專利名稱：一種檢測具有厭氧條件下降解烴功能的微生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物檢測鑒定技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種檢測具有厭氧條件下降解烴功能微生物的方法。
背景技術(shù)：
油藏是一個(gè)典 型的厭氧環(huán)境，其中蘊(yùn)含大量的石油烴并孕育功能多樣的微生物。在這個(gè)巨大的地質(zhì)生物反應(yīng)器中，普遍存在可在厭氧條件下降解烴類的微生物。原油兩大組份是由芳香烴、烷烴和浙青質(zhì)組成，多數(shù)烴類溶解性差，化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定不易降解。芳香烴中，苯、甲苯、乙苯、二甲苯(BTEX化合物)是強(qiáng)污染物，因而備受關(guān)注。但是，烷烴中也有一些是有毒的，所以研究厭氧降解烷烴的微生物同樣具有重要意義。研究表明，具有厭氧降解烷烴功能的微生物主要有硝酸鹽還原菌、硫酸鹽還原菌及產(chǎn)甲烷菌群。厭氧條件下微生物降解烴有利于提高原油采收率，是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。這項(xiàng)研究在油藏殘余油生物氣化開采和石油污染生物修復(fù)方面具有重大的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。在分析檢測烴降解微生物方面，傳統(tǒng)技術(shù)主要包括以下3種方法:(1)液體篩選培養(yǎng)方法一采用以烴為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)待檢測樣品，經(jīng)反復(fù)培養(yǎng)，優(yōu)勝劣汰，最后獲得能夠降解烴的微生物，然后用鏡檢法和比濁法測定培養(yǎng)物中的菌量；(2)固體培養(yǎng)方法一用含有烴、氮和磷等營養(yǎng)物質(zhì)的固體培養(yǎng)基篩選分離烴降解菌，同時(shí)可以結(jié)合平板菌落計(jì)數(shù)法和最大概率數(shù)法(MPN法)測菌數(shù)。(3)細(xì)菌瓶法一與MPN法的基本原理和方法相同，利用烴降解產(chǎn)物的反應(yīng)現(xiàn)象指示微生物生長。上述3種方法中，細(xì)菌瓶法目前應(yīng)用較多，但是這3種方法都如下缺陷:檢測不全面，較適合于好氧菌檢測、而用于厭氧菌檢測時(shí)難度非常大；對于豐度低的微生物，可能因?yàn)榕囵B(yǎng)條件不適逐漸被淘汰而造成漏檢；檢測周期長、消耗大，對于生理特性不同的微生物必須分別采用不同培養(yǎng)條件檢測，因而工作量大；檢測鏡檢法、比濁度法、MPN和細(xì)菌瓶法均不能得到烴降解菌的分類信息。此外，環(huán)境樣品中(如油藏)發(fā)育著豐富多樣的微生物，絕大多數(shù)具有降解烴功能，但其中多數(shù)微生物屬于不可培養(yǎng)的，由于傳統(tǒng)方法依賴于培養(yǎng)，因此采用傳統(tǒng)方法無法認(rèn)知這些微生物，導(dǎo)致了這類微生物的群落結(jié)構(gòu)與功能認(rèn)識上的一個(gè)盲區(qū)。本發(fā)明用特異性引物擴(kuò)增樣品中的微生物DNA，結(jié)合測序的方法獲得樣品中具有烴降解功能的微生物的信息。本發(fā)明的檢測特異性強(qiáng)，操作便捷，檢測準(zhǔn)確、全面，克服了依賴培養(yǎng)及計(jì)數(shù)的傳統(tǒng)檢測方法所存在的各種缺陷。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種針對性強(qiáng)、操作簡便、檢測全面準(zhǔn)確的快速檢測樣品中具有厭氧條件下降解烴功能的微生物的方法。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明提供一種檢測具有厭氧條件下降解烴功能的微生物的方法，該方法包括如下步驟:(I)提取樣品微生物的DNA ；(2)分別采用序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示引物對1、SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4所示引物對2，及SEQ ID N0:5和SEQ ID NO:6所示引物對3對樣品微生物的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增:(3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞并測序；(4)分析序列，得到樣品中具有厭氧條件下降解烴功能的微生物的信息。本發(fā)明的方法中，步驟(2)采用的引物對具體為:引物對I正向:CCNACCACNAAGCAYGG(SEQ ID N0:1),反向:TCGTCRTTGCCCCATTTIGGIGC(SEQ ID N0:2)；引物對2正向:TCGAYGAYGGSTGCATGGA(SEQ ID NO:3)，反向:TTCTGGTTYTTCTGCAC(SEQ ID N0:4)；引物對3正向:GCAGTACAAYTCCTACACSACYGABATGGT(SEQ ID NO:5)，反向:CCRTGCTTSGGRCCVGCCTGVCCGAA(SEQ ID NO:6)。分別采用上述各引物對對樣品微生物的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系組成為無菌7jC 12 μ L,2XTaq PCR master mix9yL、濃度為12.5 μ mol.Γ1的引物對的正向和反向引物各I μ L、樣品微生物的DNA2 μ L。所述樣品微生物的DNA濃度調(diào)整在50ng.μ L—1左右。采用上述引物對對樣品微生物的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?a)94° C保溫5min ；b)94° C 保溫 45s;c)60° C 保溫 Imin ;d) 72 ° C 保溫 Imin ;e)重復(fù)執(zhí)行 b) d) 48次；f)72° C保溫IOmin后結(jié)束。附圖的簡要i兌明
圖1是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。這些實(shí)施例只是用于說明本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例華北某油田采油井產(chǎn)出液樣品(S1、S2、S3、S4)中具有厭氧條件下降解烴功能的微生物的檢測1.提取樣品中微生物的DNA采用Axygen細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(Axygen Biosciences, Inc.,美國)，按照說明書描述的方法提取華北油田采油井產(chǎn)出液樣品微生物的DNA。
2.分別采用引物對I (正向:CCNACCACNAAGCAYGG，反向:TCGTCRTTGCCCCATTTIGGIGC),引物對 2 (正向:TCGAYGAYGGSTGCATGGA，反向:TTCTGGTTYTTCTGCAC)及引物對 3 (正向:GCAGTACAAYTCCTACACSACYGABATGGT，反向:CCRTGCTTSGGRCCVGCCTGVCCGAA)對樣品微生物的 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。
I) PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系利用引物對1、引物對2和引物對3對樣品微生物DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系組成相同，包括12 μ L無菌水，9 μ L2XTaq PCRmaster mix和濃度為12.5 μ mo I.Γ1的引物對的正反向引物各I μ L，最后加入提取的樣品中微生物的DNA2 μ L。2 ) PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序利用引物對1、引物對2和引物對3進(jìn)行樣品微生物DNA擴(kuò)增的PCR反應(yīng)程序相同:a) 94° C 保溫 5min ;b)94° C 保溫 45s;c)60° C 保溫 Imin ;d) 72° C 保溫 lmin;e)重復(fù)執(zhí)行b) d) 48次；f) 72° C保溫IOmin后結(jié)束。3) PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取5μ L PCR產(chǎn)物，用1.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定、拍照。結(jié)果見圖1。3.擴(kuò)增產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞并測序采用Axygen膠回收純化試劑盒(Axygen Biosciences, Inc.,美國),按說明書描述的方法提取擴(kuò)增所得目的基因。采用Takara公司的pMm^-T Simple載體試劑盒，按說明書描述的方法將提取得到的目的基因連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)連接轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞，然后將培養(yǎng)所得細(xì)胞送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。I)引物對I擴(kuò)增SI樣品，擴(kuò)增產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后測序，代表序列 All (SEQ ID NO:7):TCGGCCACGGCCAACTGCGCCAAGATGGTGGAATACGCTCTTCTAAACGGCTACGACCCGGTTGTTCAGATGCAGATGGGGCCAAAGACCGGCGATTCCGCCAAGTTCACGGACTTCGAGCAGCTTTTCGCCGCGTGGGTGACCCAGATGGAATGGCTGACGAACACCCTGGTGCGCACGGTGAACCTTGGCCGGTACAAGGACCCGGAATTCTACGGCAGGCCCTTCCTCTCGGCCACATACGAGCGGGCGGTTGAATCGGGCCTGGATGCGGTAAGCCCGGTGGGTGATCGCGGCAACTGCTGGATAACCGGTTTCACATGGGTTGAAAACATAGACAGCCTGGCTGCGGTTAAAAAGCTTGTTTTCGACGACAAAAAATACACCATGA
GCGAACTTCTGGAAGCCCTTCGCACCAACTGGGACGGCCGCGAGCAGATGAGGCTCGATTTCGTGAATGCCCCCAAA`TGGGGCAACGACG2)引物對2擴(kuò)增S3樣品，擴(kuò)增產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后測序，代表序列 A23 (SEQ ID N0:8):ATGGAACTTGGCCGGGACGCCTGTGAGCTTTCCGAGCAGCCCAACGGCTGGCATAATCCGATTACAACCGTTGTGGCGGCCAATTCCCTGGTGGCTATCAAAAAACTGATTTATGATGATAAAAAGTACACCATGGGCCAGCTCATGAATGCCCTGAGGGCAAACTGGGAAGGCTATGAAGAAATGCAGAAGGACTTTAAAAACGCTCCCAAGTGGGGCAATGACGATGAATATTGCGACGCAATAATCAAGGCCTTTTATGAGGATATCATCGGAGGAGAAATGAGCAAGATTACCAACTATTCGGGAGGTCCGGTGCTTCCGGTGGGACAGGGTGTCGGGCTGTATAT
GGAAGTCGGATCGCGGACCGGCCCGACCCCTGACGGTCGATTCGGAGGGGAAGCGGCAGATGACGGCGGGATTTCTCCTTATATGGGTACGGACCATAAAGGGCCGACCGCGGTGCTGAGATCGGTATCAAACGTGCAGAAAAACCAG3)引物對3擴(kuò)增S2樣品，擴(kuò)增產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后測序，代表序列 A32 (SEQ ID N0:9):GAAGGGCGTCATCGCCGGCTTCCAGCGCGCATCAAGCGACCGCAAGATCGTCGCCGCGGTGTTTACCGGCGTCGGCGACAAGGCCTTCTGCACCGGTGGCAACACCGCCGAGTACGCCGTCTACTACTCGCGCCGGCCCAATGAATACGGCGAGTACATGGACCTCTTCAACGCCATGGTCGACGGCATCCTCAACTGCAAGAAGCCGGTGATCTGCCGCGTGAACGGCATGCGCGTCGCCGGCGGCCAGGAGATCGGCATGGCCACCGACATCACCGTCACCTCCGACCTCGCCGTGC4)引物對3擴(kuò)增S3樣品，擴(kuò)增產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后測序，代表序列 A33 (SEQ ID NO: 10):CAAAGGCGTGATCCTCGCCTTCCGTGAGGCGAGCGCAGCGCGCGACGTCGTCGCAGTGGTGTTTACCGGTGCCGGCGACAAGGCCTTCTGCACCGGCGGAAATACCAAGGAATACGCCGAATATTACGCCGGCAATCCGCAGGAATATCGCGGCTATATGCGGCTGTTCAACGACATGGTGTCAGCCATCCTGGGCTGCGACAAGCCCGTGATCTGCCGG
GTCAACGGCATGCGCATCGGCGGCGGCCAGGAAATCGGCATGGCCTGCGATTTCACGATCGCGCAGGATCTGGCGCGC5)引物對3擴(kuò)增S4樣品，擴(kuò)增產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后測序，代表序列 A34 (SEQ ID NO: 11):ATGGAGCTCTTCAACAACATGGTCGACTCCATCCTCACGTGCAAGAAGCCCGTCATCTGCCGGGTGAACGGCATGAGGGTCGCCGGCGGGCAGGAAATCGGCCTGGCGTGCGACATCGCTATCGCCTCCGACCTCGCCATC4.序列分析將所得序列結(jié)果在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)開發(fā)的基于序列相似性的數(shù)據(jù)庫搜索程序blast (http://blast, ncb1.com)上比對分析,得到檢測樣品中具有厭氧條件下降解烴功能的微生物的信息如下:1)引物對1擴(kuò)增SI樣品，擴(kuò)增產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后測序，代表序列All。經(jīng)序列比對分析，序列All在蛋白質(zhì)水平與Desulfatibacillum alkenivoransAK-Ol相似度83%，該菌是可以在厭氧條件下降解烷烴的微生物。SI樣品檢測該菌克隆數(shù)為23，總克隆數(shù)為23(見表1)，表明SI樣品中在厭氧條件下降解烷烴的微生物全部為該類菌。采用引物對I擴(kuò)增S3樣品和S4樣品，擴(kuò)增產(chǎn)物代表序列的測序結(jié)果同SI樣品。對于S3樣品，檢測到該類菌的克隆數(shù)為24，總克隆數(shù)為26(見表1)，計(jì)算S3樣品中在厭氧條件下降解烷烴的微生物中該類菌相對豐度為92.3%。對于S4樣品，檢測到該類菌克隆數(shù)為28，總克隆數(shù)為28 (見表1)，計(jì)算S4樣品在厭氧條件下降解烷烴的微生物全部為該類菌。2)引物對2擴(kuò)增S3樣品，擴(kuò)增產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后測序，代表序列A23。經(jīng)序列比對分析,上述序列在蛋白質(zhì)水平與Desulfobacula toluolica相似度81%，表明油藏環(huán)境中存在可以在厭氧條件下降解芳香烴的微生物。S3樣品檢測，該類菌克隆數(shù)為30，總克隆數(shù)為30(見表1)，表明S3樣品中在厭氧條件下降解芳香烴的微生物中全部為該類菌。采用引物對2擴(kuò)增S4樣品，擴(kuò)增產(chǎn)物代表序列的測序結(jié)果同S3樣品，S4樣品檢測該類菌克隆數(shù)為25，總克隆數(shù)為25(見表1)，表明S4樣品中在厭氧條件下降解芳香烴的微生物全部為該類菌。3)引物對3擴(kuò)增S2樣品，擴(kuò)增產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后測序，代表序列A32。經(jīng)序列比對分析,上述序列在蛋白質(zhì)水平與Azoarcus toluvorans相似度87%,表明油藏環(huán)境中存在可以在厭氧條件下降解芳香烴的微生物。S2樣品檢測該類菌克隆數(shù)為14，總克隆數(shù)為26 (見表1)，表明S2樣品中在厭氧條件下降解芳香烴的微生物中該類菌的相對豐度為53.8%。
4)引物對3擴(kuò)增S3樣品，擴(kuò)增產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后測序，代表序列A33。經(jīng)序列比對分析,上述序列在蛋白質(zhì)水平與Thauera chlorobenzoica相似度90%，表明油藏環(huán)境中存在可以在厭氧條件下降解芳香烴的微生物。S3樣品檢測該類菌克隆數(shù)為8，總克隆數(shù)為21 (見表1)，計(jì)算S3樣品中在厭氧條件下降解芳香烴的微生物中該類菌的相對豐度為38.1%。5)引物對3擴(kuò)增S4樣品，擴(kuò)增產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后測序，代表序列A34。經(jīng)序列比對分析,上述序列在蛋白質(zhì)水平與Desulfobacterium aniline DSM4660相似度87%，S4樣品檢測該類菌克隆數(shù)為15，總克隆數(shù)為27 (見表1)，計(jì)算S4樣品中在厭氧條件下降解芳香烴的微生物中該類菌的相對豐度為55.6%。表I厭氧烴降解基因文庫克隆數(shù)
權(quán)利要求
1.一種檢測具有厭氧條件下降解烴功能的微生物的方法，其特征在于包括如下步驟: (1)提取樣品微生物的DNA; (2)分別采用序列表中SEQID N0:1和SEQ ID NO:2所示引物對1、SEQ ID N0:3和SEQID N0:4所示引物對2，及SEQ ID N0:5和SEQ ID NO:6所示引物對3對樣品微生物的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞并測序； (4)分析序列，得到樣品中具有厭氧條件下降解烴功能的微生物的信息。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測具有厭氧條件下降解烴功能的微生物的方法，其中步驟(2)所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系組成為無菌水12μ L、2XTaqPCR master mix9yL、濃度為12.5 μ mo I.Γ1的引物對的正向和反向引物各I μ L、樣品微生物的DNA2 μ L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測具有厭氧條件下降解烴功能的微生物的方法，其中步驟(2)所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?a)94° C保溫5min ;b) 94° C保溫45s;c)60° C保溫Imin ；d) 72° C保溫Imin ;e)重復(fù)執(zhí)行b廣d) 48次；f) 72° C保溫IOmin后結(jié)束。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測具有厭氧條件下降解烴功能的微生物的方法，該方法包括如下步驟(1)提取樣品微生物的DNA；(2)分別采用序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示引物對1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示引物對2，及SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示引物對3對樣品微生物的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞并測序；(4)分析序列，得到樣品中具有厭氧條件下降解烴功能的微生物的信息。本發(fā)明用特異性引物擴(kuò)增樣品中的微生物DNA，結(jié)合測序的方法獲得樣品中具有厭氧條件下烴降解功能的微生物的信息。本發(fā)明的檢測特異性強(qiáng)，操作便捷，檢測準(zhǔn)確、全面，克服了依賴培養(yǎng)及計(jì)數(shù)的傳統(tǒng)檢測方法所存在的各種缺陷。
文檔編號C12Q1/04GK103088134SQ201310022349
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月22日
發(fā)明者牟伯中, 劉金峰, 楊世忠, 王立影, 管婧, 杜云浩 申請人:華東理工大學(xué)