使用alkL基因產(chǎn)物合成有機(jī)化合物的生物技術(shù)方法
【專利摘要】本發(fā)明的主題是借助于至少一種alkL基因產(chǎn)物生產(chǎn)有機(jī)化合物的生物技術(shù)方法。
【專利說明】使用a IkL基因產(chǎn)物合成有機(jī)化合物的生物技術(shù)方法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明的主題是借助于至少一種alkL基因產(chǎn)物生產(chǎn)有機(jī)化合物的生物技術(shù)方法。
現(xiàn)有技術(shù)
[0002]脂肪酸及其衍生物目前專門獲得于植物和動物的油或脂肪。這具有許多缺點(diǎn): 作為BSE危機(jī)的結(jié)果，尤其是動物脂肪實際上不再被消費(fèi)者認(rèn)可作為原料。含有短鏈
和中長鏈脂肪酸的植物油并不容易獲得，或者產(chǎn)自熱帶地區(qū)。在此，生產(chǎn)的可持續(xù)性在許多情況下產(chǎn)生問題，這是由于它可能為了獲得耕種面積而破壞雨林。
[0003]此外，植物和動物的油和脂肪具有對相應(yīng)的原料特異但確定的脂肪酸范圍。因此進(jìn)行聯(lián)合生產(chǎn)，其可以確定具體脂肪酸種類的價格。此外，許多植物油同時也是食品，從而在某些情況下，作為原料物質(zhì)的用途和作為食品的用途之間可能出現(xiàn)競爭。
[0004]這是為何存在尋找脂肪酸可選來源和生產(chǎn)途徑的原因，因此目前正在將巨大的研究努力投入到例如藻類中，但還尤其在重組微生物例如酵母和細(xì)菌中的脂肪酸生產(chǎn)中。
[0005]盡管正在開發(fā)一系列技術(shù)用于從可再生原料(尤其是碳水化合物)中生產(chǎn)基于脂肪酸的動力燃料和化學(xué)品，但所實現(xiàn)的產(chǎn)量對于有意義的商業(yè)利用而言仍是太低。
[0006]本發(fā)明的目的是提供用于更高產(chǎn)地生產(chǎn)有機(jī)化合物的生物方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]令人驚奇的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在生產(chǎn)用微生物中共表達(dá)alkL基因產(chǎn)物(所述共表達(dá)在下文中描述)能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的目的。
[0008]本發(fā)明的主題因此是合成有機(jī)物質(zhì)并且以更高水平表達(dá)alkL的微生物。
[0009]本發(fā)明進(jìn)一步的主題是上述微生物用于生產(chǎn)有機(jī)物質(zhì)的用途，以及使用所述微生物生產(chǎn)有機(jī)物質(zhì)的方法。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是生產(chǎn)方法中的產(chǎn)物抑制能夠大大降低。
[0011]進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)是相比于不表達(dá)alkL或表達(dá)較低的alkL的微生物,所述方法的時
空產(chǎn)率和碳產(chǎn)量增加。
[0012]本發(fā)明的另一個優(yōu)點(diǎn)是培養(yǎng)上清液中產(chǎn)物濃度增加，從而有效地簡化后處理。
[0013]除非另有說明，所有百分比表示的(％)均未質(zhì)量百分比。
[0014]本發(fā)明包括用于產(chǎn)生重組微生物細(xì)胞的方法，該細(xì)胞能夠從不相關(guān)的碳源生產(chǎn)有機(jī)物質(zhì)，諸如羧酸和羧酸衍生物，例如，羧酸酯、烷烴、烷-1-醇類、烷-1-醛類、烷-1-胺類和1-稀經(jīng)。
[0015]本發(fā)明因此包括微生物，其包括第一種遺傳修飾，從而使它與它的野生型相比能夠從至少一種簡單碳源形成更多的有機(jī)物質(zhì)，其特征在于所述微生物包括第二種遺傳修飾，從而使它與它的野生型相比產(chǎn)生更多的alkL基因產(chǎn)物。
[0016]在本發(fā)明的上下文中，將表不方式“第一種遺傳修飾”理解為表不微生物的至少一種遺傳修飾，其中一種或多種基因與野生型菌株相比在它們的表達(dá)上已經(jīng)被修飾，即增加或降低。
[0017]在本發(fā)明的上下文中，將表達(dá)方式“簡單碳源”理解為表示這樣的碳源，其中在碳骨架上，至少一個C-C鍵必須被破壞并且/或者所述簡單碳源的至少一個碳原子必須與另一分子的至少一個碳原子形成至少一個新的鍵，從而獲得“更多形成的有機(jī)物質(zhì)”的碳骨架。
[0018]在本發(fā)明的上下文中，將表達(dá)方式“alkL基因產(chǎn)物”理解為表示滿足以下兩種條件中至少一種的蛋白:
1.)將蛋白鑒定為OmpW蛋白超家族的成員(在NationalCentre for BiotechnologyInformation (NCBI)的 Conserved Domain Database (CDD)中為蛋白家族 3922)，該指定由蛋白的氨基酸序列與已經(jīng)于2010年03月22日保存的NCBI⑶D中存在的數(shù)據(jù)庫條目比對，并使用標(biāo)準(zhǔn)檢索參數(shù)、低于0.01的E值并使用算法“blastp 2.2.23+”來完成，
2.)在通過RPS-BLAST在NCBI⑶D(版本2.20)中的包含于目標(biāo)氨基酸序列中的保守蛋白結(jié)構(gòu)域的檢索中，確定具有低于I X 10_5的E值的保守結(jié)構(gòu)域“OmpW，外膜蛋白W”(C0G3047)的存在(結(jié)構(gòu)域命中)。
[0019]本發(fā)明優(yōu)選的有機(jī)物質(zhì)是具有多于一個，尤其是3-36個、優(yōu)選6-24個、尤其是10-18個碳原子的那些。有機(jī)物質(zhì)可以是線性的、支鏈的、飽和的或不飽和的，并且任選由其它基團(tuán)所取代。
[0020]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選所述有機(jī)物質(zhì)選自包含以下，優(yōu)選由其組成的組:
羧酸，其尤其是具有3-34個、優(yōu)選具有6-22個、尤其優(yōu)選具有6-18個碳原子；
羧酸酯，其在羧酸部分中尤其具有3-34個、優(yōu)選具有6-22個、尤其優(yōu)選具有6-18個碳原子，其中醇部分來源于甲醇、乙醇或其它具有3-18個碳原子的伯醇，尤其是來自甲醇和乙醇；
烷烴，其具有3-34個、優(yōu)選具有6-22個、尤其優(yōu)選具有6-18個碳原子；
烯烴，其具有3-34個、優(yōu)選具有6-22個、尤其優(yōu)選具有6-18個碳原子；
一元醇，其具有3-34個、優(yōu)選具有6-22個、尤其優(yōu)選具有6-18個碳原子；
醛類，其具有3-34個、優(yōu)選具有6-22個、尤其優(yōu)選具有6-18個碳原子；
一元胺，其具有3-34個、優(yōu)選具有6-22個、尤其優(yōu)選具有6-18個碳原子；
和上述基團(tuán)成員的取代化合物，尤其是攜帶有一個或多個羥基_、胺_、酮_、羧基_、甲基-、乙基-、環(huán)丙基或環(huán)氧基官能作為進(jìn)一步取代基的那些，優(yōu)選未取代的。
[0021] 尤其優(yōu)選的有機(jī)物質(zhì)是脂肪酸、脂肪酸酯、烷-1-醛類、烷-1-醇類和烷-1-胺類、烷烴和烯烴，尤其是1-烯烴，其中上述化合物中的酯優(yōu)選是其中醇部分來源于甲醇、乙醇或其它具有3-18個碳原子的伯醇，尤其是來自甲醇和乙醇的那些。
[0022]有機(jī)物質(zhì)尤其優(yōu)選選自脂肪酸和脂肪酸酯中，其中所述脂肪酸組分選自甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸、肉豆蘧酸、十五烷酸、棕櫚酸、十七烷酸、硬脂酸、十九烷酸、花生酸、山崳酸、二十四烷酸、蠟酸、褐煤酸、蜂花酸、十一碳烯酸、肉豆蘧腦酸、棕櫚油酸、巖芹酸、油酸、反油酸、異油酸、順二十碳-9-烯酸、二十碳烯酸、鯨蠟烯酸、芥酸、神經(jīng)酸、壬酸、亞油酸、α -亞麻酸、Y -亞麻酸、金蓋花素酸、石榴酸、α -桐酸、桐酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、斑鳩菊酸、蓖麻油酸
和
它們的衍生物，以對應(yīng)于烷-1-醛、烷-1-醇和烷-1-胺的形式，或在不飽和脂肪酸的情況下，例如，棕櫚油酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸、Y-亞麻酸，以及烷-1-醛、烷-1-醇、烷-1-胺、通過酶促還原和脫羰從上述脂肪酸制備的烷烴和烯烴，和通過酶促脫羧從上述脂肪酸制備的烯，尤其是1-烯，任選可以具有進(jìn)一步的非末端雙鍵。
[0023]在本上下文中，將表達(dá)方式“對應(yīng)的烷/烯-1-化合物”理解為表示所討論的脂肪酸的羧基被-C0H、-CH2OH或-CH2NH2所取代。
[0024]在本發(fā)明的上下文中，如果以下文本將描述催化直接或間接涉及烷酸、烷-1-醛、焼-1-醇或焼-1-胺的反應(yīng)的酶活性，則認(rèn)為，額外具有一個或多個非末端雙鍵的焼酸、烷-1-醛、烷-1-醇或烷-1-胺通常包括在上述酶活性中。
[0025]可以將 碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉、纖維素和半纖維素，還有甘油或最簡單的有機(jī)分子諸如co2、co或合成氣體用作碳源。
[0026]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的是，由于優(yōu)良的遺傳可達(dá)性，使用選自細(xì)菌的微生物，尤其選自包含以下，優(yōu)選由其組成的組:磁球菌屬(Magnetococcus\深海菌屬
【權(quán)利要求】
1.微生物，其包括第一種遺傳修飾，從而使它與它的野生型相比，能夠從至少一種簡單碳源形成更多的有機(jī)物質(zhì)，其特征在于所述微生物包括第二種遺傳修飾，從而使它與它的野生型相比形成更多的alkL基因產(chǎn)物。
2.權(quán)利要求1的微生物，其特征在于所述有機(jī)物質(zhì)選自包含下列的組: 羧酸，尤其具有3-34個碳原子， 羧酸酯，尤其在羧酸部分中具有3-34個碳原子，其中醇部分來源于甲醇、乙醇或其它具有3-18個碳原子的伯醇， 具有3-34個碳原子的烷烴， 具有3-34個碳原子的烯烴， 具有3-34個碳原子的一元醇， 具有3-34個碳原子的醛類， 具有3-34個碳原子的一兀胺， 和上述組成員的取代化合物，尤其是攜帶有一個或多個羥基_、胺_、酮基_、羧基_、甲基_、乙基_、環(huán)丙基-或環(huán)氧基官能作為進(jìn)一步取代基的那些。
3.權(quán)利要求1或2的微生物 ，其特征在于所述有機(jī)物質(zhì)選自脂肪酸、脂肪酸酯、烷-1-醛類、烷-1-醇類和烷-1-胺類、烷烴和烯烴，尤其是1-烯烴。
4.前述權(quán)利要求中至少一項的微生物，其特征在于所述alkL基因產(chǎn)物由來自革蘭氏陰性細(xì)菌的alkL基因所編碼，所述革蘭氏陰性細(xì)菌尤其來自于含有以下、優(yōu)選由其組成的組:假單胞菌屬種iPsGudomorms sp.)、固氮菌屬種(如0 tobacter sp.)、脫亞硫酸菌屬種iDesulfi tobacterium sp.)、伯克氏菌屬種iBurkholderia sp.)，優(yōu)選洋蔥伯克氏菌iBurkholderia cepacia )、黃色單胞菌屬種{Xanthomonas sp.)、紅桿菌屬種{Rhodobacter sp.)、青枯菌屬種(TfeJ1Sioflia sp.)、代爾夫特菌屬種 CZfe7/iia sp.)和立克次體屬種(/Picfcitsia sp.)> Oceanicaulis sp.、柄桿菌屬種(feWoAacier sp.)、海桿菌屬種(ifenioAacier sp.)和紅假單胞菌屬種sp.)，優(yōu)選惡臭假單胞菌 iPseudomonas pu tida \ Oceanicaulis alexandri1、7_Κ 油海桿菌(Marinobac teraquaeolei)，尤其是惡臭假單胞菌 GPol 和 Pl、Oceanicaulis alexandrii HTCC2633、柄桿菌種K31和水油海桿菌VT8。
5.前述權(quán)利要求中至少一項的微生物，其特征在于所述alkL基因產(chǎn)物選自: 由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.3編碼蛋白和 具有多肽序列 SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.30、SEQ ID N0.31、SEQ ID N0.32 和 SEQID N0.33的蛋白和 具有這樣的多肽序列的蛋白，其中相對于SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.30、SEQ ID N0.31、SEQ ID N0.32或SEQ ID N0.33多達(dá)60%的氨基酸殘基通過缺失、插入、取代或其組合而修飾，并且其仍具有至少50%的具有相應(yīng)的參考序列SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.30、SEQ ID N0.31、SEQ ID N0.32 或 SEQ ID N0.33 的蛋白的活性。
6.前述權(quán)利要求中至少一項的微生物，其特征在于它選自革蘭氏陰性細(xì)菌。
7.前述權(quán)利要求中至少一項的微生物，其特征在于所述第一種遺傳修飾是至少一種選自以下組的酶的活性
Ei ?；?ACP 硫酯酶，優(yōu)選 EC 3.1.2.14 或 EC 3.1.2.22 的，Eii ?；?CoA 硫酯酶，優(yōu)選 EC 3.L 2.2、EC 3.1.2.18、EC 3.1.2.19、EC 3.1.2.20 或EC 3.1.2.22 的， Eiib?；?CoA = ACP轉(zhuǎn)酰酶， Em聚酮合酶，其催化參與羧酸和羧酸酯的合成的反應(yīng)，和 Eiv己酸合酶， 所述活性相比于野生型微生物的酶活性增加。
8.前述權(quán)利要求中至少一項的微生物，其特征在于它包括第三種遺傳修飾，該修飾包含至少一種選自以下組的酶Eiib、Ev、Evi或Evii的活性 Eiib酰基-CoA = ACP轉(zhuǎn)酰酶， Ev蠟酯合酶或醇-O-酰基轉(zhuǎn)移酶，優(yōu)選EC 2.3.1.75或EC 2.3.1.84的， Eva脂肪酸-0-甲基轉(zhuǎn)移酶，優(yōu)選EC 2.1.1.15的，其催化從脂肪酸和S-腺苷甲硫氨酸合成脂肪酸甲酯， Evi?；?CoA合酶，優(yōu)選EC 6.2.1.3的，和
Eii ?；蝓ッ?，優(yōu)選 EC 3.1.2.2、EC 3.1.2.4、EC 3.1.2.18、EC 3.1.2.19、EC3.1.2.20 或 EC 3.1.2.22 的， 所述活性相比于野生型微生物的酶活性增加。
9.前述權(quán)利要求中至少一項的微生物，其特征在于它包括第四種遺傳修飾，該修飾包含至少一種選自以下組的酶Eiib、Ev、Evi或Evii的活性 Eiib?；?CoA = ACP轉(zhuǎn)酰酶， Evi酰基-Cok合酶，優(yōu)選EC 6.2.1.3的，
Eviii ?；?CoA 還原酶，優(yōu)選 EC 1.2.1.42 或 EC 1.2.1.50 的，
Eix 脂肪酸還原酶，優(yōu)選 EC 1.2.1.3、EC 1.2.1.20 或 EC 1.2.1.48 的， Ex?；?ACP還原酶，優(yōu)選EC 1.2.1.80的， Exi細(xì)胞色素Ρ450脂肪酸脫羧酶，其催化具有η個碳原子的烷酸轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的具有η-1個碳原子的末端烯烴，尤其是十二烷酸轉(zhuǎn)化為十一碳-?ο-烯酸， Exii烷-1-醛脫羰酶，其催化烷-1-醛(η個碳原子)轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的烷(η-l個碳原子)或末端烯烴(η-l個碳原子)，和 Exiii烷-1-醛轉(zhuǎn)氨酶，其催化烷-1-醛轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的烷-1-胺， 所述活性相比于野生型微生物的酶活性增加。
10.前述權(quán)利要求中至少一項的微生物，其特征在于除了所述第一種和第二種遺傳修飾之外，它包括第五種遺傳修飾，其包括至少一種選自以下組的酶的活性 Ea酰基-Cok合酶(EC 6.2.1.3),其催化?；?輔酶A硫酯的合成，
Eb ?；?CoA 脫氫酶(EC 1.3.99.-、EC 1.3.99.3 或 EC 1.3.99.13)，其催化?；?輔酶A硫酯的氧化以產(chǎn)生對應(yīng)的烯?；?輔酶A硫酯， Ec?；?CoA氧化酶(EC 1.3.3.6)，其催化?；?輔酶A硫酯的氧化以產(chǎn)生對應(yīng)的烯酰基-輔酶A硫酯， Ed烯?；?CoA水合酶(EC 4.2.1.17或EC 4.2.1.74)，其催化烯?；?輔酶A硫酯的水合以產(chǎn)生對應(yīng)的3-羥?；?輔酶A硫酯， Ef3-羥酰基-CoA脫氫酶(EC 1.1.1.35或EC 1.1.1.211)，其催化3-羥?；?輔酶A硫酯的氧化以產(chǎn)生對應(yīng)的3-氧代?；?輔酶A硫酯，和 Ef乙?；?CoA?；D(zhuǎn)移酶(EC 2.3.1.16)，其催化乙?；鶜埢鶑?-氧代酰基-輔酶A硫酯轉(zhuǎn)移至輔酶A，并因此生成縮短兩個碳原子的?；?輔酶A硫酯， 所述活性相比于野生型微生物的酶活性降低。
11.前述權(quán)利要求中至少一項的微生物，其特征在于它包括第七種遺傳修飾，該修飾包含至少一種選自以下組的酶E1的活性 E1 P450烷羥化酶，
Elb EC 1.14.15.3 的 AlkB 烷羥化酶， Elc EC 1.1.3.20的脂肪醇氧化酶， Eld EC 1.1.99.-的 AlkJ 醇脫氫酶， Ele EC 1.1.1.1或EC 1.1.1.2的醇脫氫酶和
Elf EC 1.2.1.3、EC 1.2.1.4 或 EC 1.2.1.5 的醛脫氫酶 所述活性相比于它的野生型降低。
12.前述權(quán)利要求中至少一項的微生物用于生產(chǎn)有機(jī)物質(zhì)的用途，所述有機(jī)物質(zhì)尤其是脂肪酸、脂肪酸酯、烷-1-醛類、烷-1-醇類和烷-1-胺類、烯-1-醛類、烯-1-醇類、烯-1-胺類、烷烴和烯烴，尤其是1-烯烴，其可以任選包括另外的雙鍵。
13.用于從簡單碳源生產(chǎn)有機(jī)物質(zhì)的方法，所述有機(jī)物質(zhì)優(yōu)選脂肪酸、脂肪酸酯、烷-1-醛類、烷-1-醇類和烷-1-胺類、烯-1-醛類、烯-1-醇類、烯-1-胺類、烷烴和烯烴，尤其是1-烯烴，其可以任選包括另外的雙鍵，所述方法包括以下方法步驟: I)將權(quán)利要求1-8中至少一項的微生物與包含所述簡單碳源的培養(yǎng)基接觸， II)將所述微生物在可以使所述微生物從所述簡單碳源形成有機(jī)物質(zhì)的條件下培養(yǎng)，和 III)任選分離所形成的有機(jī)物質(zhì)。
【文檔編號】C12N9/00GK103987727SQ201280050647
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2012年8月15日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月15日
【發(fā)明者】S.沙費(fèi)爾, J.吉倫, N.德克, N.基爾希納, T.哈斯, M.佩特, H.赫格 申請人:贏創(chuàng)德固賽有限公司