4,0.24 MNaCl,0.1% NaN3)后置于4°C下待用。P4用量子點(diǎn)CdS修飾，制備步驟相同。4、核酸探針P2和P3共同修飾磁性微球
10 UL磁性微球溶液用100 mM咪唑緩沖溶液(pH 7.0)清洗兩次，加入100微升EDC/NHS溶液反應(yīng)30分鐘后，加入50 UL 10 uM P3和P4溶液，50°C下振蕩反應(yīng)3小時(shí)。磁分離后，用2 X SSC緩沖溶液(0.5% SDS)清洗3次，65°C高純水清洗兩次，溶解于PBS (pH
7.4,0.24 M NaCl,0.1% NaN3)溶液中，置于 4°C下待用。所述EDC/NHS溶液是由I g/L EDC和I g/L NHS按1:1 (v/v)混合得到。二、測(cè)定條件優(yōu)化
1、雜交溫度和雜交時(shí)間
在DNA雜交過程中，雜交溫度低于DNA的熔鏈溫度(Tm) 1(T15 ° C時(shí)，互補(bǔ)鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯(cuò)配對(duì)減少；若雜交溫度低于Tm 30 ° C，互補(bǔ)鏈之間配對(duì)減少，錯(cuò)配對(duì)增多，氫鍵結(jié)合減弱。一般最適溫度理論計(jì)算公式為T = Tm - 25 ° C。在DNA雜交過程中，雜交溫度影響雜交效果。雜交時(shí)間過短導(dǎo)致互補(bǔ)鏈中錯(cuò)配情況增加，探針鏈不能很好 的捕捉目標(biāo)鏈，使信號(hào)出現(xiàn)假陽(yáng)性；而雜交時(shí)間過長(zhǎng)則影響實(shí)驗(yàn)的效率及檢測(cè)方法的實(shí)時(shí)性。在本實(shí)施例中，以完全甲基化的p53腫瘤抑制基因片段為研究對(duì)象，分別改變雜交溫度和雜交時(shí)間，選擇最大電流響應(yīng)時(shí)的相應(yīng)值作為最佳雜交條件。如圖4A所示。在雜交溫度分別為10，25，38和55 ° C條件下分別測(cè)定完全甲基化的目標(biāo)P53基因片段。當(dāng)雜交溫度為10 ° C時(shí)，由于溫度過低，互補(bǔ)堿基配對(duì)減少，錯(cuò)配對(duì)增多，氫鍵的結(jié)合力弱，因此檢測(cè)信號(hào)較小，不適宜DNA的雜交。隨雜交溫度提高，檢測(cè)信號(hào)明顯增大，38° C達(dá)到最大值。繼續(xù)升高雜交溫度到55 ° C，會(huì)導(dǎo)致融鏈，雜交效率降低，信號(hào)下降。因此，選擇38 ° C作為實(shí)驗(yàn)最終雜交溫度。圖4B優(yōu)化了在38° C下的雜交時(shí)間。當(dāng)雜交時(shí)間為I小時(shí)，檢測(cè)信號(hào)較小。延長(zhǎng)雜交時(shí)間從2到6小時(shí)，檢測(cè)信號(hào)增大并基本達(dá)到穩(wěn)定，表明2 h后雜交情況趨于穩(wěn)定。因此選擇2 h為優(yōu)化后的雜交時(shí)間。2、解鏈溫度和解鏈時(shí)間
解鏈時(shí)間影響解鏈效果。解鏈時(shí)間過短，解鏈不完全，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；解鏈時(shí)間過長(zhǎng)，使DNA和磁性微球長(zhǎng)期處于高溫環(huán)境中，導(dǎo)致DNA鏈斷裂成單個(gè)堿基，或者磁性微球變性磁性降低，損失一部分信號(hào)。圖5A以完全非甲基化的目標(biāo)p53基因片段為對(duì)象，研究了解鏈溫度對(duì)測(cè)定的影響。由圖可知70 ° C時(shí)檢測(cè)到的峰信號(hào)最大，可以認(rèn)為是70 ° C時(shí)溫度不夠?qū)е陆怄湶煌耆?，?huì)使檢測(cè)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，。當(dāng)解鏈溫度從70° C升高到90 ° C，測(cè)定信號(hào)迅速降低。溫度高于90 ° C后，測(cè)定信號(hào)趨于穩(wěn)定值，因此選擇90 ° C為解鏈溫度。圖5B為在90° C解鏈溫度下不同解鏈時(shí)間對(duì)測(cè)定的影響。隨解鏈時(shí)間從5 min延長(zhǎng)到25 min，測(cè)定信號(hào)迅速下降，并趨于穩(wěn)定值，認(rèn)為解鏈完全。因此，選擇20 min為優(yōu)化后的解鏈時(shí)間。
3、溶出伏安法條件選擇
圖6A為以完全甲基化的目標(biāo)p53基因片段為對(duì)象，研究不同沉積電位對(duì)測(cè)定的影響。當(dāng)沉積電位從-0.85 V向負(fù)方向改變時(shí)，測(cè)定信號(hào)迅速增加，并在沉積電位負(fù)于-1.0 V后趨于極限值。因此，選擇優(yōu)化的電沉積電位為-1.0 V。圖6B為在-1.0 V沉積電位下不同沉積時(shí)間對(duì)測(cè)定信號(hào)的影響情況。隨沉積時(shí)間從50 s延長(zhǎng)到450 S，峰電流與沉積時(shí)間呈線性關(guān)系。450 s以后，Pb離子的信號(hào)略有下降，而Cd離子的信號(hào)繼續(xù)增加，到600 s達(dá)到穩(wěn)定值。因此，選擇600 s為最佳的沉積時(shí)間。圖6C研究了溶液中鉍離子濃度對(duì)溶出伏安響應(yīng)的影響。當(dāng)鉍離子濃度為0 200吒L—1時(shí)，Cd峰電流顯著增加，200 600 I^g L—1時(shí)出現(xiàn)平臺(tái)期，大于600 I^g L—1時(shí)，峰電流呈下降的趨勢(shì)。而對(duì)于Pb的峰電流，當(dāng)鉍離子濃度為0 200 I^g L—1時(shí)，峰電流顯著增加，200 600 I^g L—1時(shí)增加趨勢(shì)稍緩，大于600 I^g L—1時(shí)，峰電流呈下降的趨勢(shì)。檢測(cè)時(shí)需同時(shí)檢測(cè)溶液中的Cd和Pb離子濃度，綜合二者，選擇400 I^g L—1作為最終溶液中鉍離子的濃度。圖6D為電極測(cè)定后清洗時(shí)間的優(yōu)化。由于方波伏安法是一種比較快速的掃描方法，因此從負(fù)電位掃到正電位時(shí)，電極上仍然有殘留的待測(cè)金屬和金屬鉍，影響下一次的測(cè)定。因此，需要在電極上 加一個(gè)正電壓清洗一段時(shí)間，使電極上的金屬離子完全的溶出，盡量的還原電極表面。圖6D為在+0.3 V電壓下不同清洗時(shí)間重復(fù)測(cè)定五次得到的Cd和Pb離子的響應(yīng)。當(dāng)清洗時(shí)間為15 s時(shí)，多次測(cè)定重復(fù)性差。隨著清洗時(shí)間的增長(zhǎng)，測(cè)定的重復(fù)性提高，實(shí)驗(yàn)選擇優(yōu)化的清洗時(shí)間為75 S。三、不同甲基化位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得
取10 L P2和P3核酸探針修飾的磁性微球與一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的甲基化目標(biāo)鏈在38°C下雜交2小時(shí)，再分別加入10 uL PbS-Pl和CdS-P4溶液，室溫下雜交I小時(shí)。收集磁性微球，用超純水清洗2次，加入20 UL酶反應(yīng)液(30 mM Tris-HCl,4 mM MgCl2,10 mM(NH4)2SO4j0.005% BSA, 0.2 mM NAD 和 0.5 U/L Ecoli DNA 連接酶)，38 °C下反應(yīng) I 小時(shí)。將反應(yīng)液在90°C下解鏈10分鐘，收集磁性微球，趁熱將反應(yīng)液抽出后，依次用I XPBS溶液(0.2% Tween 20)和超純水清洗磁性微球，加入100 uL I M HNO3溶液，玻碳電極在400U g/L鉍溶液中，一 1.1 V沉積10分鐘，得到溶出伏安曲線。重復(fù)測(cè)定三次后，取平均值。圖7A為只有甲基化位點(diǎn)A被甲基化的目標(biāo)鏈濃度對(duì)Pb離子的響應(yīng)校準(zhǔn)曲線，溶液中隨目標(biāo)鏈濃度的增加，Pb離子的響應(yīng)峰電流逐漸增加，響應(yīng)峰電流值與目標(biāo)鏈濃度的呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程是:/pa (PA) = -0.0505c (nmol I71) - 1.096 (n=3, R=0.9663)，線性范圍和檢出限依次是 10 nmol L-1 80 nmol I71 和 230 pmol I71 (S/N =3)。圖7B是只有甲基化位點(diǎn)B被甲基化的目標(biāo)鏈濃度對(duì)Cd離子的響應(yīng)校準(zhǔn)曲線。隨溶液中目標(biāo)鏈濃度的增加，Cd離子的響應(yīng)峰電流增加，并呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。線性方程Upa (u A) = -0.0471c (nmol I71) - 0.7533 (n=3, R = 0.9637)，線性范圍和檢出限依次是 10 nmol L-1 80 nmol L-1 和 300 pmol L-1 (S/N = 3)。圖7C為兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)甲基化的目標(biāo)鏈濃度與Pb和Cd離子的伏安響應(yīng)關(guān)系，表現(xiàn)出與圖7A和圖7B相同的線性關(guān)系，說明可同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)位點(diǎn)的甲基化情況。
四、P53腫瘤抑制基因片段特異位點(diǎn)甲基化的測(cè)定
(I)p53腫瘤抑制基因片段樣品用重亞硫酸鹽處理:
取試劑盒封裝的重亞硫酸鹽混合物用800 UL去核糖核酸酶的水在60 V溶解完全。在200 uL PCR管中加入15 uL DNA樣品溶液(I ng - 2 u g),5 u L去核糖核酸酶的水，85 UL重亞硫酸鹽混合物溶液，35 UL DNA保護(hù)緩沖溶液。蓋上PCR蓋子，充分混合重亞硫酸鹽反應(yīng)液，室溫下保存。在PCR儀中95 V變性5 min, 60 °C溫育25 min，繼續(xù)在95°C變性5 min, 60 °C溫育85 min，再在95 °C變性5 min，在60 °C溫育175 min，在20 °〇保存過夜。(2)取10 UL P2和P3核酸探針修飾的磁性微球與p53腫瘤抑制基因片段樣品在38°C下雜交2小時(shí)，再分別加入10 ii L PbS-Pl和CdS-P4溶液，室溫下雜交I小時(shí)。(2)收集磁性微球，用超純水清洗2次，加入20 ii L酶反應(yīng)液(30 mM Tris-HCl，4mM MgCl2,10 mM (NH4)2SO4j0.005% BSA, 0.2 mM NAD 和 0.5 U/L Ecoli DNA 連接酶)，38 °C下反應(yīng)I小時(shí)。將反應(yīng)液在90°C下解鏈10分鐘。(3)收集磁性微球，趁熱將反應(yīng)液抽出后，依次用IXPBS溶液(0.2% Tween 20)和超純水清洗磁性微球，加入10 0 UL I M HNO3溶液，玻碳電極在400 U g/L鉍溶液中，一 1.1V沉積10分鐘，得到溶出伏安曲線。(4)利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，計(jì)算p53腫瘤抑制基因片段樣品中特異位點(diǎn)甲基化的濃度。
權(quán)利要求
1.一種多特異性位點(diǎn)DNA甲基化檢測(cè)方法，包括如下步驟: (1)根據(jù)目標(biāo)DNA序列上的每個(gè)特異性甲基化位點(diǎn)的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)一組核酸探針，每組核酸探針由一條分離探針和一條信號(hào)探針組成，分離探針用固相載體修飾，信號(hào)探針用量子點(diǎn)修飾，檢測(cè)不同甲基化位點(diǎn)所使用的信號(hào)探針上修飾的量子點(diǎn)不同； (2)目標(biāo)DNA樣品用重亞硫酸鹽處理，使未被甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶； (3)將分離探針和信號(hào)探針加入步驟(2)處理后的目標(biāo)DNA溶液中進(jìn)行雜交； (4)收集固相載體，清洗后加入DNA連接酶反應(yīng)液進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行解鏈反應(yīng)，解鏈結(jié)束后，趁熱將固相載體與反應(yīng)液分離； (5)收集固相載體，清洗后利用溶出伏安法測(cè)定固相載體上連接的量子點(diǎn)的電化學(xué)信號(hào); (6)根據(jù)電化學(xué)信號(hào)的歸屬和強(qiáng)度確定甲基化的位點(diǎn)和甲基化程度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述分離探針的長(zhǎng)度為35 45bp,信號(hào)探針的長(zhǎng)度為10 15 bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相載體為磁性微球、聚四氟乙烯微球、金片、或表面修飾有羧基或氨基的微米材料。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述分離探針的制備方法如下:固相載體分別用100 mM咪唑緩沖溶液和EDC/NHS溶液處理后，加入核酸分子，35 45°C下振蕩反應(yīng)I 3小時(shí)，分離，分別用2X SSC緩沖溶液(0.5% SDS)和65°C高純水清洗，得到分離探針。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述信號(hào)探針的制備方法如下:量子點(diǎn)水溶液與核酸分子混合，在N2保護(hù)下攪拌16 24小時(shí)，逐滴加入PBS (pH 7.4，0.24 MNaCl, 0.1% NaN3)后在PBS (pH 7.4,0.2 M NaCl)中透析36 48小時(shí)，離心收集制備的信號(hào)探針。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述雜交的條件為:35 45°C下雜交I 3小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述連接酶反應(yīng)液的組成為:30mM Tris-HCl,4 mM MgCl2,10 mM (NH4)2SO4j0.005% BSA,0.2 mM NAD和0.5 U/L Ecoli DNA連接酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述連接反應(yīng)的條件為:35 40°C下反應(yīng)I 2小時(shí)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述解鏈的條件為:85 95°C下解鏈5 15分鐘。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)測(cè)定溶出伏安曲線的條件為:玻碳電極在300 500 u g/L鉍溶液中，一 0.9 一 1.1 V沉積10分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于連接酶反應(yīng)的多特異位點(diǎn)DNA甲基化電化學(xué)檢測(cè)方法。該方法利用特異性免疫反應(yīng)和標(biāo)記抗體的酶在二氧化鈦溶膠凝膠膜上表現(xiàn)的直接電化學(xué)響應(yīng)，發(fā)展了新穎的無試劑免疫分析方法并制備了免疫傳感器。利用二氧化鈦溶膠凝膠氣相沉積法固定抗原分子，并利用競(jìng)爭(zhēng)免疫分析方法，通過直接測(cè)定反應(yīng)到免疫傳感器表面上標(biāo)記抗體的酶的直接電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)的降低直接得到待測(cè)抗原的濃度。本方法無需進(jìn)行繁瑣的基因測(cè)序步驟，簡(jiǎn)化了分析體系，降低測(cè)定成本，具有很好的精確性，重復(fù)性和穩(wěn)定性，可發(fā)展成為試劑盒并向市場(chǎng)推廣。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103114139SQ20131003100
公開日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月25日
發(fā)明者戴宗, 鄒小勇, 蔡婷 申請(qǐng)人:中山大學(xué)