植物轉(zhuǎn)化方法
【專利摘要】本發(fā)明提供產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法。所述方法尤其包括以下步驟：a)提供包含下胚軸或其部分、至少一個(gè)子葉和損傷組織的損傷的可轉(zhuǎn)化外植體，b)轉(zhuǎn)化由所述外植體包含的細(xì)胞，和c)通過將所述外植體的下胚軸插入到所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基中來將所述外植體轉(zhuǎn)移到包含針對(duì)選擇標(biāo)記的至少一種選擇化合物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。此外，本發(fā)明提供通過本發(fā)明的方法獲得的植物。
【專利說明】植物轉(zhuǎn)化方法
[0001]
[0002]本發(fā)明涉及產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法。所述方法尤其包括以下步驟:a)提供包含下胚軸或其部分、至少一個(gè)子葉和損傷組織的損傷的可轉(zhuǎn)化外植體，b)轉(zhuǎn)化所述外植體包含的細(xì)胞，和c)將所述外植體轉(zhuǎn)移到包含針對(duì)選擇標(biāo)記的至少一種選擇化合物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基上。此外，本發(fā)明涉及通過本發(fā)明的方法可獲得的植物。
[0003]在1984年首次為煙草描述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化目前廣泛用于將基因?qū)胫参镏?，用于基礎(chǔ)研究以及產(chǎn)生商業(yè)使用的轉(zhuǎn)基因作物的目的。能夠成功轉(zhuǎn)化的植物包括大部分主要的經(jīng)濟(jì)作物、蔬菜、觀賞植物、藥用植物、水果、樹木和牧草植物。
[0004]植物轉(zhuǎn)化主要通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化來完成。農(nóng)桿菌是天然存在的病原土壤細(xì)菌，其能夠轉(zhuǎn)移DNA進(jìn)入植物細(xì)胞的基因組中。對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化，將目的基因置于農(nóng)桿菌T-DNA(轉(zhuǎn)移DNA)的左邊界和右邊界重復(fù)序列之間。隨后，使用合適的植物轉(zhuǎn)化方案(對(duì)于綜述參見 Gelvin，2003Microbiol Mol Biol Rev.67(1):16-37)將含有目的基因的T-DNA區(qū)穩(wěn)定整合到植物基因組中。
[0005]除了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化之外，還存在其他植物轉(zhuǎn)化方法，如病毒轉(zhuǎn)化、植物原生質(zhì)體的電穿孔和粒子轟擊。
[0006]—般而言，植物轉(zhuǎn)化技術(shù)基于相同的原理。在第一步中，將目的基因?qū)牒线m的轉(zhuǎn)化載體中。隨后將攜帶有目的基因的轉(zhuǎn)化載體導(dǎo)入目標(biāo)植物的再生細(xì)胞中。由于僅有一小部分的目標(biāo)細(xì)胞接受了目的基因，因此在大`量過量的未轉(zhuǎn)化細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的選擇。此外，一旦已經(jīng)將目的基因穩(wěn)定導(dǎo)入宿主細(xì)胞的基因組中，那么確定再生條件以從單個(gè)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生完整植株至關(guān)重要(參見例如Birch，1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mo1.Biol.48:297-326)。
[0007]最簡(jiǎn)單可用的基于農(nóng)桿菌的植物轉(zhuǎn)化方法之一是“浸花轉(zhuǎn)化”。浸花是種系轉(zhuǎn)化方法，通過所述方法可以將目的基因轉(zhuǎn)化到產(chǎn)生種子的細(xì)胞中。該方法涉及在農(nóng)桿菌細(xì)胞的懸浮液中浸泡植物(開花早期階段)(Clough和Bent, 1998，Plant J16:735-43)。浸泡后幾周，收集浸泡植物的種子，并選擇轉(zhuǎn)化體的種子群體。浸花轉(zhuǎn)化技術(shù)的優(yōu)勢(shì)是它避免使用成本密集并需要受過訓(xùn)練的工作人員的組織培養(yǎng)和植物再生。不幸的是，小的植物尺寸、短的世代時(shí)間以及每株植物大量的種子是用于浸花的必要條件。因此，該轉(zhuǎn)化方法僅僅成功地應(yīng)用于少數(shù)物種，主要用于擬南芥(Arabidopsis thaliana)(但還有蔡藜苜猜(Medicagotruncatula)和蕓苔(Brassica),參見 Wang 等 2003.Plant Cell Reports22:274-281)。
[0008]認(rèn)為難以進(jìn)行種系轉(zhuǎn)化的完整轉(zhuǎn)化植物的再生是植物轉(zhuǎn)化中的瓶頸，這是由于再生難以實(shí)現(xiàn)，耗時(shí)并且需要特殊設(shè)備。
[0009]植物再生的第一步通常在體外條件下進(jìn)行，即在無菌條件下的特殊營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上。轉(zhuǎn)化目標(biāo)細(xì)胞后，通過特定的植物激素誘導(dǎo)細(xì)胞分裂，以從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中生長(zhǎng)出愈傷組織。愈傷組織誘導(dǎo)后，將所獲的愈傷組織轉(zhuǎn)移到允許枝條誘導(dǎo)的培養(yǎng)基上。將愈傷組織在所述培養(yǎng)基上培養(yǎng)(在體外條件下)直至形成枝條。枝條形成后，將枝條轉(zhuǎn)移到允許根形成的培養(yǎng)基上(在體外條件下)。根形成后，一般將再生的小植株(即具有根的枝條)從體外條件轉(zhuǎn)移到離體(ex vitro)條件下，主要轉(zhuǎn)移到溫室條件下的土壤中。因此，愈傷組織誘導(dǎo)、枝條誘導(dǎo)和根誘導(dǎo)一般均在體外條件下進(jìn)行。
[0010]然而，體外條件下再生植物的當(dāng)前方法具有一些缺點(diǎn)。在體外條件下再生完整植物花費(fèi)高，并且需要特殊的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、特殊的設(shè)備和受過訓(xùn)練的工作人員。當(dāng)然，常常存在污染的風(fēng)險(xiǎn)(例如，真菌污染)。如果組織培養(yǎng)受到污染，數(shù)周或甚至數(shù)月的工作可能都會(huì)前功盡棄。
[0011]然而，不采用組織培養(yǎng)，植物轉(zhuǎn)化是有挑戰(zhàn)的，這是由于組織培養(yǎng)
[0012]a)允許分別選擇轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞(和植物枝條)并且
[0013]b)同時(shí)抑制了細(xì)菌和真菌微生物的生長(zhǎng)。不進(jìn)行選擇的話，難以鑒定攜帶轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞、植物枝條或小植株(即具有枝條和根的植物)。
[0014]此外，轉(zhuǎn)基因植物的再生一般是耗力并且非常耗時(shí)的工作。例如，從假定的轉(zhuǎn)基因體外蕓苔或短柄草(Brachypodium)枝條到離體適應(yīng)的、適合溫室的植物的分離所需時(shí)間為12周至14周(對(duì)于短柄草例如參見:Bablak等(1995)Plant Cell, Tissue and OrganCulture42:97-107 ;或 Christiansen 等(2005)Plant Cell Report23:751-758 ;對(duì)于蕓苔:Cardoza 和 Stewart (2004), Transgenic cropsOf the World-Essential Protocols,379-387 ;或 Jonoubi 等(2005).Biologia Plantarum49 (2):175-180)。
[0015]避免組織培養(yǎng)或減少組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化程序?qū)⑹怯袃r(jià)值的，尤其對(duì)難以再生的植物而言?？蒲腥藛T已經(jīng)嘗試開發(fā)不需要組織培養(yǎng)的植物轉(zhuǎn)化程序，但這些嘗試僅獲得了有限的成功。例如，Graves和Goldman(1986PlantMol.Biol.7:43-50)報(bào)道了農(nóng)桿菌可以感染萌發(fā)的玉米種子的中胚軸細(xì)胞，但所獲的轉(zhuǎn)化植物為嵌合體并且轉(zhuǎn)化效率極低。
[0016]大?(大? (Glycine max))屬于?科(Fabaceae) ( ?科(Leguminosae))。將該植物科被鑒定為它的種子長(zhǎng)在 豆莢中(莢果)。認(rèn)為大豆起源于中國(guó)。野生型大豆在自然界中是葡萄樹樣的(viny)，這可能是為何大豆首先作為干草作物被引進(jìn)美國(guó)的主要原因。從中國(guó)、中國(guó)東北(Manchuria)、韓國(guó)和日本引進(jìn)對(duì)于美國(guó)開發(fā)變種是重要的。改善農(nóng)藝性狀的現(xiàn)代育種努力，如更直立的生長(zhǎng)、降低倒伏和提高的種子大小已經(jīng)在將大豆開發(fā)成為世界重要的作物中起了主要作用。收獲谷物的作物的栽培面積和比例穩(wěn)步增長(zhǎng)，并且如今大豆成為主要的世界性商品。
[0017]關(guān)于大豆轉(zhuǎn)化，基于體細(xì)胞胚胎發(fā)生的方法是已知的:通過將外植體置于高水平的2，4-D(40mg / L)上從未成熟的大豆子葉上誘導(dǎo)胚，并且胚胎發(fā)生組織隨后在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(Finer (1988)Plant Cell R印7:238-241)或液體懸浮培養(yǎng)(Finer和Nagasawa(1988)Plant Cell Tissue Organ Cultl5: 125-136)中增殖。
[0018]Hinchee等描述了經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因大豆植物。轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生基于其中在大豆子葉上誘導(dǎo)枝條器官發(fā)生的再生方案(參見Hinchee等(1988)NatureBiotechnology, 6:915-922)。
[0019]還已知的是基于合子未成熟子葉的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法(Parrott等(1989)Plant Cell R印7:615-617 ;Yan 等(2000)Plant Cell Repl9:1090-1097 ;Ko 等(2003)Theor Appl Genet.107:439-447)。然而,在Parrott等中，從多細(xì)胞來源產(chǎn)生的三種植物是嵌合的并且不能將轉(zhuǎn)基因傳遞到下一代。Yan等(2000)Plant Cell Rep19:1090-1097報(bào)道了 0.03%的低轉(zhuǎn)化頻率。所產(chǎn)生的植物將轉(zhuǎn)基因傳遞到下一代，這推測(cè)是由于連續(xù)選擇轉(zhuǎn)化的初生胚用于產(chǎn)生次生胚，由此產(chǎn)生非嵌合植物的緣故。目前，Ko等(2003)TheorApplGenet.107:439-447已經(jīng)報(bào)道了 1.7%轉(zhuǎn)化頻率的轉(zhuǎn)基因植物的重獲，然而，該方法依賴于使用部分可卸甲的(致瘤的)農(nóng)桿菌菌株P(guān)KYRT (其具有功能性的TR-DNA序列)，以刺激胚胎發(fā)生(Ko等(2004)Planta218:536-541)。這些方法使用未成熟的子葉作為目標(biāo)組織，隨后在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖和選擇。
[0020]US2009 / 0049567公開了利用初生葉節(jié)或更高葉節(jié)的分生細(xì)胞作為目標(biāo)組織的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆轉(zhuǎn)化和所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞隨后再生成完整植株。
[0021]CN101736028A描述了通過轉(zhuǎn)化子葉節(jié)而不依賴于組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化大豆的方法。在體外或田地中萌發(fā)大豆種子。5-7天后，從幼苗上取下頂端分生組織和分生組織。隨后通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來轉(zhuǎn)化子葉節(jié)區(qū)域。10-15天后，用選擇化合物刷葉片。然而，所公開的方法僅產(chǎn)生相對(duì)少量的轉(zhuǎn)基因植物(例如轉(zhuǎn)化127株幼苗，僅獲得8株轉(zhuǎn)基因植物)。
[0022]Weeks 等(Transgenic Research (2008), 17, 587-597)公開了用于轉(zhuǎn)化苜猜植物的方法。為了轉(zhuǎn)化，在頂端節(jié)點(diǎn)處切割幼苗并在含有研磨介質(zhì)的農(nóng)桿菌懸浮液中劇烈渦旋。在所述方法中沒有使用選擇標(biāo)記基因。因此，通過PCR和/或組織化學(xué)分析監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)化。然而，大量再生植物是嵌合的。
[0023]WOOO / 56904描述了用于在棉花、咖啡、可可、香蕉或葡萄植物中選擇轉(zhuǎn)基因分生組織細(xì)胞的方法和隨后轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生。該方法包括以下步驟:將外源基因?qū)朊藁?、咖啡、可可、香蕉或葡萄植物的胚軸頂端分生組織的細(xì)胞或含有所述植物分生組織的組織或器官中；通過在包含多枝條誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)它們的胚軸或含有分生組織的組織來誘導(dǎo)在前述步驟中改變的頂端分生組織區(qū)中細(xì)胞的多發(fā)枝條；和通過在含有易位并富集于棉花、咖啡、可可、香蕉或葡萄植物的胚軸頂端分生組織中的分子的培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)所述分生組織來選擇頂端區(qū)域的轉(zhuǎn)基因分生組織細(xì)胞。
[0024]W099 / 18223公開`了用于產(chǎn)生含有外源DNA的轉(zhuǎn)基因豆科植物的方法，其包括以下步驟:通過生物彈道(biobalistic)方法將外源基因?qū)攵箍浦参锏呐咻S頂端分生組織的細(xì)胞中；通過在含有多發(fā)枝條誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)它們的胚軸來誘導(dǎo)在前述步驟中改變的頂端分生組織區(qū)中細(xì)胞的多發(fā)枝條；和選擇通過在含有富集于所述豆科植物胚的頂端分生組織區(qū)中的分子的培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)而轉(zhuǎn)化的頂端區(qū)的分生組織細(xì)胞。
[0025]Aragao等公開了通過生物射彈轉(zhuǎn)化對(duì)菜豆(Phaseolus vulgaris)的轉(zhuǎn)化(AragSo FJL, Barros LMC, Brasileiro ACM, Ribeiro S G，Smith FD, Sanford JC,Faria JC,Rech EL (1996)Inheritance of foreign genes in transgenic bean (Phaseolusvulgaris L.)co-transformed via particle bombardment.Theor.Appl.Genet.93:142-150.)。在其他文獻(xiàn)中，Aragao描述了獲得高頻率可育轉(zhuǎn)基因大豆植物的方法(AragSo FJL, Sarokin L, Vianna GR, Rech EL (2000) Selection of transgenicmeristematic cells utilizing an herbicidal molecule results in the recoveryof fertile transgenic soybean[Glycine max(L.)MerriI]plants at high frequency.Theor.Appl.Genet.101:1-6)。
[0026]W097 / 23126公開了用于微繁殖木本植物的枝條、生根的枝條或幼苗的方法，其包括在含氧液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述枝條、生根的枝條或幼苗，其中所述枝條、生根的枝條或幼苗浸沒在液體培養(yǎng)基中。[0027]W09407356公開了利用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)轉(zhuǎn)化蘋果類果實(shí)幼芽(pomaceous fruit scion)或根莖品種的方法。
[0028]盡管已經(jīng)在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法領(lǐng)域中獲得了顯著進(jìn)步，但仍然存在對(duì)改進(jìn)方法的需要，以促進(jìn)該方法用于轉(zhuǎn)化植物的便利、速度和效率。因此，本發(fā)明的目標(biāo)是在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因大豆植物的方法中提供具有更高的整體效率的改進(jìn)方法。通過本發(fā)明來解決該目標(biāo)。
[0029]因此，本發(fā)明涉及產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括以下步驟:
[0030]a)提供損傷的可轉(zhuǎn)化外植體，其包含下胚軸或其部分、至少一個(gè)子葉，和選自以下的損傷組織:
[0031]1.初生葉節(jié)或更高葉節(jié)的損傷的分生組織(尤其是初生葉節(jié)或更高葉節(jié)的損傷的腋生分生組織)，
[0032]i1.子葉節(jié)的損傷的分生組織，和
[0033]ii1.損傷的上胚軸組織
[0034]b)利用包含選擇標(biāo)記基因的至少一個(gè)植物表達(dá)盒的多核苷酸轉(zhuǎn)化所述外植體所包含的細(xì)胞，
[0035]c)通過將所述外植體的下胚軸或其部分插入到所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基中來將所述外植體轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基包含針對(duì)所述選擇標(biāo)記基因的至少一種選擇化合物，
[0036]d)允許所述外植體形成枝條，和/或允許該枝條伸長(zhǎng)，所述枝條包含含有所述選擇標(biāo)記基因的至少一個(gè) 植物表達(dá)盒的植物細(xì)胞，和
[0037]e)從所述枝條再生轉(zhuǎn)基因植物。
[0038]在本發(fā)明方法的上下文中，應(yīng)該產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因的”優(yōu)選指已經(jīng)引入了外源DNA序列的細(xì)胞或植物。優(yōu)選地，所述外源DNA序列穩(wěn)定引入到轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞的基因組中。優(yōu)選地，所述外源DNA序列包含至少一個(gè)多核苷酸，其包含選擇標(biāo)記基因的至少一個(gè)植物表達(dá)盒。優(yōu)選地，通過允許所述基因在植物中表達(dá)的啟動(dòng)子來調(diào)節(jié)選擇標(biāo)記基因的表達(dá)。此類啟動(dòng)子為本領(lǐng)域所熟知，并優(yōu)選包括組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子和發(fā)育特異性啟動(dòng)子。優(yōu)選的啟動(dòng)子例如公開于US2009 /0049567中，在此完整引入作為參考。用于表達(dá)選擇標(biāo)記基因的最優(yōu)選啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。
[0039]優(yōu)選地，包含選擇標(biāo)記基因的至少一個(gè)植物表達(dá)盒的至少一個(gè)多核苷酸通常不存在于植物或植物細(xì)胞中，或通常存在于植物或植物細(xì)胞基因組中的不同位置上。優(yōu)選地，包含選擇標(biāo)記基因的至少一個(gè)植物表達(dá)盒的多核苷酸還包含有價(jià)值的農(nóng)藝性狀的植物表達(dá)盒。
[0040]待轉(zhuǎn)化的植物可以是單子葉植物。最優(yōu)選地，待轉(zhuǎn)化的植物是雙子葉植物。
[0041]優(yōu)選地，所述雙子葉植物是豆科、爺科(Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、黎科(Chenopodiaceae)、菊科(Asteraceae)、錦奏科(Malvaceae)、亞麻科(Linacea)、大戟科(Euphorbiaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、蓄蔽科(Rosaceae)、葫蘆科(Cucurbitaceae)、山茶科(Theaceae)、菌草科(Rubiaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)或相桔科(Citrus)。尤其優(yōu)選地，所述植物是豆科、茄科或十字花科。[0042]如果所述植物是豆科植物，那么該植物優(yōu)選是大豆屬(Glycine)、豌豆屬(Pisum)、落花生屬(Arachis)、鷹嘴豆屬(Cicer)、蠶豆屬(Vicia)、菜豆屬(Phaseolus)、羽扇豆屬(Lupinus)、苜猜屬(Medicago)或兵豆屬(Lens)。豆科的優(yōu)選物種是蔡藜苜猜(Medicago truncatula)、紫花苜猜(Medicago sativa)、大豆、野生大豆(Glycine soia)、豌豆(Pisum sativum) > Archis hypogea、鷹嘴豆(Cicer arietinum)、香豆(Vicia fab a)、菜豆、尖葉菜豆(Phaseolus acutifolius)、白羽扇豆(Lupinus albus)、黃羽扇豆(LupinusIuteus)、藍(lán)羽扇豆(Lupinus angustifolius)或小扁豆(Lens culinaris)。更優(yōu)選的是大豆、Archis hypogea和紫花苜蓿。最優(yōu)選的物種是大豆。大豆的優(yōu)選表型是用于實(shí)施例中的表型。
[0043]當(dāng)所述植物是爺科時(shí),優(yōu)選的屬是爺屬(Solanum)、番爺屬(Lycopersicon)、煙草屬(Nicotiana)或辣椒屬(Capsicum)。爺科的優(yōu)選物種是馬鈴薯(S.tuberosum)、番爺(L.esculentum)(還稱為番爺爺(Solanum Iycopersicon))、煙草(N.tabaccum)或黃燈籠辣椒(C.chinense)。更優(yōu)選的是馬鈴薯。
[0044]當(dāng)所述植物是藜科植物時(shí),優(yōu)選屬是Beta或菠菜(Spinacia)。優(yōu)選物種是甜菜(B.vulgaris)和疲菜(S.0leracea)。
[0045]當(dāng)所述植物是菊科植物時(shí)，優(yōu)選屬是向日葵屬(Helianthus),優(yōu)選物種是向日葵(H.annuus)。 [0046]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述植物是十字花科。如果所述植物是十字花科，那么該植物優(yōu)選是蕓苔屬(Brassica)或蘿卜屬(Raphanus)。蕓苔屬的優(yōu)選物種是歐洲油菜(B.napus)、甘藍(lán)(B.0leracea)、芥菜(B.Juncea)或蕪青(B.rapa)。最優(yōu)選的是歐洲油菜物種。
[0047]當(dāng)所述植物是錦葵科植物時(shí)，優(yōu)選屬是棉屬(Gossypium)或秋葵屬(Abelmoschus)。當(dāng)所述屬是棉屬時(shí)，優(yōu)選物種是陸地棉(G.hirsutum)或海島棉(G.barbadense)。最優(yōu)選的物種是陸地棉。秋葵屬的優(yōu)選物種是咖啡黃葵(A.esculentus)。
[0048]當(dāng)所述植物是亞麻科時(shí)，優(yōu)選屬是亞麻屬(Linum)。優(yōu)選物種是亞麻(L.usitatissimum)。
[0049]當(dāng)所述植物是大戟科植物時(shí)，優(yōu)選屬是木薯屬(Manihot)、麻風(fēng)樹屬(Jatropa)或蓖麻屬(Rhizinus),并且優(yōu)選物種是木薯(M.esculenta)、麻風(fēng)樹(J.curcas)或蓖麻(R.communis)。
[0050]當(dāng)所述植物是旋花科植物時(shí)，優(yōu)選屬是番薯屬(Ipomea)。優(yōu)選物種是甘薯(L.batatas)。
[0051]尤其優(yōu)選的植物物種是蒺藜苜蓿、紫花苜蓿、大豆、野生大豆、豌豆、Archishypogea、鷹嘴豆、白羽扇豆、黃羽扇豆、藍(lán)羽扇豆、尖葉菜豆和菜豆。更優(yōu)選的物種是大豆、Archis hypogeal和菜豆以及紫花苜猜。最優(yōu)選的物種是大豆。
[0052]待用于本發(fā)明方法中的損傷的可轉(zhuǎn)化外植體應(yīng)該包含至少一個(gè)子葉，和選自以下的損傷組織:初生葉節(jié)或更高葉節(jié)的損傷的分生組織、子葉節(jié)的損傷的分生組織，和損傷的上胚軸組織。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，損傷的可轉(zhuǎn)化外植體還包含下胚軸或其部分。
[0053]在本發(fā)明方法的上下文中，所述損傷的可轉(zhuǎn)化外植體優(yōu)選來自幼苗或從幼苗獲得。[0054]優(yōu)選地，所述幼苗是3-20天齡的幼苗。更優(yōu)選地，所述幼苗是5-12天齡的幼苗。甚至更優(yōu)選地，它是4-12天齡的幼苗，或6-10天齡的幼苗。最優(yōu)選地，所述幼苗是7-8天齡的幼苗。優(yōu)選地，從幼苗萌發(fā)開始計(jì)算幼苗的年齡。
[0055]應(yīng)該特別考慮幼苗在體外條件，即元菌條件下生長(zhǎng)。然而，還應(yīng)考慮所述幼苗在非無菌條件下生長(zhǎng)。
[0056]在本發(fā)明方法的上下文中，優(yōu)選通過在i)初生葉節(jié)或更高葉節(jié)的分生組織，ii)子葉節(jié)的分生組織，或iii)上胚軸區(qū)中使所述幼苗受到損傷來從幼苗獲得損傷的可轉(zhuǎn)化外植體。優(yōu)選地，所述損傷組織是轉(zhuǎn)化的目標(biāo)組織，即利用包含選擇標(biāo)記基因的至少一個(gè)植物表達(dá)盒的多核苷酸轉(zhuǎn)化該目標(biāo)組織包含的細(xì)胞。
[0057]因此，如果子葉節(jié)的分生組織受到損傷，那么目標(biāo)組織是子葉節(jié)的分生組織。如果初生葉節(jié)或更高葉節(jié)的分生組織受到損傷，那么目標(biāo)組織是初生葉節(jié)或更高葉節(jié)的分生組織。如果上胚軸組織受到損傷，那么目標(biāo)組織是上胚軸組織，優(yōu)選其中上胚軸組織已經(jīng)受到損傷的組織。
[0058]術(shù)語(yǔ)“分生組織細(xì)胞”或“分生組織”為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。該術(shù)語(yǔ)優(yōu)選指連續(xù)分裂并形成細(xì)胞的未分化植物細(xì)胞或組織。
[0059]優(yōu)選地，初生葉節(jié)或更高葉節(jié)的損傷的分生組織是損傷的頂端分生組織。更優(yōu)選地，初生葉節(jié)或更高葉節(jié)的損傷的分生組織是損傷的腋生分生組織。因此，目標(biāo)組織優(yōu)選為初生葉節(jié)或更高葉節(jié)的腋生分生組織。
[0060]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“上胚軸”優(yōu)選指定位在子葉節(jié)和初生葉節(jié)之間的植物部分。
[0061]可以使用許多損傷方法。優(yōu)選方法為切割、打磨、穿孔、戳刺、利用精細(xì)顆?；蚣訅阂后w的穿透、等離子損傷、應(yīng)用高壓壓力或超聲?？梢允褂梦矬w，如手術(shù)刀、剪刀、針、磨砂物體、顆粒、電基因槍或聲波進(jìn)行損傷。
[0062]在本發(fā)明方法的上下文中，優(yōu)選通過在i)子葉節(jié)的分生組織，ii)上胚軸區(qū)，或iii)初生葉節(jié)或更高葉節(jié)的分生組織處切割幼苗完成損傷(根據(jù)目標(biāo)組織)。更優(yōu)選地，通過在子葉節(jié)的分生組織處、上胚軸區(qū)內(nèi)，或初生葉節(jié)或更高葉節(jié)的分生組織內(nèi)切開(decapitate)所述幼苗來完成所述損傷。
[0063]切口下面的植物部分用作可轉(zhuǎn)化外植體。因此，優(yōu)選去除定位在切口上面的幼苗部分。
[0064]此外，還特別設(shè)想從所述幼苗去除以下部分，以獲得損傷的可轉(zhuǎn)化外植體:
[0065]1.根，
[0066]i1.根和下胚軸部分，
[0067]ii1.如果從雙子葉植物(其為最優(yōu)選的植物)制備所述外植體，那么優(yōu)選去除一個(gè)子葉。`
[0068]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“下胚軸”優(yōu)選指子葉和根之間的幼苗部分。下胚軸或其部分的使用是有利的，因?yàn)榭梢栽诒景l(fā)明方法的步驟c)將該下胚軸插入到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。由此，外植體可以更好地保持向上的位置上。
[0069]特別優(yōu)選至少三分之二的下胚軸，并更優(yōu)選至少三分之一，或甚至更優(yōu)選十分之一的下胚軸(如幼苗所包含的)保持附著在損傷的可轉(zhuǎn)化外植體上。甚至更優(yōu)選地，0.5-2cm或0.5-lcm的下胚軸保持附著在外植體上。還考慮0.l_2cm的下胚軸保持附著在外植體上。
[0070]因此，所述損傷的可轉(zhuǎn)化外植體包含的下胚軸部分優(yōu)選包含至少三分之二、至少三分之一，或至少十分之一的下胚軸(如幼苗所包含的)。所述部分還優(yōu)選包含0.5-2cm、0.5-lcm或0.l-2cm的下胚軸(如幼苗所包含的)。此外，還應(yīng)設(shè)想下胚軸部分少于三分之一、少于四分之一，或特別少于十分之一的下胚軸(如幼苗所包含的)。因此，下胚軸部分優(yōu)選具有至少0.2,0.4或0.5cm的長(zhǎng)度。然而，如果目標(biāo)組織是初生葉節(jié)或更高葉節(jié)的損失的分生組織，那么可以從植物中完全去除下胚軸。在這種情況下，待轉(zhuǎn)化的外植體不包含下胚軸組織。
[0071]優(yōu)選地，如果所述幼苗在子葉節(jié)的分生組織處受到損傷(例如通過切割或切開)，那么子葉節(jié)的分生組織或其部分保持附著在可轉(zhuǎn)化外植體上。
[0072]因此，在本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，來自幼苗的損傷的可轉(zhuǎn)化外植體包含:
[0073]1.下胚軸或其部分，
[0074]i1.至少一個(gè)子葉，
[0075]ii1.子葉節(jié)的損傷的分生組織。
[0076]優(yōu)選地，如果所述幼苗在上胚軸處受傷(例如通過切割或切開，見上文)，那么損傷的上胚軸部分保持附著在可轉(zhuǎn)化外植體上。所述上胚軸可以在任何位置處受到損傷。
[0077]因此，在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，來自幼苗的損傷的可轉(zhuǎn)化外植體包含:
[0078]1.下胚軸或其部分，
[0079]i1.至少一個(gè)子葉,和
[0080]ii1.損傷的上胚軸組織。
[0081]優(yōu)選地，如果所述幼苗在初生葉節(jié)或更高葉節(jié)的分生組織處受傷，那么損傷組織部分附著在可轉(zhuǎn)化外植體上。
[0082]因此，在本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，來自幼苗的損傷的可轉(zhuǎn)化外植體包含:
[0083]1.下胚軸或其部分，
[0084]i1.至少一個(gè)子葉，
[0085]ii1.上胚軸，和
[0086]iv.初生葉節(jié)或更高葉節(jié)的損傷的分生組織。
[0087]在本發(fā)明方法的步驟b)中，應(yīng)該用包含選擇標(biāo)記基因的至少一個(gè)植物表達(dá)盒的多核苷酸轉(zhuǎn)化所述外植體包含 的細(xì)胞。
[0088]待轉(zhuǎn)化的多核苷酸應(yīng)該包含選擇標(biāo)記基因的至少一個(gè)植物表達(dá)盒。
[0089]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“選擇標(biāo)記基因”指相比于未用所述植物表達(dá)盒轉(zhuǎn)化并因此不包含所述選擇標(biāo)記基因的植物或植物細(xì)胞，在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中存在相應(yīng)的選擇化合物(本文中還稱為“選擇標(biāo)記基因的選擇化合物”)時(shí)賦予所述選擇標(biāo)記的植物表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。優(yōu)選地，所述選擇標(biāo)記基因和/或所述選擇標(biāo)記基因的植物表達(dá)盒對(duì)待轉(zhuǎn)化的植物是異源的，并因此不天然存在于待轉(zhuǎn)化的植物中。
[0090]優(yōu)選地，所述選擇標(biāo)記基因是負(fù)選擇標(biāo)記基因。負(fù)選擇標(biāo)記基因賦予針對(duì)選擇化合物的抗性和/或增強(qiáng)的耐受性。優(yōu)選的選擇化合物是除草劑。
[0091]在本發(fā)明方法的上下文中，所述選擇化合物優(yōu)選能夠從生長(zhǎng)培養(yǎng)基中被運(yùn)輸?shù)揭呀?jīng)轉(zhuǎn)化有包含選擇標(biāo)記基因(因此，對(duì)應(yīng)于所述選擇化合物的標(biāo)記基因)的至少一個(gè)植物表達(dá)盒的多核苷酸的細(xì)胞，和/或(通過細(xì)胞分裂)來自所述細(xì)胞的細(xì)胞中。因此，所述選擇化合物優(yōu)選能夠從生長(zhǎng)培養(yǎng)基中被運(yùn)輸?shù)桨龆嗪塑账岬霓D(zhuǎn)化細(xì)胞/組織中。優(yōu)選地，運(yùn)輸通過外植體的維管束，特別通過韌皮部或木質(zhì)部。特別優(yōu)選的能夠被運(yùn)輸通過外植體的選擇化合物是咪唑啉酮除草劑(參見下文)和D-氨基酸，特別是D-丙氨酸和D-絲氨酸，或與氨基酸具有相似性的除草劑，像膦絲菌素或草甘膦。
[0092]因此，還可以用于本發(fā)明的標(biāo)記基因是例如，但不限于其他:
[0093]-膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT;還命名為Bia丨aphos? resistance ；bar ；De Block等(1987)Plant Physiol91:694-701 ；EP0333033 ；US4, 975, 374)
[0094]-5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS ；US5, 633，435)或草甘膦氧化還原酶基因(US5，463，175)，其賦予對(duì)Glyph0SateTM(N-(磷酸基甲基)甘氨酸)的抗性(Shah efal.(1986)Science233:478)
[0095]-Glyphosate? 降解酶(Glyphosate? 氧化還原酶；gox),
[0096]-磺酰脲類和咪唑啉酮-失活的乙酰乳酸合酶(例如突變的ALS變體，例如具有S4和/或Hra突變)
[0097]-BromoxyniI? 降解腈水解酶(bxn)
[0098]-卡那霉素，或G418-編碼例如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的抗性基因(NPTII;NPTI)(Fraley等(1983) Proc Natl Acad Sci USA80:4803),其表達(dá)賦予抗生素卡那霉素和相關(guān)抗生素新霉素、巴龍 霉素、慶大霉素和G418抗性的酶，
[0099]-麥草畏降解酶(O-脫甲基酶、加氧酶、鐵氧還蛋白)(Behrens等2007Science316:1185-1188 ；US7022896)
[0100]-針對(duì)D-氨基酸，例如D-丙氨酸和D-絲氨酸強(qiáng)加的毒性效應(yīng)賦予抗性的標(biāo)記基因(W003 / 060133)。在該競(jìng)爭(zhēng)(contest)中尤其優(yōu)選為標(biāo)記基因的是來自酵母紅酵母(Rhodotorula gracilis)(圓紅冬抱酵母(Rhodosporidium toruloides))的 daol 基因(EC:1.4.3.3:GenBank Acc.-N0.:U60066)和大腸桿菌(E.coli)基因 dsdA(D_ 絲氛酸脫水酶(D-絲氨酸脫氨酶)[EC:4.3.1.18 ；GenBank Acc.-N0.J01603)。
[0101]備選標(biāo)記基因是正選擇標(biāo)記，其賦予轉(zhuǎn)化植物相比于非轉(zhuǎn)化植物的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。例如在EP-A0601092中描述了此類選擇標(biāo)記。正選擇標(biāo)記可包括(但不應(yīng)限于)甘露糖_6_磷酸異構(gòu)酶(與甘露糖組合)、UDP半乳糖-4-差向異構(gòu)酶(與例如半乳糖組合)，其中尤其優(yōu)選與甘露糖組合的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶。
[0102]賦予生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的標(biāo)記基因可以與提供針對(duì)除草劑、D-氨基酸或抗生素的抗性的標(biāo)記基因組合使用。
[0103]特別優(yōu)選的標(biāo)記基因如下:
[0104]特別優(yōu)選的選擇標(biāo)記基因是乙酰羥基酸合酶(AHAS)基因，特別是突變的AHAS基因。該乙酰羥基酸合酶(也稱為乙酰乳酸合酶，或ALS)是發(fā)現(xiàn)于植物和微生物中的蛋白質(zhì)，并且其催化支鏈氨基酸(纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸)合成的第一步。優(yōu)選地，其具有在Enzyme Commission Code EC2.2.1.6中闡明的酶促活性。所述突變的AHAS蛋白質(zhì)優(yōu)選賦予針對(duì)至少一種咪唑啉酮除草劑的抗性。咪唑啉酮除草劑為本領(lǐng)域所熟知，并優(yōu)選包括滅草煙(imazapyr)、滅草喹(imazaquin)、咪草煙(imazethapyr)、甲基咪草煙(imazapic)、甲氧咪草煙(imazamox)和咪草酯(imazamethabenz)。優(yōu)選地,所述咪唑啉酮除草劑是滅草喹。更優(yōu)選地，所述咪唑啉酮除草劑是咪草煙。最優(yōu)選地，所述咪唑啉酮除草劑是滅草煙。
[0105]優(yōu)選的突變AHAS基因公開于W02004 / 005516或W02008 / 124495中，其完整引入作為參考。其他優(yōu)選的突變AHAS基因公開于W02006 / 015376或W02007 / 054555或US20100287641中。所述突變AHAS酶優(yōu)選針對(duì)咪唑啉酮除草劑賦予抗性。
[0106]在GenBank-檢索號(hào)FW503642.1G1:313050309中顯示了特別優(yōu)選的突變AHAS基因的多核苷酸序列。所得突變AHAS多肽尤其包含S653N突變。
[0107]其他優(yōu)選的選擇標(biāo)記基因是賦予對(duì)D-氨基酸強(qiáng)加的毒性效應(yīng)抗性或增強(qiáng)的耐受性的標(biāo)記基因。此類優(yōu)選的標(biāo)記基因優(yōu)選編碼能夠代謝D-氨基酸的蛋白質(zhì)。優(yōu)選的D-氨基酸是D-丙氨酸和D-絲氨酸。特別優(yōu)選的標(biāo)記基因編碼D-絲氨酸脫氨酶、D-氨基酸氧化酶和D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶。編碼能夠代謝D-氨基酸的蛋白質(zhì)的此類標(biāo)記基因的優(yōu)選實(shí)例是在 TO03 / 060133、W005 / 090584、W007 / 107516 和 W008 / 077570 中描述的那些，其完整引入作為參考。
[0108]已知用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的幾種方法。優(yōu)選通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、通過裸DNA轉(zhuǎn)化，如電穿孔和PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，或通過粒子轟擊完成目標(biāo)組織包含的細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。
[0109]特別優(yōu)選通過將外植體與包含T-DNA的農(nóng)桿菌共同培養(yǎng)來進(jìn)行步驟b)。所述T-DNA應(yīng)該包含這樣的多核苷酸，其包含本發(fā)明方法步驟b)中提及的選擇標(biāo)記基因的至少一個(gè)植物表達(dá)盒。優(yōu)選地，外植體與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)應(yīng)該允許轉(zhuǎn)化損傷的可轉(zhuǎn)化外植體包含的細(xì)胞，以便獲得嵌合的外植體。如何共培養(yǎng)外植體與農(nóng)桿菌為本領(lǐng)域所熟知并且例如描述于US2009 / 0049567中。在本發(fā)明背景下進(jìn)行的研究背景中，固體和液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基均成功用于轉(zhuǎn)化。對(duì)于共轉(zhuǎn)化，優(yōu)選利用在液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中重懸的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物接種外植體幾分鐘至幾小時(shí)，通常約10分鐘-3小時(shí)，優(yōu)選約0.5小時(shí)-1小時(shí)。允許農(nóng)桿菌與目標(biāo)組織優(yōu)選在液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基或含有(凝固的)共培養(yǎng)培養(yǎng)基的平板上，暗中共培養(yǎng)幾天，通常3-5天 。在實(shí)施例部分中描述了優(yōu)選的共培養(yǎng)培養(yǎng)基。在共培養(yǎng)步驟中，農(nóng)桿菌將其T-DNA轉(zhuǎn)移到目標(biāo)組織的一些細(xì)胞中。優(yōu)選地，在體外條件，即無菌條件下進(jìn)行共培養(yǎng)。通常，在該步驟過程中不存在選擇化合物。
[0110]優(yōu)選地，如果所述外植體包含初生葉節(jié)或更高葉節(jié)的損傷的分生組織(參見上文)，那么轉(zhuǎn)化所述損傷的分生組織包含的細(xì)胞(還參見例如US2009 / 0049567)。因此，損傷的分生組織包含的細(xì)胞是轉(zhuǎn)化的目標(biāo)。因此，共培養(yǎng)優(yōu)選應(yīng)該允許轉(zhuǎn)化初生葉節(jié)或更高葉節(jié)的損傷的分生組織包含的細(xì)胞。由此，獲得嵌合外植體，即這樣的外植體，其包含利用選擇標(biāo)記基因的至少一個(gè)植物表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和未利用選擇標(biāo)記基因的至少一個(gè)植物表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
[0111]優(yōu)選地，如果所述外植體包含子葉節(jié)的損傷的分生組織，那么轉(zhuǎn)化所述損傷的分生組織包含的細(xì)胞。因此，子葉節(jié)的損傷的分生組織包含的細(xì)胞是轉(zhuǎn)化的目標(biāo)。因此，共培養(yǎng)優(yōu)選應(yīng)該允許轉(zhuǎn)化子葉節(jié)的損傷的分生組織包含的細(xì)胞。由此，獲得嵌合外植體。
[0112]優(yōu)選地，如果所述外植體包含損傷的上胚軸組織，那么轉(zhuǎn)化所述損傷的上胚軸組織包含的細(xì)胞(參見例如 Wright 等(Plant Cell, Tissue and Organ Culture8:83to90(1987))。因此，損傷的上胚軸組織包含的細(xì)胞是轉(zhuǎn)化的目標(biāo)。由此，獲得嵌合外植體。
[0113]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“農(nóng)桿菌”表示農(nóng)桿菌家族的所有物種(包括根癌農(nóng)桿菌和毛根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes))。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)移的植物轉(zhuǎn)化的原理為本領(lǐng)域所熟知(Horsch R B 等(1985) Science225:第 1229 頁(yè))。
[0114]農(nóng)桿菌是土傳植物病原菌，其將一段DNA (T-DNA)整合到大量雙子葉植物和少量單子葉植物的基因組中(Chilton，等，1977Cellll:263-271 ；Hoekema,等，1985Nature303:179-180 ；Bevan,1984Nucleic Acids Res.12:8711-8721 ；Sheng 和 Citovsky，1996ThePlant Cell，第8卷.1699-1710)。優(yōu)選的農(nóng)桿菌菌株是通常在被感染的植物中引起冠癭的根癌農(nóng)桿菌和通常在被感染的宿主植物中引起發(fā)根疾病的毛根農(nóng)桿菌。然而，如本發(fā)明上下文中使用的農(nóng)桿菌菌株優(yōu)選應(yīng)該缺乏分別引起冠癭疾病和發(fā)根疾病的能力(其可以通過使用卸甲的農(nóng)桿菌菌株完成，參見下文)。
[0115]農(nóng)桿菌，特別是根癌農(nóng)桿菌(也可以是毛根農(nóng)桿菌)用于植物轉(zhuǎn)化的用途是眾所周知的(對(duì)于綜述，參見 Gelvin，2003Microbiol Mol Biol Rev.67(1):16-37)。對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化，將目的基因置于農(nóng)桿菌T-DNA (轉(zhuǎn)移DNA)的左邊界和右邊界重復(fù)序列之間。然后，使用適當(dāng)?shù)闹参镛D(zhuǎn)化方案將含有目的基因的T-DNA區(qū)穩(wěn)定整合到植物基因組中。
[0116]具有不同染色體背景和Ti質(zhì)粒內(nèi)含物的農(nóng)桿菌的多種菌株均可用于轉(zhuǎn)化。然而，優(yōu)選農(nóng)桿菌菌株含有卸甲的Ti質(zhì)粒或卸甲的Ri質(zhì)粒。卸甲的Ti質(zhì)粒理解為缺乏其冠癭疾病介導(dǎo)性質(zhì)但卻提供感染植物的功能的Ti質(zhì)粒。卸甲的Ri質(zhì)粒理解為缺乏其發(fā)根疾病介導(dǎo)性質(zhì)但卻提供感染植物的功能的Ri質(zhì)粒。待用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的農(nóng)桿菌菌株選自 LBA4404、GV2260、GV3600、EHAlOl、EHA105、AGL-1、LBA9402、GV3101、C0R341、C0R356、瓜八14340132、818402、058(:14]\^90和461'121。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述農(nóng)桿菌菌株選自〇58(:13撤101、？1^90、5撤017和1^44404。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述農(nóng)桿菌菌株是K599的卸甲變體(NCPPB2659)，其優(yōu)選攜帶如W003 / 017752中公開的pri2659的卸甲變體。
[0117]優(yōu)選地，待用于本發(fā)明方法的上下文中的農(nóng)桿菌包括DNA構(gòu)建體(例如雙元載體)，其包含含有選擇標(biāo)記基因的表達(dá)盒的T-DNA。優(yōu)選地，所述T-DNA包含賦予有價(jià)值的農(nóng)藝性狀的至少一個(gè)表達(dá)盒。由于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移，所述T-DNA通常存在，即穩(wěn)定整合到轉(zhuǎn)化細(xì)胞的基因組中。
[0118]為了允許轉(zhuǎn)化，通過已知方法制備農(nóng)桿菌。包含農(nóng)桿菌菌株的T-DNA例如可以在補(bǔ)充有適當(dāng)抗生素的液體YEP培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。對(duì)于共培養(yǎng)，優(yōu)選將細(xì)菌重懸浮在液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中。用于共培養(yǎng)的農(nóng)桿菌的濃度可以變化。因此，一般可以使用OD6tltl在0.1-3.0之間的農(nóng)桿菌濃度范圍和幾小時(shí)-7天的共培養(yǎng)時(shí)間范圍。特別優(yōu)選農(nóng)桿菌濃度在OD6000.1-2.0范圍內(nèi)變化。
[0119]另外，還用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的優(yōu)選方法是粒子轟擊。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“粒子轟擊”優(yōu)選指向目標(biāo)生物學(xué)樣品(特別是細(xì)胞和植物組織)，加速目的基因包被的顆粒，以有效損傷目標(biāo)生物學(xué)樣品中細(xì)胞的細(xì)胞膜和/或顆粒進(jìn)入目標(biāo)生物學(xué)樣品的過程。用于粒子轟擊的方法(還經(jīng)常稱為“生物射彈轟擊”)為本領(lǐng)域所知，參見例如US5，584，807，并是通過商業(yè)途徑可以獲得的(例如氦氣驅(qū)動(dòng)的微粒加速器(PDS-1000 / He) (BioRad))。
[0120]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法還包括步驟bl):將步驟a)的外植體(特別是共培養(yǎng)的外植體)轉(zhuǎn)移到枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基上并在所述枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述外植體。優(yōu)選地，優(yōu)選通過將外植體優(yōu)選以水平位置放置到枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基上而將該外植體轉(zhuǎn)移到所述培養(yǎng)基中。還應(yīng)設(shè)想將所述外植體沉浸在所述培養(yǎng)基中(優(yōu)選也在水平位置上)。通過進(jìn)行步驟bl)，產(chǎn)生包含枝條組織的外植體，所述枝條組織包含含有選擇標(biāo)記基因的至少一個(gè)植物表達(dá)盒的細(xì)胞。所述枝條組織在本文中也稱為“從頭形成的枝條組織”。優(yōu)選地，所述枝條組織來自轉(zhuǎn)化目標(biāo)的組織。
[0121]優(yōu)選地，所述枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含允許誘導(dǎo)枝條的至少一種植物生長(zhǎng)因子，特別是細(xì)胞分裂素(cytokinin)。優(yōu)選地，所述枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基以適合于從目標(biāo)組織從頭誘導(dǎo)枝條誘導(dǎo)的濃度包含所述至少一種植物生長(zhǎng)因子。優(yōu)選地，所述枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含用于至少一個(gè)植物表達(dá)盒包含的可選擇標(biāo)記基因的選擇化合物。
[0122]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“植物生長(zhǎng)因子”優(yōu)選包括可以調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的天然發(fā)生的或合成的(非天然發(fā)生的)化合物。優(yōu)選的植物生長(zhǎng)因子是細(xì)胞分裂素或生長(zhǎng)素。
[0123]優(yōu)選的生長(zhǎng)素選自吲哚乙酸(IAA)、吲哚-3-丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)和2，4一二氯苯氧乙酸(2，4-D)。特別優(yōu)選的生長(zhǎng)素是IAA(對(duì)于優(yōu)選濃度，參見實(shí)施例)。
[0124]優(yōu)選的細(xì)胞分裂素是細(xì)胞分裂素(kinetin)、玉米素、6.異戊烯腺嘌呤(IPA)和6-芐基腺嘌呤/ 6-芐氨基嘌呤(BAP)。
[0125]枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)選包含細(xì)胞分裂素，特別是細(xì)胞分裂素和/或BAP。
[0126]枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基可以進(jìn)一步含有抗生素，以終止或延遲剩余農(nóng)桿菌細(xì)胞的生長(zhǎng)。優(yōu)選地，所述抗生素不是用于應(yīng)該轉(zhuǎn)化到植物中的選擇標(biāo)記基因的選擇化合物。優(yōu)選的抗
生素是羧芐青霉素或Hment in?,其為替卡西林鈉和克拉維酸鉀的混合物。優(yōu)選地，培養(yǎng)基含有適合于終止或延遲農(nóng)桿菌細(xì)胞生長(zhǎng)的量的抗生素?；蛘撸梢栽诠才囵B(yǎng)之后利用含有所述抗生素的溶液洗滌外植體。
[0127]枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)選進(jìn)一步包含足以允許選擇轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的量的選擇化合物(用于轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記基因)。在下文本發(fā)明方法步驟c)的上下文中給出了對(duì)術(shù)語(yǔ)“足以允許選擇轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的量”的解釋。在步驟c)的上下文中給出的選擇化合物的優(yōu)選量還應(yīng)用到枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。
[0128]優(yōu)選在所述枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)外植體，直至已經(jīng)產(chǎn)生枝條。轉(zhuǎn)基因枝條原基(shoot primordia)的形成在枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基上約I周后變得可見，并且平均而言，外植體在枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)約3-6周，以允許大多數(shù)外植體形成新的枝條。因此，可以在枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述外植體高達(dá)5周。然而，外植體在枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的培養(yǎng)可以顯著少于5周，因?yàn)樵诒景l(fā)明背景下進(jìn)行的研究已經(jīng)驚奇地顯示，當(dāng)進(jìn)行本發(fā)明的方法時(shí)，在枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的培養(yǎng)時(shí)間可以減少。這種驚奇的效應(yīng)導(dǎo)致獲得完全再生植物所需要的時(shí)間整體減少。因此，在本發(fā)明方法的步驟bl)中，在將所述外植體轉(zhuǎn)移到如下文所述的生長(zhǎng)培養(yǎng)基之前，優(yōu)選將該外植體在枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)1-4周，更優(yōu)選1-3周，甚至更優(yōu)選2-3周。
[0129]在本發(fā)明方法的步驟c)中，應(yīng)該將該外植體轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)培養(yǎng)基上。如果已經(jīng)進(jìn)行了步驟bl)，那么所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基應(yīng)該允許促進(jìn)轉(zhuǎn)基因枝條的伸長(zhǎng)。如果還未進(jìn)行步驟bl)，那么所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基應(yīng)該允許轉(zhuǎn)基因枝條的從頭形成和轉(zhuǎn)基因枝條的伸長(zhǎng)。該生長(zhǎng)培養(yǎng)基可以是允許轉(zhuǎn)基因枝條伸長(zhǎng)和植物生長(zhǎng)的任何培養(yǎng)基(參見下文)。在本發(fā)明方法的上下文中，生長(zhǎng)培養(yǎng)基優(yōu)選包含針對(duì)所述選擇標(biāo)記基因的至少一種選擇化合物。優(yōu)選地，生長(zhǎng)培養(yǎng)基包含足以允許選擇轉(zhuǎn)基因細(xì)胞(即包含含有如上所提及的植物表達(dá)盒的多核苷酸的細(xì)胞)的量的所述至少一種選擇化合物。
[0130]優(yōu)選地，通過進(jìn)行步驟bl)獲得外植體，即將在枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)并包含從頭形成的枝條組織的外植體轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)培養(yǎng)基上。然而，還應(yīng)該設(shè)想，在步驟b)后立即進(jìn)行本發(fā)明方法的步驟c)(并因此不進(jìn)行步驟bl)。特別地，應(yīng)設(shè)想將已經(jīng)與包含如上所述T-DNA的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)(步驟b))的外植體直接轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。在這種情況下，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基應(yīng)該允許轉(zhuǎn)基因枝條的形成和伸長(zhǎng)。如果已經(jīng)進(jìn)行了步驟bl)(并因此如果已經(jīng)在枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)了外植體)，那么在將所述外植體轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)培養(yǎng)基上之后，優(yōu)選應(yīng)該允許該外植體包含的從頭形成的枝條伸長(zhǎng)。如何完成轉(zhuǎn)基因枝條的形成和伸長(zhǎng)為本領(lǐng)域所熟知。
[0131]優(yōu)選地，將外植體垂直(并因此以向上的位置)放置在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，其中目標(biāo)組織朝上。更優(yōu)選地，將所述外植體垂直放置在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(其中目標(biāo)組織朝上)中，以便該外植體包含的目標(biāo)組織不直接與生長(zhǎng)培養(yǎng)基的表面接觸。這優(yōu)選通過將外植體包含的下胚軸或其部分插入到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中來完成。優(yōu)選地，至少一個(gè)子葉不插入到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。因此，其應(yīng)該優(yōu)選留在生長(zhǎng)培養(yǎng)基表面之上。
[0132]將所述下胚軸或其部分插入到所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基中之后，所述外植體優(yōu)選處于向上的位置(以便該外植體包含的目標(biāo)組織不直接與生長(zhǎng)培養(yǎng)基的表面接觸)。如果已經(jīng)進(jìn)一步進(jìn)行了步驟bl)，那么這也可以進(jìn)行應(yīng)用。在這種情況下，將所述外植體轉(zhuǎn)移到所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基中之后，該外植體包含的從頭形成的枝條組織不應(yīng)該直接與生長(zhǎng)培養(yǎng)基的表面接觸。
[0133]當(dāng)然，不必將整個(gè)下胚軸插入到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。將下胚軸的部分插入到足以保持外植體處于向上位置的所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基中就足夠了。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠立即確定是哪部分允許保持外植體向上的位置。
[0134]如果該外植體不包 含子葉(當(dāng)試圖將其插入到孔中時(shí)，如果子葉脫落，那么就是這種情況)，優(yōu)選將上胚軸部分插入到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。在這種情況下，外植體也應(yīng)該垂直放置在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，以便目標(biāo)組織不直接與生長(zhǎng)培養(yǎng)基的表面接觸。然而，應(yīng)該特別設(shè)想，在轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)培養(yǎng)基之后，上胚軸保留在生長(zhǎng)培養(yǎng)基表面上方。
[0135]所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基可以是允許植物生長(zhǎng)的任何培養(yǎng)基。優(yōu)選地，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基。
[0136]優(yōu)選地，該生長(zhǎng)培養(yǎng)基(本文中還稱為“生長(zhǎng)培養(yǎng)基”)選自土壤、腐殖土和水培培養(yǎng)基。最優(yōu)選的生長(zhǎng)培養(yǎng)基是水培培養(yǎng)基。優(yōu)選地，將所述外植體轉(zhuǎn)移到所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基上后，將外植體在離體條件下，并因此在非無菌條件下培養(yǎng)。
[0137]此外，還應(yīng)該設(shè)想，生長(zhǎng)培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)基。在這種情況下，在體外條件，即無菌條件下進(jìn)行步驟C)。優(yōu)選地，所述植物組織培養(yǎng)基選自Gamborg B5培養(yǎng)基、Murashige&Skoog 培養(yǎng)基、Linsmaier & Skoog 培養(yǎng)基和 Murashige & Miller 培養(yǎng)基。當(dāng)然，特別優(yōu)選Gamborg B5培養(yǎng)基和Murashige&Skoog培養(yǎng)基。
[0138]水培法用于植物生長(zhǎng)的用途是眾所周知的(對(duì)于綜述，參見Hydroponics:APractical Guide for the Soilless Grower, J.Benton Jones，published CRC Press，2004)。水培法是在沒有土壤的營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)植物的技術(shù)。兩種主要類型的水培法是液體水培培養(yǎng)基和基質(zhì)水培培養(yǎng)基。在本發(fā)明方法的上下文中，所述水培培養(yǎng)基是基質(zhì)水培培養(yǎng)基，并因此是包含水培化合物和營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的無土壤的培養(yǎng)培養(yǎng)基。
[0139]優(yōu)選地，所述水培培養(yǎng)基包含的水培化合物是無機(jī)化合物。更優(yōu)選地，所述水培化合物是礦棉。最優(yōu)選地，所述水培化合物是基于酸性酚醛、尿素甲醛或纖維素的泡沫。此類泡沫優(yōu)選具有模擬植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的開放格柵結(jié)構(gòu)。優(yōu)選的泡沫作為來自Smithers-Oasis
C0.的Oasis?生根培養(yǎng)基也稱為Oasis? wedges, (Kent, OH, USA)可用或作為來自Grow-Tech的微孔泡沫生根海綿(Lisbon FalIs,ME,USA)可用。例如在US2，753，277中描述了優(yōu)選的基于酸性酚醛的泡沫(也稱為酚醛泡沫)。
[0140]用于植物生長(zhǎng)的礦棉水培化合物為本領(lǐng)域所知并優(yōu)選包含從天然的或合成的礦物質(zhì)或金屬氧化物制備的礦物纖維的粘著基質(zhì)(coherent matrix)。優(yōu)選地,礦棉選自玻璃棉、巖棉和渣棉。還考慮的是上述礦棉的混合物。在本發(fā)明背景下最優(yōu)選礦棉是巖棉(還參見W001 / 87070) ο巖棉(也經(jīng)常被稱為石棉)是從火山巖制備的礦棉。其包含孔(約95% )和巖石纖維形式的固體(5% ) ο優(yōu)選地，從玄武巖和石灰?guī)r制備巖棉。為了制備巖棉，例如將這些原料在烘箱中約150(TC下加熱，在該溫度下它們?nèi)刍扇蹘r。然后將所述熔巖傾注到高速旋轉(zhuǎn)的許多圓盤上。離心力從圓盤上拋擲熔巖滴，然后將其轉(zhuǎn)變成線。壓縮所述線，以形成實(shí)體，其然后被鋸成石板和石塊。
[0141]應(yīng)該理解的是，可以提供許多形狀和大小的水培培養(yǎng)基，例如小方塊、方塊、塊狀、墊子和平板(還參見實(shí)施例)。
[0142]當(dāng)然，生長(zhǎng)培養(yǎng)基應(yīng)該還包含營(yíng)養(yǎng)物。所述培養(yǎng)基優(yōu)選包含植物生長(zhǎng)和發(fā)育需要的基本元素，如氮、磷和鉀。優(yōu)選地，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基還包含植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，特別是生長(zhǎng)素，如IAA。
[0143]在本發(fā)明 方法的上下文中，上文提及的生長(zhǎng)培養(yǎng)基應(yīng)該包含用于上述表達(dá)盒包含的針對(duì)選擇標(biāo)記基因的至少一種選擇化合物。當(dāng)將外植體轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中時(shí)，所述選擇化合物優(yōu)選早已存在于該生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。然而，還應(yīng)該考慮，在轉(zhuǎn)移后向生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入選擇化合物。如果在轉(zhuǎn)移后加入選擇化合物，那么優(yōu)選轉(zhuǎn)移后立即、一天、兩天、三天或四天加入該化合物。優(yōu)選地，通過利用含有選擇化合物的溶液灌溉外植體加入所述選擇化合物，特別是一周一次或兩次。
[0144]優(yōu)選地，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基還包含植物生長(zhǎng)因子，特別是IAA。當(dāng)將外植體轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中時(shí)，所述植物生長(zhǎng)因子優(yōu)選早已存在于該生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。然而，還應(yīng)該考慮，在轉(zhuǎn)移后向生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入選擇化合物(參見上文)。所述植物生長(zhǎng)因子優(yōu)選允許根誘導(dǎo)。
[0145]如上所闡明，生長(zhǎng)培養(yǎng)基還該包含足以允許選擇轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的量的選擇化合物。培養(yǎng)基中選擇化合物的充足量取決于待轉(zhuǎn)化的植物以及選擇化合物本身。然而本領(lǐng)域技術(shù)人員可以立即確定選擇化合物的充足量。例如，通過比較實(shí)驗(yàn)可以確定充足量，在所述比較實(shí)驗(yàn)中測(cè)試了選擇化合物的多種量。一般而言，如果未曾用相應(yīng)選擇標(biāo)記的植物表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的生長(zhǎng)被抑制，而已經(jīng)用所述植物表達(dá)盒轉(zhuǎn)化成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞卻能夠生長(zhǎng)(并因此發(fā)生細(xì)胞分裂)，那么可認(rèn)為選擇化合物的量是充足的。在下文中給出了特定選擇化合物的優(yōu)選量，認(rèn)為所述優(yōu)選量足以允許選擇轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
[0146]如果選擇標(biāo)記基因編碼AHAS或突變的AHAS，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基優(yōu)選包含優(yōu)選
0.5 μ 1Μ-25 μ Μ,更優(yōu)選I μ Μ-10 μ Μ,并且甚至更優(yōu)選I μ Μ-5 μ Μ,最優(yōu)選I μ Μ-3 μ M的量的至少一種咪唑啉酮除草劑(即相應(yīng)的選擇化合物)，特別是滅草煙。還優(yōu)選用含有上述量的選擇化合物的溶液對(duì)外植體進(jìn)行灌溉。在實(shí)施例中給出了滅草煙的其他優(yōu)選量。
[0147]如果選擇標(biāo)記基因針對(duì)D-氨基酸強(qiáng)加的毒性效應(yīng)賦予抗性或增強(qiáng)的耐受性(特別是如果標(biāo)記基因編碼D-絲氨酸脫氨酶)，那么所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基優(yōu)選包含0.05mM-100mM,優(yōu)選0.lmM-50mM,并更優(yōu)選5mM_7.5mM的量的至少一種D-氨基酸,特別是D-絲氨酸。還優(yōu)選用含有上述量的選擇化合物的溶液對(duì)外植體進(jìn)行灌溉。
[0148]其他選擇化合物的優(yōu)選濃度例如是:
[0149]利用膦絲菌素抗性基因(bar)作為選擇標(biāo)記，膦絲菌素可以以約l_75mg/l的濃度包括在培養(yǎng)基中。用于選擇的典型濃度是約1-約15mg / I。用于選擇的優(yōu)選濃度是約3_5mg / I。
[0150]利用卡那霉素抗性基因(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，NPTII)作為選擇標(biāo)記，卡那霉素可以以約3-200mg/l的濃度包括在培養(yǎng)基中。用于選擇的典型濃度是5-50mg/l。
[0151]已知一般通過含有選擇劑的溶液噴灑植物/外植體或通過將選擇化合物加入到所述植物/外植體的葉上來與選擇化合物接觸來選擇植物。然而，在本發(fā)明的上下文中，所述選擇化合物應(yīng)該存在于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。因此，其被外植體的非轉(zhuǎn)基因部分吸收并易位到上胚軸及以上部分，而不是通過含有選擇劑的溶液噴灑植物/外植體或通過將選擇化合物加入到所述植物/外植體的葉上來接觸該植物/外植體。
[0152]在本發(fā)明方法的其他步驟d)中，應(yīng)該允許所述外植體形成枝條并且應(yīng)該允許該枝條伸長(zhǎng)。如果已經(jīng)進(jìn)行了步驟bl)，應(yīng)該允許所形成的枝條(或形成的枝條原基)伸長(zhǎng)。所形成的/伸長(zhǎng)的枝 條優(yōu)選包含這樣的植物細(xì)胞，其包含所述選擇標(biāo)記基因的所述至少一個(gè)植物表達(dá)盒。
[0153]可以在體外或離體條件下進(jìn)行步驟d)。優(yōu)選地，如果生長(zhǎng)培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)基，那么在體外條件下進(jìn)行步驟d)。如果生長(zhǎng)培養(yǎng)基是水培培養(yǎng)基、土壤或腐殖土，那么優(yōu)選在離體條件下，并因而在非無菌條件下進(jìn)行步驟d)。
[0154]枝條水培培養(yǎng)基上的伸長(zhǎng)是有利的，因?yàn)榕c在植物組織培養(yǎng)基上6-8周相比，其僅需要2周來獲得伸長(zhǎng)的枝條。由此，用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物所需要的時(shí)間可以顯著減少。
[0155]本發(fā)明的方法優(yōu)選包含進(jìn)一步的步驟e)，其包括從在步驟d)中所形成和/或伸長(zhǎng)的所述枝條，并因此從來自步驟d)的小植株再生轉(zhuǎn)基因植物。所再生的植物優(yōu)選包含插入到其基因組中的多核苷酸，所述多核苷酸包含所述選擇標(biāo)記基因的所述至少一個(gè)植物表達(dá)盒。
[0156]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟e)包括以下步驟:
[0157]el)從外植體分離步驟d)中獲得的伸長(zhǎng)的枝條，
[0158]e2)將所分離的伸長(zhǎng)的枝條轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，和
[0159]e3)從所述伸長(zhǎng)的枝條再生轉(zhuǎn)基因植物。
[0160]在步驟el)中，僅優(yōu)選分離伸長(zhǎng)的枝條。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠立即確定是否認(rèn)為枝條是伸長(zhǎng)的。優(yōu)選地，分離的伸長(zhǎng)的枝條是形成具有全三葉的葉的枝條。如果已經(jīng)轉(zhuǎn)化了大豆外植體，那么分離具有伸長(zhǎng)的莖的枝條，所述莖具有優(yōu)選至少2cm，或更優(yōu)選至少3cm，或甚至更優(yōu)選至少5cm的長(zhǎng)度。
[0161]可以通過認(rèn)為適當(dāng)?shù)娜魏畏椒◤耐庵搀w分離伸長(zhǎng)的枝條。優(yōu)選地，通過使用一把剪刀從外植體切割伸長(zhǎng)的枝條來完成分離。
[0162]應(yīng)該將所分離的伸長(zhǎng)的枝條轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。已經(jīng)在上文中描述了術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)培養(yǎng)基”。優(yōu)選地，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基是水培培養(yǎng)基。用于再生植物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基可以或可以不包含用于選擇標(biāo)記基因的選擇化合物。優(yōu)選地，其包含所述選擇化合物。將分離的枝條轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，以誘導(dǎo)根的形成。根形成優(yōu)選耗費(fèi)1-2周。植物可以在生長(zhǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)至成熟。然而，優(yōu)選將發(fā)育出根的小植株轉(zhuǎn)移到土壤中，并將它們?cè)谕寥郎吓囵B(yǎng)至完全成熟(例如，如果在步驟e2中已經(jīng)將它們轉(zhuǎn)移到水培培養(yǎng)基中)。在轉(zhuǎn)移到土壤中之后并且在轉(zhuǎn)移到溫室之前，可以將生根的枝條在生長(zhǎng)室中保持1-3周。
[0163]在進(jìn)一步的步驟e4)中，允許再生的植物發(fā)育出種子。優(yōu)選地，在進(jìn)一步的步驟e5)中收集種子。優(yōu)選地，種子包含的細(xì)胞包含這樣的多核苷酸，其包含本發(fā)明方法的選擇標(biāo)記基因的至少一個(gè)植物表達(dá)盒(參見，例如步驟a)，并因此轉(zhuǎn)化有所述植物表達(dá)盒。優(yōu)選地，利用所述植物表達(dá)盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化”優(yōu)選表示包含選擇標(biāo)記基因的至少一個(gè)植物表達(dá)盒的多核苷酸被整合到細(xì)胞的基因組中。
[0164]在本發(fā)明方法甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，在不從所述外植體分離伸長(zhǎng)的枝條的情況下再生步驟e)的植物。植物可以在生長(zhǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)至成熟。然而，優(yōu)選將具有發(fā)育出根的小植株轉(zhuǎn)移到土壤中并將它們?cè)谕寥郎吓囵B(yǎng)至完全成熟。優(yōu)選，允許植物開花。更優(yōu)選地，允許植物結(jié)種子。在進(jìn)一步的步驟中，可收集所結(jié)出的種子。優(yōu)選地，種子包含的細(xì)胞包含這樣的多核苷酸，其包含本發(fā)明方法的選擇標(biāo)記基因的至少一個(gè)植物表達(dá)盒(參見，例如步驟a)，并因此轉(zhuǎn)化有所述植物表達(dá)盒。優(yōu)選地，利用所述植物表達(dá)盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞。
[0165]在不從外植體分離伸長(zhǎng)的枝條的情況下進(jìn)行步驟e)，再生植物，其包含非轉(zhuǎn)基因的上胚軸和/或下胚軸組織，即未用包含選擇標(biāo)記的至少一個(gè)植物表達(dá)盒的多核苷酸轉(zhuǎn)化的組織，和來自轉(zhuǎn)化的目標(biāo)組織的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因組織/器官，如莖、葉、花和/或種子。所述轉(zhuǎn)基因組織/器官包含含有選擇標(biāo)記的至少一個(gè)植物表達(dá)盒的多核苷酸。
[0166]因此，本發(fā)明涉及通過本發(fā)明的方法獲得的或可獲得的植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過本發(fā)明的方法獲得的或可獲得的植物是復(fù)合植物。復(fù)合植物是這樣的植物，其包含非轉(zhuǎn)基因部分，特別是上胚軸和/或下胚軸組織和來自轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因部分。通過在選擇條件下在野生型上胚軸和/或下胚軸組織上誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因枝條，然后在非選擇條件下將包含轉(zhuǎn)基因枝條的野生型上胚軸和/或下胚軸組織轉(zhuǎn)變到生根步驟。在本發(fā)明方法獲得的或可獲得的植物的背景中的“非轉(zhuǎn)基因的”表示，上文提及的植物的組織或部分不包含并因而未轉(zhuǎn)化有包含選擇標(biāo)記的至少一個(gè)表達(dá)盒的多核苷酸。
[0167]優(yōu)選地，所述植物已經(jīng)開花。更優(yōu)選地，所述植物已經(jīng)結(jié)種子。最優(yōu)選地，該植物所結(jié)的種子包含轉(zhuǎn)化的多核苷酸，其包含選擇標(biāo)記的至少一個(gè)表達(dá)盒。因此，所轉(zhuǎn)化的多核苷酸將被傳遞到下一代。圖3顯示了合成的(composite)植物。
[0168]本發(fā)明是有利的，理由如下:
[0169]一般而言，通過利用合適的農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化易于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的植物組織獲得轉(zhuǎn)基因植物。共培養(yǎng)之后，外植體在枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)并通過使用選擇標(biāo)記基因選擇轉(zhuǎn)基因枝條。枝條伸長(zhǎng)后，從外植體上分離枝條并在根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)根生長(zhǎng)。一般而言，在體外條件下，即無菌條件下進(jìn)行所有這些步驟。因此，在無菌條件下進(jìn)行許多步驟。這增加了真菌或細(xì)菌污染的風(fēng)險(xiǎn)。此外，上述方案是非常耗時(shí)的。例如，當(dāng)如上述轉(zhuǎn)化大豆時(shí)，轉(zhuǎn)化耗費(fèi)高達(dá)100天或甚至更長(zhǎng)時(shí)間。
[0170]然而，當(dāng)應(yīng)用本發(fā)明的方法時(shí)，可以縮短用于大豆轉(zhuǎn)化的時(shí)間軸并可以在50-60天內(nèi)獲得生根的轉(zhuǎn)基因大豆植物。具體而言，當(dāng)僅在枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基上短時(shí)間培養(yǎng)外植體時(shí)，和/或在不從外植體分離伸長(zhǎng)的枝條的情況下培養(yǎng)植物至成熟時(shí)，可以縮短時(shí)間軸。這已經(jīng)顯示用于多種大豆品種如93061、Williams82、Stoddard和Jake以及用于根癌農(nóng)桿菌和毛根農(nóng)桿菌。
[0171]根據(jù)本發(fā)明的方法，將外植體垂直置于生長(zhǎng)培養(yǎng)基上，例如土壤、腐殖土或水培培養(yǎng)基，其剩余的下胚軸部分插入到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，例如水培培養(yǎng)基，像Oasis? wedges.,然而，盡管外植體包含的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞不直接與包含選擇化合物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基表面接觸，但選擇已經(jīng)顯示是有效的。僅非轉(zhuǎn)化的下胚軸/子葉組織直接與生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并因而與選擇化合物接觸。因此，根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行的研究結(jié)果是令人驚奇的。
[0172]此外，水培培養(yǎng)基的使用是有利的，因?yàn)槠渑c其他系統(tǒng)，例如植物組織培養(yǎng)基相比顯著減少了枝條伸長(zhǎng)所需要的時(shí)間。由此，用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物所需要的總時(shí)間可以顯著減少。
[0173]此外，當(dāng)應(yīng)用本發(fā)明的方法時(shí)，可以減少在體外條件下進(jìn)行的步驟數(shù)量，導(dǎo)致污染的風(fēng)險(xiǎn)降低。
[0174]此外，當(dāng)在不從外植體分離伸長(zhǎng)的枝條的情況下進(jìn)行步驟e)時(shí)，可以減少用于獲得轉(zhuǎn)基因植物和/或轉(zhuǎn)基因種子所需要的步驟數(shù)量。
[0175]上文在本發(fā)明的第一個(gè)方法的上下文中給出的定義和解釋適用于下文描述的本發(fā)明的方法(除非另有說明)。
[0176]此外，本 發(fā)明涉及產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括以下步驟:
[0177](i)提供損傷的可轉(zhuǎn)化外植體,其包含至少一個(gè)子葉,和初生葉節(jié)或更高葉節(jié)的損傷的分生組織(特別是初生葉節(jié)或更高葉節(jié)的損傷的腋生分生組織)，
[0178](ii)利用包含選擇標(biāo)記基因的至少一個(gè)植物表達(dá)盒的多核苷酸轉(zhuǎn)化所述外植體所包含的細(xì)胞，
[0179](iii)將所述外植體轉(zhuǎn)移到枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基中并在所述枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述外植體，所述枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含針對(duì)所述選擇標(biāo)記基因的至少一種選擇化合物，由此允許包含植物細(xì)胞的至少一個(gè)從頭形成的枝條的形成，所述植物細(xì)胞包含選擇標(biāo)記基因的所述至少一個(gè)植物表達(dá)盒，
[0180](iv)分離包含所述至少一個(gè)從頭形成的枝條的所述初生葉節(jié)或更高葉節(jié)的分生組織區(qū)并將所述分生組織區(qū)轉(zhuǎn)移到水培培養(yǎng)基上，所述水培培養(yǎng)基包含針對(duì)所述選擇標(biāo)記基因的至少一種選擇化合物，并允許所述至少一個(gè)從頭形成的枝條伸長(zhǎng)，和
[0181](V)從所述如此來源的小植株再生轉(zhuǎn)基因植物。
[0182]優(yōu)選地，上述方法的步驟(i)和(ii)對(duì)應(yīng)于該說明書中描述的第一種方法的步驟(a)和(b)。此外，損傷的可轉(zhuǎn)化外植體還可以包含本文其他地方描述的下胚軸或其部分。然而，還優(yōu)選所述損傷的可轉(zhuǎn)化外植體不包含下胚軸組織。優(yōu)選地，通過從幼苗去除根和下胚軸或其部分獲得外植體。還可以去除一個(gè)子葉。當(dāng)然，所述損傷的可轉(zhuǎn)化外植體包含上胚軸。[0183]優(yōu)選地，在體外條件下進(jìn)行步驟(i)和(ii)。
[0184]優(yōu)選地，上述方法的步驟(iii)對(duì)應(yīng)于該說明書中描述的第一種方法的步驟(bl)。通過進(jìn)行步驟(iii)，優(yōu)選允許外植體，特別是共培養(yǎng)的外植體形成包含植物細(xì)胞的枝條(枝條從頭形成)，所述植物細(xì)胞包含針對(duì)所述選擇標(biāo)記基因的所述至少一種選擇化合物。優(yōu)選地，所述枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含允許誘導(dǎo)枝條的至少一種植物生長(zhǎng)因子。在本文其他地方描述了允許誘導(dǎo)枝條，即用于枝條從頭形成的優(yōu)選植物生長(zhǎng)因子。優(yōu)選地，還在體外條件下進(jìn)行步驟(iii)。
[0185]將外植體優(yōu)選在所述枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，直至已經(jīng)出現(xiàn)從頭形成的枝條。因此，可以在枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基上將外植體培養(yǎng)高達(dá)5周。根據(jù)上述方法，在將外植體轉(zhuǎn)移到如下文所述的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中之前，優(yōu)選將所述外植體在枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3-5周，更優(yōu)選3-4周，甚至更優(yōu)選3周。還應(yīng)該考慮，在枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)外植體。
[0186]在枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)之后，初生葉節(jié)或更高葉節(jié)的分生組織區(qū)包含新形成的葉或枝條結(jié)構(gòu)的群體(cluster)。因此,枝條來自枝條群體(枝條聚集體)。優(yōu)選地，從頭形成的枝條的至少一個(gè)(特別是一個(gè))包含植物細(xì)胞，其包含針對(duì)所述選擇標(biāo)記基因的所述至少一種選擇化合物。
[0187]群體包含的一些枝條可以是非轉(zhuǎn)基因的。然而，優(yōu)選至少一個(gè)從頭形成的枝條包含植物細(xì)胞，其包含針對(duì)所述選擇標(biāo)記基因的所述至少一種選擇化合物。
[0188]在步驟iv)，從外植體分開，并因此分離初生葉節(jié)或更高葉節(jié)的分生組織區(qū)(并因此，分生組織)，其包含至少一個(gè)從頭形成的枝條(包含啥有所述選擇標(biāo)記基因的所述至少一個(gè)植物表達(dá)盒的植物細(xì)胞)。優(yōu)選地，通過從上胚軸分離而從外植體上分離所述分生組織區(qū)。可以通過認(rèn)為適當(dāng)?shù)娜魏畏椒◤耐庵搀w進(jìn)行分離。優(yōu)選地，通過使用一把剪刀從外植體切割分生組織區(qū)來完成分離。`所分離的分生組織區(qū)優(yōu)選包含上胚軸的部分。
[0189]然后優(yōu)選通過將其部分插入到水培培養(yǎng)基中，以將所分離的分生組織區(qū)轉(zhuǎn)移到水培培養(yǎng)基中。(對(duì)于優(yōu)選的水培培養(yǎng)基，參見本文其他地方，特別是該說明書描述的第一種方法的步驟C))。如果所分離的分生組織區(qū)包含上胚軸的部分，優(yōu)選將上胚軸的所述部分插入到水培培養(yǎng)基中。優(yōu)選地，將所述分生組織區(qū)以向上的位置插入到水培培養(yǎng)基中。
[0190]所述水培培養(yǎng)基優(yōu)選包含針對(duì)所述選擇標(biāo)記基因的至少一種選擇化合物(對(duì)于細(xì)節(jié)，也參見第一種方法的步驟c))。此外，在轉(zhuǎn)移后，應(yīng)該允許包含植物細(xì)胞的至少一個(gè)枝條伸長(zhǎng)，所述植物細(xì)胞包含所述選擇標(biāo)記基因的所述至少一個(gè)植物表達(dá)盒。此外，應(yīng)該允許所述至少一個(gè)枝條形成根。這可以通過加入合適的植物生長(zhǎng)因子來完成。由此，獲得轉(zhuǎn)化有包含選擇標(biāo)記基因的至少一個(gè)植物表達(dá)盒的多核苷酸的小植株。
[0191]與步驟(i)-(iii)相反，步驟(iv)應(yīng)該優(yōu)選在非無菌，并因此在離體條件下進(jìn)行。
[0192]在進(jìn)一步的步驟(V)中，從來自步驟(iv)的小植株再生植物。所再生的植物優(yōu)選包含插入到其基因組中的包含所述選擇標(biāo)記基因的所述至少一個(gè)植物表達(dá)盒的多核苷酸。優(yōu)選地，允許再生的植物結(jié)種子。優(yōu)選地，收集所述種子。優(yōu)選地，種子包含的細(xì)胞包含這樣的多核苷酸，其包含本發(fā)明方法的選擇標(biāo)記基因的至少一個(gè)植物表達(dá)盒(參見，例如步驟a)，并因此轉(zhuǎn)化有所述植物表達(dá)盒。優(yōu)選地，利用所述植物表達(dá)盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化”優(yōu)選表示包含選擇標(biāo)記基因的至少一個(gè)植物表達(dá)盒的多核苷酸被整合到細(xì)胞的基因組中。[0193]有利地，已經(jīng)顯示在為本發(fā)明進(jìn)行的研究的上下文中，在水培培養(yǎng)基上，優(yōu)選離體下促進(jìn)枝條伸長(zhǎng)和根形成與在其他系統(tǒng)上促進(jìn)枝條伸長(zhǎng)和/或根形成相比，已經(jīng)極大地減少了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物中的時(shí)間軸。例如，用于枝條伸長(zhǎng)所需要的時(shí)間可以從6-10周減少到約28天。
[0194]該說明書中引用的所有文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容以及在說明書中明確提及的內(nèi)容引入作為參考。
[0195]在下文中，公開了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。上文給出的定義和解釋也適用。
[0196]實(shí)施方案
[0197]1.用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括以下步驟:
[0198]a)提供損傷的可轉(zhuǎn)化外植體，其包含下胚軸或其部分、至少一個(gè)子葉，和選自以下的損傷組織: [0199]1.初生葉節(jié)或更高葉節(jié)的損傷的分生組織，
[0200]i1.子葉節(jié)的損傷的分生組織，和
[0201]ii1.損傷的上胚軸組織
[0202]b)利用包含選擇標(biāo)記基因的至少一個(gè)植物表達(dá)盒的多核苷酸轉(zhuǎn)化所述外植體所包含的細(xì)胞，
[0203]c)通過將所述外植體的下胚軸或其部分插入到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中來將所述外植體轉(zhuǎn)移到所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基包含針對(duì)所述選擇標(biāo)記基因的至少一種選擇化合物，
[0204]d)允許所述外植體形成枝條和/或允許該枝條伸長(zhǎng)，所述枝條包含植物細(xì)胞，所述植物細(xì)胞包含含有所述選擇標(biāo)記基因的至少一個(gè)植物表達(dá)盒的所述多核苷酸，和
[0205]e)從所述枝條再生轉(zhuǎn)基因植物。
[0206]2.實(shí)施方案I的方法，其中通過共培養(yǎng)所述外植體與包含T-DNA的農(nóng)桿菌進(jìn)行步驟b)，所述T-DNA包含含有選擇標(biāo)記基因的至少一個(gè)植物表達(dá)盒的多核苷酸。
[0207]3.實(shí)施方案I的方法，其中步驟a)中的外植體來自6_10天齡幼苗。
[0208]4.實(shí)施方案2和3的方法，其中所述共培養(yǎng)允許轉(zhuǎn)化損傷的分生組織包含的細(xì)胞，以便獲得嵌合外植體。
[0209]5.實(shí)施方案1-4任一項(xiàng)的方法，其中所述方法還包括步驟bl)，即將所述外植體轉(zhuǎn)移到枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基上并在所述枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述外植體。
[0210]6.實(shí)施方案1-4任一項(xiàng)的方法，其中在步驟b)后立即進(jìn)行步驟C)。
[0211]7.實(shí)施方案1-6任一項(xiàng)的方法,其中在將所述外植體轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中之后在離體條件下培養(yǎng)所述外植體。
[0212]8.實(shí)施方案1-7任一項(xiàng)的方法，其中步驟e)包括以下步驟:
[0213]el)從外植體分離步驟d)中獲得的伸長(zhǎng)的枝條，
[0214]e2)將所分離的伸長(zhǎng)的枝條轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，和
[0215]e3)從所述伸長(zhǎng)的枝條再生轉(zhuǎn)基因植物。
[0216]9.實(shí)施方案1-7任一項(xiàng)的方法，其中在不從所述外植體分離伸長(zhǎng)的枝條的情況下再生步驟e)中的轉(zhuǎn)基因植物。
[0217]10.實(shí)施方案1-9任一項(xiàng)的方法，其中步驟c)中的所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基是水培培養(yǎng)基。[0218]11.實(shí)施方案10的方法，其中所述水培培養(yǎng)基是基于甲醛或纖維素的泡沫。
[0219]12.實(shí)施方案1-11任一項(xiàng)的方法，其中所述選擇標(biāo)記基因是突變的AHAS基因(乙酰乳酸合酶基因)或針對(duì)D-氨基酸強(qiáng)加的毒性效應(yīng)賦予抗性或增強(qiáng)的耐受性的標(biāo)記基因，特別是編碼D-絲氨酸脫氨酶、D-氨基酸氧化酶，或D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的標(biāo)記基因。
[0220]13.實(shí)施方案12的方法，其中所述選擇標(biāo)記基因是突變的AHAS基因，并且其中所述選擇化合物是咪唑啉酮除草劑，特別是滅草煙。
[0221]14.實(shí)施方案1-13任一項(xiàng)的方法，其中所述植物是雙子葉植物。
[0222]15.實(shí)施方案1-14任一項(xiàng)的方法，其中植物選自大豆屬、苜蓿屬和菜豆屬。
[0223]16.實(shí)施方案15的方法，其中所述植物是大豆。
[0224]17.植物，其可以通過實(shí)施方案9的方法獲得。
[0225]18.實(shí)施方案17的植物，其中所述植物已經(jīng)開花。
[0226]19.實(shí)施方案17和18的植物，其中所述植物已經(jīng)結(jié)種子。
[0227]下圖顯示:
[0228]圖1A:外植體的制備:通過從7-8天齡大豆幼苗去除大部分的下胚軸、一個(gè)子葉和所有預(yù)先形成的葉(包括 頂端分生組織)來制備外植體。
[0229]圖1B:損傷的可轉(zhuǎn)化大豆外植體
[0230]圖1C:與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)。將大豆外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)約5天。
[0231]圖2A:來自轉(zhuǎn)化的初生葉節(jié)的具有成形的葉/枝條結(jié)構(gòu)的外植體。已經(jīng)將外植體以向上的位置插入到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，以便所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞不直接與包含選擇化合物的生長(zhǎng)培
養(yǎng)基接觸。
[0232]圖2B:從外植體分離伸長(zhǎng)的枝條。分離后，枝條各自生根。
[0233]圖3A:具有來自轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的非轉(zhuǎn)化(野生型)下胚軸和上胚軸轉(zhuǎn)基因部分的復(fù)合植物。為了獲得該植物，已經(jīng)轉(zhuǎn)化了初生葉節(jié)的分生組織。與圖2B中顯示的植物相反，伸長(zhǎng)的枝條不是從外植體上分離的。
[0234]圖3B:從水培培養(yǎng)基上的幼苗外植體的初生葉節(jié)區(qū)伸長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因枝條(含有DsRed基因)
[0235]以下實(shí)施例僅旨在闡明本發(fā)明。它們不應(yīng)以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例
[0236]實(shí)施例1.大豆種子的滅菌和萌發(fā)
[0237]在具有氯氣的干燥器中對(duì)大豆種子進(jìn)行滅菌，所述氯氣是通過向100ml漂白劑(5.25%次氯酸鈉)中逐滴加入3.5mll2N HCI來產(chǎn)生的。24-48小時(shí)后，從干燥器中移出種
子并在使用前在室溫下短時(shí)間儲(chǔ)存。為了種子萌發(fā),將大約30-50粒種子置于P丨antCon?容器中的固體種子萌發(fā)培養(yǎng)基上并在27°c下生長(zhǎng)7-8天。
[0238]實(shí)施例2.用于轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物和外植體的制備
[0239]通過將攜帶想要的雙元載體的農(nóng)桿菌(例如根癌農(nóng)桿菌或毛根農(nóng)桿菌)劃線到含有適當(dāng)抗生素，如卡那霉素或壯觀霉素的固體YEP生長(zhǎng)培養(yǎng)基上來制備農(nóng)桿菌細(xì)胞培養(yǎng)物。它們?cè)?8°C培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。大約2天后，(利用無菌牙簽)挑取一個(gè)或幾個(gè)菌落并接種到含有適當(dāng)抗生素(卡那霉素或壯觀霉素)的50ml液體YEP培養(yǎng)基中。然后將其置于振蕩器上并在200-250轉(zhuǎn)/分鐘(28°C )下振蕩約24小時(shí)或直至達(dá)到1.0-1.5的0D66(I。通過將等體積的農(nóng)桿菌懸浮液與甘油混合來制備農(nóng)桿菌甘油工作貯存液。將各160-170 μ I農(nóng)桿菌貯存液作為等分試樣裝入200 μ IEppendorf管中，然后在儲(chǔ)存在_80°C，直至使用。在農(nóng)桿菌感染外植體前一天，將100-150 μ I農(nóng)桿菌工作貯存液吸入400ml離心瓶中100_150ml的YEP中。將所述離心瓶置于振蕩器上并在28°C下振蕩過夜或直至達(dá)到1.0-1.5的0D66(I。
[0240]在進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的當(dāng)天，通過在5，OOOg下離心8分鐘來收集農(nóng)桿菌。將沉淀在液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中重懸浮至想要的密度(OD66tl=L 5)并在使用前在室溫下放置至少30分鐘。
[0241]下表顯示了液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基(pH5.4)的組成。
[0242]
【權(quán)利要求】
1.用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括以下步驟: a)提供損傷的可轉(zhuǎn)化外植體，其包含下胚軸或其部分、至少一個(gè)子葉和選自以下的損傷組織: .1.初生葉節(jié)或更高葉節(jié)的損傷的分生組織， i1.子葉節(jié)的損傷的分生組織，和 ii1.損傷的上胚軸組織， b)利用包含選擇標(biāo)記基因的至少一個(gè)植物表達(dá)盒的多核苷酸轉(zhuǎn)化所述外植體所包含的細(xì)胞， c)通過將所述外植體的下胚軸或其部分插入到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中來將所述外植體轉(zhuǎn)移到所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基包含針對(duì)所述選擇標(biāo)記基因的至少一種選擇化合物，其中將所述外植體以向上的位置置于所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基中， d)允許所述外植體形成枝條和/或允許該枝條伸長(zhǎng)，所述枝條包含植物細(xì)胞，所述植物細(xì)胞包含含有所述選擇標(biāo)記基因的所述至少一個(gè)植物表達(dá)盒的所述多核苷酸，和 e)從所述枝條再生轉(zhuǎn)基因植物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中通過共培養(yǎng)所述外植體與包含T-DNA的農(nóng)桿菌進(jìn)行步驟b)，所述T-DNA包含含有所述選擇標(biāo)記基因的至少一個(gè)植物表達(dá)盒的多核苷酸。
3.權(quán)利要求1的方法，其中步驟a)中的外植體來自6-10天齡幼苗。
4.權(quán)利要求2和3的方法，其中所述共培養(yǎng)允許轉(zhuǎn)化損傷的分生組織包含的細(xì)胞，以便獲得嵌合外植體。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中所述方法還包括的步驟bl)，即將所述外植體轉(zhuǎn)移到枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，并在所述枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述外植體。
6.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中在步驟b)后立即進(jìn)行步驟C)。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中在將所述外植體轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中之后，在離體條件下培養(yǎng)所述外植體。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中步驟e)包括以下步驟: el)從外植體分離步驟d)中獲得的伸長(zhǎng)的枝條， e2)將所分離的伸長(zhǎng)的枝條轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，和 e3)從所述伸長(zhǎng)的枝條再生轉(zhuǎn)基因植物。
9.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中在不從所述外植體分離伸長(zhǎng)的枝條的情況下再生步驟e)中的轉(zhuǎn)基因植物。
10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法，其中步驟c)中的所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基是水培培養(yǎng)基，特別是其中所述水培培養(yǎng)基是基于甲醛或纖維素的泡沫。
11.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法，其中所述選擇標(biāo)記基因是突變的AHAS基因(乙酰乳酸合酶基因)，或針對(duì)D-氨基酸強(qiáng)加的毒性效應(yīng)賦予抗性或增強(qiáng)的耐受性的標(biāo)記基因，特別是編碼D-絲氨酸脫氨酶、D-氨基酸氧化酶，或D-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的標(biāo)記基因。
12.權(quán)利要求12的方法，其中所述選擇標(biāo)記基因是突變的AHAS基因，并且其中所述選擇化合物是咪唑啉酮除草劑，特別是滅草煙。
13.權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的方法，其中所述植物是雙子葉植物，優(yōu)選其中所述植物的屬選自大豆屬、苜蓿屬和菜豆屬，更優(yōu)選其中所述植物是大豆。
14.用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括以下步驟: (i)提供損傷的可轉(zhuǎn)化外植體，其包含至少一個(gè)子葉，和初生葉節(jié)或更高葉節(jié)的損傷的分生組織(特別是初生葉節(jié)或更高葉節(jié)的損傷的腋生分生組織)， (?)利用包含選擇標(biāo)記基因的至少一個(gè)植物表達(dá)盒的多核苷酸轉(zhuǎn)化所述外植體所包含的細(xì)胞， (iii)將所述外植體轉(zhuǎn)移到枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，并在所述枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述外植體，所述枝條誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含針對(duì)所述選擇標(biāo)記基因的至少一種選擇化合物，由此允許包含植物細(xì)胞的至少一個(gè)從頭形成的枝條的形成，所述植物細(xì)胞包含所述選擇標(biāo)記基因的所述至少一個(gè)植物表達(dá)盒， (iv)分離包含所述至少一個(gè)從頭形成的枝條的所述初生葉節(jié)或更高葉節(jié)的分生組織，并將所述分生組織區(qū)轉(zhuǎn)移到水培培養(yǎng)基上，所述水培培養(yǎng)基包含針對(duì)所述選擇標(biāo)記基因的至少一種選擇化合物，并允許所述至少一個(gè)從頭形成的枝條伸長(zhǎng)，和 (v)從所述如此來源的小植株再生轉(zhuǎn)基因植物。
15.通過權(quán)利要求9的方法獲得的植物，特別是通過權(quán)利要求9的方法獲得的已經(jīng)開花的植物。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK103826439SQ201280036070
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2012年7月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月22日
【發(fā)明者】Y-F·常, A·S·萬古麗, L·格里斯特, H·圖特勒, H·P·洪, P·奧爾霍夫特 申請(qǐng)人:巴斯夫植物科學(xué)有限公司