適合于在植物中成像和投遞應(yīng)用的量子點(diǎn)載體肽綴合物的制作方法

適合于在植物中成像和投遞應(yīng)用的量子點(diǎn)載體肽綴合物的制作方法【專利摘要】本發(fā)明提供了用于將感興趣的分子導(dǎo)入具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞中的方法，其通過使用具有量子點(diǎn)(QD)與一種或多種細(xì)胞穿透肽(CPP)的QD-肽綴合物進(jìn)行。提供了用于遺傳或以其它方式修飾植物及用于治療或預(yù)防包含細(xì)胞壁的植物細(xì)胞中的疾病的方法。【專利說明】適合于在植物中成像和投遞應(yīng)用的量子點(diǎn)載體肽綴合物[0001]優(yōu)先權(quán)要求[0002]本申請要求2011年3月23日提交的美國臨時(shí)專利申請流水號61/466，804的權(quán).、Mo【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0003]本公開內(nèi)容一般涉及用于將感興趣的分子導(dǎo)入具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞中的方法，其通過使用具有量子點(diǎn)(QD)與一種或多種細(xì)胞穿透肽(CPP)的QD-肽綴合物進(jìn)行。[0004]發(fā)明背景[0005]納米顆粒具有的獨(dú)特性質(zhì)已經(jīng)被利用于將DNA投遞至細(xì)胞。金屬納米顆粒，諸如金(Au)納米顆粒由于其低細(xì)胞毒性和容易用各種有生物學(xué)意義的配體官能化而已經(jīng)用于DNA投遞。在金屬納米顆粒外,還已經(jīng)使用大小范圍3-5nm內(nèi)的半導(dǎo)體納米顆粒(例如量子點(diǎn))(“QD”)作為載體來將分子投遞到細(xì)胞中。DNA和蛋白質(zhì)可以連接到附接于QD表面的配體(見例如F.Patolsky等，J.Am.Chem.Soc.125，13918(2003))。[0006]已經(jīng)使用納米顆粒來將質(zhì)粒DNA投遞到多種動物細(xì)胞。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了，在將經(jīng)DNA包被的納米顆粒與沒有細(xì)胞壁的細(xì)胞一起溫育時(shí)，細(xì)胞吸收納米顆粒，并開始表達(dá)DNA上編碼的任何基因。然而，由于植物細(xì)胞壁的存在，當(dāng)前的植物基因投遞是挑戰(zhàn)性的，這導(dǎo)致對用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的侵入性投遞手段的常見依賴。在期望對通常具有細(xì)胞壁的細(xì)胞進(jìn)行納米顆粒介導(dǎo)的投遞的情況中，在將顆粒添加至植物原生質(zhì)體前將細(xì)胞壁剝離(見F.Torney等，NatureNanotechnol.2,(2007))。在植物細(xì)胞中，細(xì)胞壁作為投遞外源施用的分子的障礙。已經(jīng)采用許多侵入性方法，如基因槍(生物射彈)、顯微注射、電穿孔、和土壤桿菌來實(shí)現(xiàn)向這些有壁的植物細(xì)胞中的基`因和小分子投遞，但是僅僅通過顯微注射實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)投遞。在存在植物細(xì)胞壁的情況中投遞小分子和蛋白質(zhì)仍是未經(jīng)探索的，并且為了開發(fā)要應(yīng)用于完整的植物細(xì)胞/組織或器官以進(jìn)行體外和體內(nèi)操作的使能技術(shù)其會是有利的。[0007]細(xì)胞穿透肽(CPP)是一類新的且快速增長的短肽，已知其在將一大批包含蛋白質(zhì)和DNA的貨物復(fù)合物易位穿過哺乳動物和人細(xì)胞系的生物膜時(shí)發(fā)揮重要的作用。J.Schwartz和S.Zhang(2000)，PeptideMediatedCellularDelivery,Curr.0pin.Mo1.Ther.2:162-167;ULangel(2002),Prefacein:CelIPenetratingPeptides;ProcessesandApplications,U.LangeI,Editor,CRCPress,BocaRaton;E.Vives和B.Lebleu(2002)，TheTatDerivedCellPenetratingPeptidein:CellPenetratingPeptides;ProcessesandApplications,U.Langel,Editor,CRCPress,BocaRaton:第3頁-第22頁。雖然已經(jīng)顯示了CPP有助于哺乳動物細(xì)胞中的貨物投遞，但是在植物細(xì)胞中使用CPP以進(jìn)行轉(zhuǎn)染的研究受限于許多因素。使此技術(shù)適合于植物的主要障礙在于，與動物細(xì)胞不同，植物細(xì)胞給CPP及其貨物的內(nèi)在化呈現(xiàn)出雙重屏障系統(tǒng)(細(xì)胞壁和質(zhì)膜)。因此，為了有效易位CPP必須克服這兩種屏障。CPP已經(jīng)在植物細(xì)胞中使用，但是通常依賴于與使用CPP—起的透化劑和技術(shù)的使用以實(shí)現(xiàn)對植物細(xì)胞投遞貨物投遞。HIV1TAT蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)是得到最充分研究的易位肽之一。最近的報(bào)告已經(jīng)顯示了TATPTD及其寡聚物用于質(zhì)粒投遞的潛力，其通過與哺乳動物細(xì)胞中帶負(fù)電荷的DNA形成復(fù)合物來實(shí)現(xiàn)。1.1gnatovich,E.Dizhe,A.Pavlotskaya,B.Akifiev,S.Burov,S.0rlov和A.Perevozchikov(2003)，ComplexesofPlasmidDNAwithBasicDomain47—57oftheHIVITatProteinAreTransferredtoMammalianCellsbyEndocytosismediatedPathways,J.Biol.Chem.278:42625-42636;C.Rudolph,C.Plank,J.Lausier,U.Schillinger,R.H.Miiller,andJ.Rosenecker(2003),OligomersoftheArginineRichMotifoftheHIVITATProteinareCapableofTransferringPlasmidDNAintoCells,J.Biol.Chem.278:11411-11418;Z.Siprashvili,F.Scholl,S.0liver,A.Adams,C.Contag,P.ffender,andP.Khavari(2003),GeneTransferviaReversiblePlasmidCondensationwithCysteineFlanked,InternalIySpacedArginineRichPeptides,Hum.Gene.Ther.14(13):1225-33;1.Hellgren,J.Gorman,andC.Sylven(2004),FactorsControllingtheEfficiencyofTatmediatedPlasmidDNATransfer,J.Drug.Target.12(1):39-47。已經(jīng)顯示具有移位特征的其它肽包括pVEC、transportan、penetratin、pep-1月太及其片段。[0008]用肽包被QD是一種在用于各種生物技術(shù)方法的納米顆粒表面工程化中已經(jīng)變得普遍的方法。例如，將細(xì)胞穿透肽，諸如聚精氨酸和TAT衍生的肽附著于QD表面已經(jīng)容許將QD移位入動物細(xì)胞中。最近，CPP已經(jīng)被廣泛用作媒介物，用于基礎(chǔ)和應(yīng)用生物醫(yī)學(xué)研究中的分子細(xì)胞投遞。憑借其幫助，現(xiàn)在有可能將膜不透性物質(zhì)如肽核酸(PNA)、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、或納米顆粒引入哺乳動物細(xì)胞中。使用CPP來將生物分子投遞到細(xì)胞中及其瞬時(shí)表達(dá)對植物生物學(xué)家具有不斷增加的吸引力。如此，仍然需要經(jīng)由使用基于納米顆粒的投遞來在植物中穩(wěn)定摻入基因和其它感興趣分子的方法。[0009]發(fā)明概述[0010]以下實(shí)施方案結(jié)合系統(tǒng)、工具和方法來描述，所述系統(tǒng)、工具和方法意為例示性和說明性，而非對范圍的限制。[0011]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括將感興趣的分子導(dǎo)入具有細(xì)胞壁的植物細(xì)[0012]胞中以實(shí)現(xiàn)植物和種子的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的方法。該方法包括提供所述具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞，并使量子點(diǎn)(QD)與一種或多種細(xì)胞穿透肽(CPP)相互作用以形成QD-肽綴合物，并將一種或多種感興趣的分子附接于所述一種或多種CPP以形成活化的QD-肽綴合物。將細(xì)胞和所述活化的QD-肽綴合物在容許將其攝取到所述具有細(xì)胞壁的細(xì)胞中置于彼此接觸中。[0013]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括穩(wěn)定表達(dá)基因的方法。該方法包括提供具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞，使量子點(diǎn)(QD)與一種或多種細(xì)胞穿透肽(CPP)相互作用以形成QD-肽綴合物，并將一種或多種基因附接于所述一種或多種CPP以形成活化的QD-肽綴合物。將具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞和活化的QD-肽綴合物置于彼此接觸中，并將QD-肽綴合物和一種或多種基因置于容許將其攝取到所述具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞中的條件下。然后，在具有植物細(xì)胞的植物后代中表達(dá)基因。[0014]本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案包括用于將分子物質(zhì)轉(zhuǎn)移入植物細(xì)胞中的方法。該方法包括使量子點(diǎn)(QD)與一種或多種細(xì)胞穿透肽(CPP)相互作用以形成QD-肽綴合物，并使所述QD-肽綴合物與質(zhì)粒DNA相互作用以形成活化的QD-肽綴合物結(jié)構(gòu)。使所述活化的QD-肽綴合物結(jié)構(gòu)與攜帶完整壁的植物細(xì)胞在允許所述一種或多種CPP和來自所述質(zhì)粒DNA的所述一種或多種基因攝取入所述植物細(xì)胞中的條件下接觸。[0015]本發(fā)明的另一個(gè)具體的實(shí)施方案包括篩選并鑒定植物轉(zhuǎn)化的方法。該方法包括提供具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞，使量子點(diǎn)(QD)與一種或多種細(xì)胞穿透肽(CPP)相互作用以形成QD-肽綴合物，并將一種或多種感興趣的分子附接于所述一種或多種CPP以形成活化的QD-肽綴合物。將所述具有細(xì)胞壁的細(xì)胞和所述活化的QD-肽綴合物置于彼此接觸中，并將QD-肽綴合物和感興趣分子置于容許將其攝取到所述具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞中的條件下。然后，對具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞成像。[0016]在上文所描述的例示性方面和實(shí)施方案外，其它方面和實(shí)施方案會因以下描述而變得顯而易見。[0017]附圖簡述[0018]圖1顯示了量子點(diǎn)/肽綴合物的實(shí)施方案。[0019]圖2顯示了pDAB3831的質(zhì)粒圖。[0020]發(fā)明詳述[0021]在以下的描述和表中，使用了許多術(shù)語。為了提供對說明書和權(quán)利要求書(包括此類術(shù)語給予的范圍)的清楚且一致的理解，提供了以下定義:[0022]回交。回交可以是育種人員將雜種后代往回與親本之一，例如第一代雜種F1與F1雜種的親本基因型之一重復(fù)雜交的方法。[0023]胚。胚可以是成熟的種子內(nèi)含有的小植物。`[0024]對除草劑的抗性。對一定劑量的除草劑的抗性指植物幸免于(即植物可以不被殺死)所述劑量的除草劑的能力。在一些情況中，耐受性植物可以暫時(shí)變黃或者在其它方面展現(xiàn)出一些除草劑誘導(dǎo)的損傷(例如，過度分蘗和/或生長抑制)，但是能恢復(fù)。[0025]穩(wěn)定化的。穩(wěn)定化的指從同一品種的近交植物的一個(gè)世代可再現(xiàn)地(reproducibly)傳遞給下一世代的植物特征。[0026]攝取。攝取指顆粒，諸如量子點(diǎn)、載體肽、細(xì)胞穿透肽和歸巢肽穿過細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的易位，其中所述易位不僅僅由于除攝取顆粒的細(xì)胞外的某物對顆粒賦予的動量而發(fā)生。僅由于對顆粒賦予的動量而引起顆粒穿過細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的易位的裝置或方法的非限制性例子是生物射彈、基因槍、顯微注射、和/或刺穿感染(impalefection)技術(shù)。[0027]在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可以在一種或多種肽上在各種和/或多個(gè)位點(diǎn)處工程化改造“添加”或“訪客”分子的多個(gè)附接位點(diǎn)或填充。此特性可以例如在細(xì)胞內(nèi)的分子位點(diǎn)的特異性靶向和編輯中采用，用于諸如生物模擬物、靶向投遞等領(lǐng)域，用于非遺傳修飾生物體選項(xiàng)，及在性狀和疾病抗性選項(xiàng)方面在多種樹或蔬菜作物中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化選項(xiàng)(Thispropertycanbeemployed,forexample,inspecifictargetingandeditingofmolecularsiteswithincellsforareassuchasbiomimetics，targeteddeliveries，fornongeneticallymodifiedorganismoptions,andtransienttransformationoptionsinavarietyoftreeorvegetablecropsfortraitanddiseaseresistanceoptions)。也可以采用本發(fā)明的實(shí)施方案來開發(fā)合適的生物傳感器。另外，可以與本發(fā)明的方法一起采用人工染色體(ACES)作為目前的真核載體的備選，用于精確靶向和同源重組選項(xiàng)。[0028]一般地，本發(fā)明的具體實(shí)施方案涉及適合于投遞帶負(fù)電荷的分子，諸如例如DNA/RNA的多功能性熒光納米顆粒的用途。在發(fā)光量子點(diǎn)(QD)的表面上摻入載體和細(xì)胞穿透肽(CPP)/歸巢肽(HP)(在本文中統(tǒng)稱為“CPP”)，諸如R9、TAT、MPG和Y_玉米醇溶蛋白。QD-肽綴合物用于以植物原位途徑對擬南芥(Arabidopsis)進(jìn)行有效DNA投遞。QD-肽生物綴合物沒有展現(xiàn)出與擬南芥花軸生長和結(jié)籽相關(guān)的毒性效應(yīng)。鑒定出幾種穩(wěn)定的Tl轉(zhuǎn)化體，并分析幼苗。在植物中顯示了基于載體的DNA投遞和使用QD建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。可以用巧妙的選項(xiàng)工程化改造復(fù)合物有效負(fù)載以投遞生物分子并被精確靶向至細(xì)胞和細(xì)胞區(qū)室中。在具體的實(shí)施方案中，此類自身熒光QD的用途可以用于植物中的成像選項(xiàng)。[0029]依照本發(fā)明的某些實(shí)施方案，可以提供一種將感興趣的分子導(dǎo)入具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞中以實(shí)現(xiàn)植物和種子的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的方法。該方法包括提供具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞，并使量子點(diǎn)(QD)與一種或多種細(xì)胞穿透肽(CPP)相互作用，以形成QD-肽綴合物，并將一種或多種感興趣的分子附著于一種或多種CPP以形成活化的QD-肽綴合物。將細(xì)胞和活化的QD-肽綴合物在容許其攝取到具有細(xì)胞壁的細(xì)胞中的條件下置于彼此接觸中。[0030]在一些實(shí)施方案中，將幾種肽與QD納米顆粒共價(jià)偶聯(lián)，并投遞到植物細(xì)胞中。將具有R9、Y-玉米醇溶蛋白和MPGCPP的納米顆粒成功投遞到植物中以實(shí)現(xiàn)植物的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。在其它實(shí)施方案中，使用經(jīng)標(biāo)記的生物分子來追蹤貨物在細(xì)胞質(zhì)中的命運(yùn)。實(shí)現(xiàn)這些QD-肽-DNA綴合物的有效攝取，并且DNA和QD-肽綴合物之間的復(fù)合物是穩(wěn)定的，如通過經(jīng)由回收的種子和抗性Tl幼苗傳遞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化證明的。[0031]在其它方面，本發(fā)明涉及QD“載體”肽-綴合物作為有效負(fù)載的應(yīng)用，用于巧妙投遞生物官能化生物分子(例如DNA/RNA和酶投遞)的多官能化選項(xiàng)、成像及用于各種生物技術(shù)診斷學(xué)和感測功能。本策略可以提供相當(dāng)能適用的表面和包囊化學(xué)，如此促進(jìn)一大批具有不同官能性的分子的合成。就這些材料在生物分子和基因投遞中的潛在用途而言的關(guān)鍵特性以此類系統(tǒng)中可用的末端基團(tuán)的高密度限定。這些促成分子表面特征，提供多個(gè)附著位點(diǎn)(例如，用于綴合信號或靶向模塊)，以及測定分子體積，其對于將其它分子螯合至此復(fù)合物的能力是重要的。綴合的載體肽在QD和附著的貨物兩者投遞方面同時(shí)發(fā)揮功能。此外，通過將貨物與載體肽直接復(fù)合，可以消除QD表面上附著種類數(shù)目的權(quán)衡。由于帶負(fù)電荷的寡核苷酸不能自身移位細(xì)胞壁/膜屏障和細(xì)胞膜，本發(fā)明提供了用于DNA整合、基因調(diào)節(jié)、和編輯策略的有效投遞系統(tǒng)，等等。[0032]依照本發(fā)明的實(shí)施方案，具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞可以是包含完整且全部細(xì)胞壁的任何植物細(xì)胞。具有細(xì)胞壁的細(xì)胞的例子包括但不限于藻類、煙草、胡蘿卜、玉米、蕓苔(canola)、油菜籽、棉花、棕櫚、花生、大豆、甘鹿、稻屬物種(Oryzasp.)、擬南芥屬物種(Arabidopsissp.)、和蓖麻屬物種(Ricinussp.),優(yōu)選地?zé)煵?、胡蘿卜、玉米、棉花、蕓苔、大豆和甘蔗；更優(yōu)選地?zé)煵莺秃}卜。本發(fā)明的實(shí)施方案可以包括來自任何組織或它們存在的任何地方的包含細(xì)胞壁的細(xì)胞，包括但不限于在胚、分生細(xì)胞、愈傷組織、花粉、葉、花藥、根、根尖、花、種子、莢果、莖和組織培養(yǎng)物中。[0033]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，感興趣的分子可以是可以投遞到依照本發(fā)明的植物細(xì)胞的任何分子。感興趣的分子或感興趣分子的組分可以包含但不限于核酸、DNA、RNA、RNAi分子、基因、質(zhì)粒、粘粒、YAC、BAC、植物人工染色體、植物微型染色體、植物工程性狀基因座DNA;多肽、酶、激素、糖肽、糖、脂肪、信號傳導(dǎo)肽、抗體、維生素、信使、第二信使、氨基酸、cAMP、藥物、除草劑、殺真菌劑、抗生素、和/或其組合。[0034]本發(fā)明的實(shí)施方案包括用于預(yù)防或治療疾病的方法。非限制性的例示性實(shí)施方案包括使用本發(fā)明的方法對有此需要的細(xì)胞投遞殺真菌劑、抗生素、和/或其它藥物。[0035]在本發(fā)明的方面，QD-肽綴合物可以被攝取入細(xì)胞的各個(gè)部分中。可以攝取QD-肽綴合物的位置的例子包括但不限于胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞核、液泡形成體、質(zhì)體、黃化質(zhì)體、色質(zhì)體、白色體、油質(zhì)體、蛋白質(zhì)體、造粉體、葉綠體、和雙層膜的腔。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，可以經(jīng)由共質(zhì)體或質(zhì)外體途徑發(fā)生包含細(xì)胞壁的細(xì)胞對QD-肽綴合物的攝取。[0036]本發(fā)明的其它實(shí)施方案包括經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞及其生成方法，其中植物細(xì)胞具有經(jīng)由本發(fā)明的方法導(dǎo)入其中的一種或多種核酸。在實(shí)施方案的一個(gè)例子中，可以經(jīng)由依照本發(fā)明的QD-肽綴合物將包含感興趣的基因和選擇標(biāo)志的質(zhì)粒導(dǎo)入具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞中。在其它實(shí)施方案中，可以選擇已經(jīng)穩(wěn)定地整合了感興趣的基因和/或選擇標(biāo)志的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。在備選的實(shí)施方案中，可以增殖現(xiàn)在包含感興趣的基因的植物細(xì)胞以生成包含感興趣的分子的其它細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，現(xiàn)在包含感興趣的分子的植物細(xì)胞可以是可再生細(xì)胞，其可以用于再生包含感興趣的分子的全植物。[0037]在另一方面，本發(fā)明提供了創(chuàng)建在組織培養(yǎng)中使用的包含感興趣分子的可再生植物細(xì)胞的方法。優(yōu)選地，組織培養(yǎng)將能夠再生與所述可再生細(xì)胞具有基本上相同的基因型的植物。此類組織培養(yǎng)物中的可再生細(xì)胞可以是胚、原生質(zhì)體、分生細(xì)胞、愈傷組織、花粉、葉、花藥、根、根尖、花、種子、莢果或莖。更進(jìn)一步，本發(fā)明的實(shí)施方案提供了自本發(fā)明的組織培養(yǎng)物再生的植物。[0038]或者，本發(fā)明提供了將期望的性狀導(dǎo)入具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞中的方法，其中該方法包括:將QD-肽綴合物和能夠?yàn)橹参锛?xì)胞提供期望的性狀的感興趣分子置于與細(xì)胞的接觸中，并允許所述QD-肽綴合物被攝取穿過細(xì)胞壁。期望性狀的例子包括但不限于選自下組的性狀:雄性不育、除草劑抗性、昆蟲抗性、和對細(xì)菌性疾病、真菌性疾病、和/或病毒性疾病的抗性。[0039]本發(fā)明的其它方面提供了生成包含期望的性狀或感興趣分子的穩(wěn)定化植物系的方法，其中可以首先通過穿過植物細(xì)胞壁攝取QD-肽綴合物來導(dǎo)入期望的性狀或感興趣的分子。生成穩(wěn)定化的植物系的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的，并且可以包括如下的技術(shù)，諸如但不限于自交、回交、雜種生成、群體雜交等。包含首先通過穿過細(xì)胞壁攝取QD-肽綴合物來導(dǎo)入植物細(xì)胞(或其祖先)中的期望的性狀或感興趣分子的所有植物和植物細(xì)胞在本發(fā)明范圍內(nèi)。有利地，包含首先通過穿過細(xì)胞壁攝取QD-肽綴合物來導(dǎo)入植物或細(xì)胞(或其祖先)中的期望的性狀或感興趣分子的植物細(xì)胞可以用于與其它不同植物細(xì)胞雜交以生成具有卓越特征的第一代(F1)雜種細(xì)胞、種子、和/或植物。[0040]在感興趣的分子包含一種或多種基因的實(shí)施方案中，基因可以是顯性或隱性等位基因。舉例而言，所述基因會賦予的性狀諸如除草劑抗性、抗蟲性、細(xì)菌抗性、真菌抗性、病毒疾病抗性、雄性能育、雄性不育、提高的營養(yǎng)質(zhì)量、和工業(yè)用途。[0041]隨著使分離和表征編碼特定蛋白質(zhì)或RNA產(chǎn)物(例如RNAi)的基因成為可能的分子生物學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)，植物生物學(xué)領(lǐng)域的科學(xué)家對以下方面形成了強(qiáng)烈的興趣，即工程化改造細(xì)胞的基因組以含有和表達(dá)外來基因，或者另外的或經(jīng)修飾型式的天然或內(nèi)源基因(可能由不同啟動子驅(qū)動)，以便以特定的方式改變細(xì)胞的性狀。此類外來的另外的和/或經(jīng)修飾的基因在本文中統(tǒng)稱為“轉(zhuǎn)基因”。在過去15至20年里，已經(jīng)開發(fā)了數(shù)種用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的方法，并且在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化型式的細(xì)胞及其生成方法，其通過經(jīng)由穿過細(xì)胞壁攝取QD-肽綴合物將轉(zhuǎn)基因?qū)刖哂屑?xì)胞壁的細(xì)胞來進(jìn)行。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因可以包含在表達(dá)載體中。[0042]細(xì)胞轉(zhuǎn)化可以牽涉構(gòu)建會在特定細(xì)胞中發(fā)揮功能的表達(dá)載體。此類載體可以包含包括在調(diào)節(jié)元件(例如啟動子)控制下的或者與調(diào)節(jié)元件(例如啟動子)可操作連接的基因的DNA。表達(dá)載體可以含有一種或多種此類可操作連接的基因/調(diào)節(jié)元件組合。載體可以是質(zhì)粒形式，而且可以單獨(dú)或者與其它質(zhì)粒聯(lián)合使用，以如下文所描述的那樣使用轉(zhuǎn)化方法提供經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，從而將轉(zhuǎn)基因摻入包含細(xì)胞壁的植物細(xì)胞的遺傳物質(zhì)中。[0043]依照本發(fā)明方法的QD-肽綴合物的使用已經(jīng)生成了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物，并且以表型表明了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的除草劑基因的表達(dá)，在所述表型中賦予了轉(zhuǎn)基因Tl植物高除草劑耐受性。顯示了此植物是能育的，因?yàn)樗闪薚2種子。[0044]用于經(jīng)由QD-肽綴合物攝取的表達(dá)載體:標(biāo)志物基因[0045]表達(dá)載體可以包括至少一種與調(diào)節(jié)元件(例如啟動子)可操作連接的遺傳標(biāo)志，其容許通過負(fù)選擇(即抑制不含該選擇標(biāo)志基因的細(xì)胞生長)或者通過正選擇(即篩選由該遺傳標(biāo)志編碼的產(chǎn)物)回收含有所述標(biāo)志的經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞。許多用于轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)志基因是轉(zhuǎn)化領(lǐng)域中公知的，包括例如編碼在代謝上使可以作為抗生素或除草劑的選擇性化學(xué)劑解毒的酶的基因，或者編碼可對抑制劑不敏感的改變了的靶物的基因。幾種正選擇方法也是本領(lǐng)域中已知的。[0046]一種通常適合于植物轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)志基因可以包括在植物調(diào)節(jié)信號控制下的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(nptll)基因，其賦予對卡那霉素的抗性。參見例如Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.,80:4803(1983)。另一種常用的選擇標(biāo)志基因可以是潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，其賦予對抗生素潮霉素的抗性。參見例如VandenElzen等，PlantMol.Biol.,5:299(1985)。[0047]賦予對抗生素抗性的細(xì)菌起源的另外的選擇標(biāo)志基因包括慶大霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、氨基糖苷-3’-腺苷酰轉(zhuǎn)移酶(adenyltransferase)和博來霉素抗性決定子。參見Hayford等，PlantPhysiol.86:1216(1988);Jones等，Mol.Gen.Genet.,210:86(1987)；Svab等,PlantMol.Biol.14:197(1990)；Hille等,PlantMol.Biol.7:171(1986)。其它選擇標(biāo)志基因賦予對除草劑諸如草甘膦、草銨膦(glufosinate)或溴苯臆(bromoxynil)的抗性。參見Comai等，Nature317:741-744(1985)；GordonKamm等，PlantCell2:603-618(1990);和Stalker等，Science242:419-423(1988)。[0048]其它適合于植物轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)志基因不是細(xì)菌起源的。這些基因包括例如小鼠二氫葉酸還原酶、植物5-烯醇丙酮酰莽草酸(enolpyruvylshikimate)-3_磷酸合酶和植物乙酸乳酸合酶。參見Eichholtz等，SomaticCellMol.Genet.13:67(1987);Shah等，Science233:478(1986);Charest等，PlantCellRep.8:643(1990)。[0049]另一類適合于植物轉(zhuǎn)化的標(biāo)志基因需要篩選據(jù)推測經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，而不對經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞直接遺傳選擇對毒性物質(zhì)諸如抗生素的抗性。這些基因特別可用于量化或顯現(xiàn)基因在特定組織中表達(dá)的空間樣式，并且通常稱為報(bào)告基因，因?yàn)樗鼈兛梢耘c基因或基因調(diào)節(jié)序列融合以調(diào)查基因表達(dá)。通常用于篩選經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的基因包括(6-葡糖醛酸糖苷酶(OTS)、^-半乳糖苷酶、螢光素酶和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶。參見Jefferson，R.A.，PlantMol.Biol.Rep.5:387(1987);Teeri等，EMBOJ.8:343(1989);Koncz等，Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.84:131(1987)；DeBlock等，EMBOJ.3:1681(1984)。[0050]最近，已經(jīng)可獲得用于顯現(xiàn)⑶S活性的體內(nèi)方法，其不需要破壞植物組織。MolecularProbespublication2908,Imagene,Green?,第I頁-第4頁(1993)；和Naleway等，J.CellBiol.115:151a(1991)。然而，還沒有證明這些用于顯現(xiàn)⑶S活性的體內(nèi)方法對于回收經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是有用的，這是由于低靈敏度、高熒光背景和與使用螢光素酶基因作為選擇標(biāo)志有關(guān)的限制。[0051]新近，已經(jīng)利用編碼熒光蛋白(例如，GFP、EGFP,EBFP,ECFPjPYFP)的基因作為原核和真核細(xì)胞中基因表達(dá)的標(biāo)志物。參見Chalfie等，Science263:802(1994)。熒光蛋白和熒光蛋白突變體可以作為可篩選標(biāo)志物使用。[0052]用于經(jīng)由QD-肽綴合物攝取的表達(dá)載體:啟動子[0053]表達(dá)載體中包含的基因必須由包含調(diào)節(jié)元件(例如啟動子)的核苷酸序列驅(qū)動。數(shù)種類型的啟動子現(xiàn)在是轉(zhuǎn)化領(lǐng)域中公知的，可以單獨(dú)使用或者與啟動子聯(lián)合使用的其它調(diào)節(jié)元件也是如此。[0054]如本文中所使用的，“啟動子”包括提及如下的DNA區(qū)域，其可以在轉(zhuǎn)錄起始的上游，而且可以牽涉識別和結(jié)合RNA聚合酶和其它蛋白質(zhì)以啟動轉(zhuǎn)錄?！爸参飭幼印笨梢允悄軌蛟谥参锛?xì)胞中啟動轉(zhuǎn)錄的啟動子。在發(fā)育控制下的啟動子的例子包括優(yōu)先在某些組織諸如葉、根、種子、纖維、木質(zhì)部導(dǎo)管、管胞、或厚壁組織中啟動轉(zhuǎn)錄的啟動子。此類啟動子稱為“組織優(yōu)選性的”。僅在某些組織中啟動轉(zhuǎn)錄的啟動子稱為“組織特異性的”?！凹?xì)胞類型”特異性啟動子主要在一種或多種器官中的某些細(xì)胞類型(例如根或葉中的維管細(xì)胞)中驅(qū)動表達(dá)?！罢T導(dǎo)型”啟動子可以是可在環(huán)境控制下的啟動子?？烧兄抡T導(dǎo)型啟動子轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的例子包括缺氧條件或光的存在。組織特異性的、組織優(yōu)選性的、細(xì)胞類型特異性的、和誘導(dǎo)型啟動子構(gòu)成“非組成性”啟動子類?！敖M成性”啟動子可以是可在大多數(shù)環(huán)境條件下有活性的啟動子。[0055]A.誘導(dǎo)型啟動子[0056]可以將誘導(dǎo)型啟動子與細(xì)胞中表達(dá)的基因可操作連接。任選地，可以將誘導(dǎo)型啟動子與編碼信號序列的核苷酸序列可操作連接，所述核苷酸序列可以與用于在細(xì)胞中表達(dá)的基因可操作連接。通過誘導(dǎo)型啟動子，轉(zhuǎn)錄速率響應(yīng)誘導(dǎo)劑而升高。[0057]可以在本發(fā)明中使用任何誘導(dǎo)型啟動子。參見Ward等，PlantMol.Biol.22:361-366(1993)。例示性誘導(dǎo)型啟動子包括但不限于:那些響應(yīng)銅的ACEI系統(tǒng)的啟動子(Mett等，PNAS90:4567-4571(1993));響應(yīng)苯磺酰胺除草劑安全劑的來自玉米的In2基因(Hershey等，Mol.Gen.Genetics227:229-237(1991);和Gatz等，Mol.Gen.Genetics243:32-38(1994));和來自TnlO的Tet阻抑物(Gatz等，Mol.Gen.Genetics227:229-237(1991))。特別有用的誘導(dǎo)型啟動子可以是響應(yīng)植物正常不響應(yīng)的誘導(dǎo)劑的啟動子。例示性誘導(dǎo)型啟動子可以是來自類固醇激素基因的誘導(dǎo)型啟動子，其轉(zhuǎn)錄活性可以受糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)。Schena等,Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.88:0421(1991)。[0058]B.組成性啟動子[0059]將組成性啟動子與細(xì)胞中表達(dá)的基因可操作連接，或者可以將組成性啟動子與編碼信號序列的核苷酸序列可操作連接，所述編碼信號序列的核苷酸序列可以與用于在細(xì)胞中表達(dá)的基因可操作連接。[0060]可以在本發(fā)明中利用不同的組成性啟動子。例示性的組成性啟動子包括但不限于:來自植物病毒的啟動子，諸如來自CaMV的35S啟動子(Odell等，Nature313:810-812(1985));來自稻肌動蛋白基因的啟動子(McElroy等，PlantCell2:163-171(1990))；來自泛素的啟動子(Christensen等，PlantMol.Biol.12:619-632(1989)，和Christensen等,PlantMol.Biol.18:675-689(1992))；來自pEMU的啟動子(Last等，Theor.Appl.Genet.81:581-588(1991));來自MAS的啟動子(Velten等，EMB0J.3:2723-2730(1984));和來自玉米H3組蛋白的啟動子(Lepetit等，Mol.Gen.Genetics231:276-285(1992),和Atanassova等，PlantJournal2(3):291-300(1992))。ALS啟動子，即歐洲油菜(Brassicanapus)ALS3結(jié)構(gòu)基因5’的Xbal/Ncol片段(或與所述Xbal/Ncol片段相似的核苷酸序列)代表一種特別有用的組成性啟動子。參見PCT申請WO96/30530。[0061]C.組織特異性或組織優(yōu)選性啟動子[0062]可以將組織特異性啟動子與用于在細(xì)胞中表達(dá)的基因可操作連接。任選地，可以將組織特異性啟動子與編碼信號序列的核苷酸序列可操作連接，所述編碼信號序列的核苷酸序列可以與用于在細(xì)胞中表達(dá)的基因可操作連接。用與組織特異性啟動子可操作連接的感興趣基因轉(zhuǎn)化的植物可以專門或優(yōu)先在特定組織中生成轉(zhuǎn)基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。[0063]可以在本發(fā)明中利用任何組織特異性或組織優(yōu)選性啟動子。例示性組織特異性或組織優(yōu)選性啟動子包括但不限于:根優(yōu)選性啟動子，諸如來自菜豆蛋白基因的啟動子(Murai等,Science23:476-482(1983)，和SenguptaGopalan等,Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.82:3320-3324(1985))；葉特異性和光誘導(dǎo)型啟動子，諸如來自cab或1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(rubisc`o)的啟動子(Simpson等，EMBOJ.4(11):2723-2729(1985)，和Timko等，Nature318:579-582(1985));花藥特異性啟動子，諸如來自LAT52的啟動子(Twell等，Mol.Gen.Genetics217:240-245(1989));花粉特異性啟動子，諸如來自Zml3的啟動子(Guerrero等，Mol.Gen.Genetics244:161-168(1993))或小孢子優(yōu)選性啟動子，諸如來自apg的啟動子(Twell等，Sex.PlantReprod.6:217-224(1993))。[0064]可以通過將編碼信號序列的核苷酸序列可操作連接至編碼感興趣蛋白質(zhì)的基因的5’和/或3’區(qū)域的手段來實(shí)現(xiàn)由轉(zhuǎn)基因生成的蛋白質(zhì)向亞細(xì)胞區(qū)室諸如葉綠體、液泡、過氧化物酶體、乙醛酸循環(huán)體、細(xì)胞壁或線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)或者分泌入質(zhì)外體中?？梢栽诘鞍踪|(zhì)合成和加工過程中測定在結(jié)構(gòu)基因的5’和/或3’端的靶向序列，其中編碼的蛋白質(zhì)最后可以被區(qū)室化(compartmentalized)?；蛘?可以將此類亞細(xì)胞區(qū)室祀向性蛋白質(zhì)與QD-肽綴合物直接連接以將用感興趣的分子包被的QD-肽綴合物引導(dǎo)至期望的亞細(xì)胞區(qū)室。[0065]信號序列的存在將多肽引導(dǎo)至胞內(nèi)細(xì)胞器或亞細(xì)胞區(qū)室，或者分泌至質(zhì)外體。許多信號序列是本領(lǐng)域中已知的。參見例如Becker等，PlantMol.Biol.20:49(1992)；P.S.Close,Master’sThesis,1waStateUniversity(1993)；C.Knox等,“StructureandOrganizationofTwoDivergentAlpha-AmylaseGenesfromBarley,，，PlantMol.Biol.9:3-17(1987)；Lerner等，PlantPhysiol.91:124-129(1989)；Fontes等，PlantCell3:483-496(1991)；Matsuoka等，Proc.NatlAcad.Sc1.88:834(1991)；Gould等，J.Cell.Biol.108:1657(1989);Creissen等，PlantJ.2:129(1991)；Kalderon等，Ashortaminoacidsequenceabletospecifynuclearlocation,CelI39:499-509(1984);Steifel等，ExpressionofamaizecellwallhydroxyproIine~richglycoproteingeneinearlyleafandrootvasculardifferentiation,PlantCell2:785-793(1990)。[0066]外來蛋白質(zhì)基因和農(nóng)藝學(xué)基因[0067]通過根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物，可以以商業(yè)量生產(chǎn)外來蛋白質(zhì)。如此，用于選擇和繁殖經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的技術(shù)(它們是本領(lǐng)域中充分了解的)產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)基因植物，它們以常規(guī)方式收獲，然后可以從感興趣的組織或總生物量提取外來蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^由例如Heney和Orr,Anal.Biochem.114:92-6(1981)所討論的已知方法來實(shí)現(xiàn)從植物生物量的蛋白質(zhì)提取。[0068]在本發(fā)明的各方面，為商業(yè)生產(chǎn)外來蛋白質(zhì)提供的轉(zhuǎn)基因植物可以是細(xì)胞或植物。在其它方面，感興趣的生物量可以是種子。對于相對少數(shù)的顯示較高表達(dá)水平的轉(zhuǎn)基因植物，可以主要經(jīng)由常規(guī)的RFLP、PCR和SSR分析(其鑒定整合DNA分子的近似染色體位置)來產(chǎn)生遺傳圖譜。關(guān)于這方面的例示性方法,參見Glick和Thompson,MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,CRCPress,BocaRaton269:284(1993)。關(guān)于染色體位置的圖譜信息對于主題轉(zhuǎn)基因植物的所有權(quán)保護(hù)可以是有用的。如果可以進(jìn)行未經(jīng)授權(quán)的繁殖和與其它種質(zhì)進(jìn)行雜交，則可以將整合區(qū)域的圖譜與可疑植物的類似圖譜進(jìn)行比較以確定后者是否與主題植物具有共同親本(parentage)。圖譜比較會牽涉雜交、RFLP,PCR、SSR和測序，它們都是常規(guī)技術(shù)。[0069]同樣地，可以在經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或其后代中表達(dá)農(nóng)藝學(xué)基因。更具體地，可以經(jīng)由本發(fā)明的方法對植物進(jìn)行遺傳工程化改造以表達(dá)農(nóng)藝學(xué)感興趣的各種表型?？梢栽谶@方面使用的例示性基因包括但不限于下文進(jìn)行歸類的基因。[0070]1.賦予對害蟲或疾病的抗性并編碼下列各項(xiàng)的基因:[0071]A)植物疾病抗性基因。植物防御常常由植物中的疾病抗性基因(R)產(chǎn)物與病原體中相應(yīng)無毒力(Avr)基因產(chǎn)物之間的特異性相互作用激活?？梢杂每寺〉目剐曰蜣D(zhuǎn)化植物品種以工程化改造對特定病原體株有抗性的植物。參見例如Jones等，Science266:789(1994)(克隆對黃枝孢霉(Cladosporiumfulvum)有抗性的番茄Cf_9基因)；Martin等,Science262:1432(1993)(對丁香假單胞菌番爺致病變種(Pseudomonassyringaepv.tomato)有抗性的番爺Pto基因編碼蛋白質(zhì)激酶)；Mindrinos等，Cell78:1089(1994)(對丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)有抗性的擬南芥(Arabidops)RSP2基因)。[0072]B)賦予對害蟲諸如大豆胞囊線蟲有抗性的基因。參見例如PCT申請WO96/30517；PCT申請WO93/19181。[0073]C)蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)蛋白、其衍生物或以其為模型的合成多肽。參見例如Geiser等，Gene48:109(1986)，其披露了BtS-內(nèi)毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，編碼S-內(nèi)毒素基因的DNA分子可以購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection),Manassas,Va.,例如以ATCC保藏號40098、670136、31995和31998購得。[0074]D)凝集素。參見例如VanDamme等，PlantMolec.Biol.24:25(1994)的公開內(nèi)容，其披露了數(shù)種君子蘭(Cliviaminiata)甘露糖結(jié)合凝集素基因的核苷酸序列。[0075]E)維生素結(jié)合蛋白諸如抗生物素蛋白。參見PCT申請US93/06487。該申請教導(dǎo)了抗生物素蛋白和抗生物素蛋白同源物作為針對蟲害的殺幼蟲劑的用途。[0076]F)酶抑制劑，例如蛋白酶或蛋白水解酶抑制劑或淀粉酶抑制劑。參見例如Abe等，J.Biol.Chem.262:16793(1987)(稻半胱氨酸蛋白水解酶抑制劑的核苷酸序列);Huub等，PlantMolec.Biol.21:985(1993)(編碼煙草蛋白水解酶抑制劑I的cDNA的核苷酸序列)；Sumitani等,Biosc1.Biotech.Biochem.57:1243(1993)(硝抱鏈霉菌(Streptomycesnitrosporeus)a-淀粉酶抑制劑的核苷酸序列)；和美國專利號5，494，813(Hepher和Atkinson,1996年2月27日公開)。[0077]G)昆蟲特異性激素或信息素，諸如蛻皮類固醇或保幼激素，其變體、基于其的模擬物、或其拮抗劑或激動劑。參見例如Hammock等，Nature344:458(1990)披露的克隆的保幼激素酯酶(即一種保幼激素滅活劑)的桿狀病毒表達(dá)的內(nèi)容。[0078]H)昆蟲特異性肽或神經(jīng)肽，其在表達(dá)后破壞受到影響的害蟲的生理學(xué)。例如參見Regan,J.Biol.Chem.269:9(1994)(表達(dá)克隆產(chǎn)生編碼昆蟲利尿激素受體的DNA)和Pratt等,Biochem.Biophys.Res.Comm.163:1243(1989)(可以在太平洋折翅爐(Diplopterapuntata)中鑒定出咽側(cè)體抑制素(allostatin))的公開內(nèi)容。還可參見Tomalski等的美國專利號5，266，317，其披露了編碼昆蟲特異性、麻痹性神經(jīng)毒素的基因。[0079]I)在自然界由蛇、黃蜂(wasp)或任何其它生物體生成的昆蟲特異性毒液。例如參見Pang等，Gene116:165(1992)，是關(guān)于編碼蝎昆蟲毒性肽的基因在植物中的異源表達(dá)的公開內(nèi)容。[0080]J)酶，其負(fù)責(zé)超積累單萜、倍半萜、類固醇、異羥肟酸、類苯丙烷衍生物或另一具有殺昆蟲活性的非蛋白質(zhì)分子。[0081]K)牽涉對生物學(xué)活性分子的修飾(包括翻譯后修飾)的酶；例如，糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、環(huán)化酶、轉(zhuǎn)氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、彈性蛋白酶、殼多糖酶(chitinase)和葡聚糖酶(不管是天然的還是合成的)。參見以Scott等名義的PCT申請WO93/02197，其披露了callase基因的核苷酸序列。含有殼多糖酶編碼序列的DNA分子可以例如從ATCC以保藏號39637和67152獲得。還可參見Kramer等,InsectBiochem.Molec.Biol.23:691(1993)(其教導(dǎo)了編碼煙草天蛾殼多糖酶的cDNA的核苷酸序列)和Kawalleck等，PlantMolec.Biol.21:673(1993)(其提供了歐芹ubi4_2多聚泛素基因的核苷酸序列)。[0082]L)刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子。例如參見Botella等，PlantMolec.Biol.24:757(1994)(關(guān)于綠豆鈣調(diào)蛋白cDNA克隆的核苷酸序列)和Griess等,PlantPhysiol.104:1467(1994)(其提供了玉米鈣調(diào)蛋白cDNA克隆的核苷酸序列)的公開內(nèi)容。[0083]M)疏水矩妝(hydrophobicmomentpeptide)。參見PCT申請WO95/16776(抑制真菌植物病原體的鱟抗菌肽(Tachyplesin)的肽衍生物的公開內(nèi)容)和PCT申請WO95/18855(教導(dǎo)了賦予疾病抗性的合成抗微生物肽)。[0084]N)膜通透酶、通道形成劑或通道阻斷劑。例如參見Jaynes等，PlantSc1.89:43(1993)公開的殺菌肽-3溶胞肽類似物(cecropin-^lyticpeptideanalog)的異源表達(dá)以使轉(zhuǎn)基因煙草植物對青枯假單胞菌(Pseudomonassolanacearum)有抗性。[0085]0)病毒侵入蛋白或自其衍生的復(fù)合毒素。例如，病毒外殼蛋白在經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中的積累賦予對由可衍生出該外殼蛋白基因的病毒及相關(guān)病毒招致的病毒感染和/或疾病形成的抗性。參見Beachy等，Ann.rev.Phytopathol.28:451(1990)。已經(jīng)對經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物賦予了針對苜?；ㄈ~病毒、黃瓜花葉病毒、煙草線條病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、煙草蝕刻病毒、煙草脆裂病毒和煙草花葉病毒的外殼蛋白介導(dǎo)的抗性。同上。[0086]P)昆蟲特異性抗體或自其衍生的免疫毒素。如此，靶向昆蟲腸中的重要代謝功能的抗體會使受影響的酶失活，這殺死昆蟲。參見Taylor等，摘要號497，SeventhInt’ISymposiumonMolecularPlant-MicrobeInteractions(Edinburgh,Scotland)(1994)(經(jīng)由生成單鏈抗體片段進(jìn)行的轉(zhuǎn)基因煙草中的酶促失活)。[0087]Q)病毒特異性抗體。參見例如Tavladoraki等，Nature366:469(1993),其顯示了表達(dá)重組抗體基因的轉(zhuǎn)基因植物受到保護(hù)免于病毒攻擊。[0088]R)在自然界由病原體或寄生物生成的發(fā)育阻滯蛋白(developmental-arrestiveprotein)。例如，真菌內(nèi)a-1，4_D_多聚半乳糖醒酸酶通過溶解植物細(xì)胞壁同-a-1，4-D-半乳糖醒酸酶(galacturonase)來促進(jìn)真菌定殖(colonization)和植物營養(yǎng)物釋放。參見Lamb等，Bio/Technology10:1436(1992)。編碼豆內(nèi)多聚半乳糖醒酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征可以由Toubart等，PlantJ.2:367(1992)描述。[0089]S)在自然界由植物生成的發(fā)育阻滯蛋白。例如Logemann等，Bio/Technology10:305(1992)顯示了表達(dá)大麥核糖體失活基因的轉(zhuǎn)基因植物對真菌疾病具有升高的抗性。[0090]2.賦予對除草劑的抗性的基因:[0091]A)抑制生長點(diǎn)或分生組織的除草劑，諸如咪唑啉酮、磺酰胺或磺酰脲。在這類中的例示性基因編碼突變的ALS和AHAS酶，如分別由例如Lee等，EMBOJ.7:1241(1988)和Miki等,Theor.Appl.Genet.80:449(1990)所描述的。[0092]B)草甘膦(分別由例如突變體5-烯醇丙酮酰莽草酸(enolpyruvylshikimate)-3-磷酸合酶(EPSP)基因(經(jīng)由導(dǎo)入重組核酸和/或天然EPSP基因的體內(nèi)誘變的各種形式)、aroA基因和草甘膦乙酰基轉(zhuǎn)移酶(GAT)基因賦予的抗性)、其它膦?；衔镏T如草銨膦(glufosinate)(來自鏈霉菌屬物種(Streptomycesspecies),包括吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)和綠色產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesviridichromogenes)的草銨膦乙酰基轉(zhuǎn)移酶(PAT)基因)、和吡唳氧基或苯氧基丙酸和環(huán)己酮(ACC酶抑制劑編碼基因)，見例如Shah等的美國專利N0.4，940,835和Barry等的美國專利6，248，876，其披露了可以對植物賦予草甘膦抗性的EPSP形式的核苷酸序列。編碼突變體aroA基因的DNA分子可以以ATCC保藏號39256獲得，并且突變體基因的核苷酸序列可以在Comai的美國專利N0.4，769，061中披露。Kumada等的歐洲專利申請N0.0333033和Goodman等的美國專利N0.4，975，374披露了對除草劑諸如L-膦絲菌素(L-phophinothricin)賦予抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。PAT基因的核苷酸序列可以參見Leemans等的歐洲申請N0.0242246,DeGreef等，Bio/Technology7:61(1989)描述了生成表達(dá)編碼PAT活性的嵌合bar基因的轉(zhuǎn)基因植物。賦予對苯氧基丙酸和環(huán)己酮,諸如稀禾定(sethoxydim)和吡氟氯禾靈(haloxyfop)的抗性的基因的例子包括Marshall等，Theor.Appl.Genet.83:435(1992)描述的AcclSKAcclS2和AcclS3基因。能夠賦予草甘膦抗性的GAT基因記載于Castle等的WO2005012515。賦予對2，4-D、苯氧基丙酸和吡唳基氧基生長素除草劑的抗性的基因記載于歸于DowAgroSciencesLLC的TO2005107437。[0093]C)抑制光合作用的除草劑，諸如三嗪(psbA和gs+基因)或苯基氰(腈水解酶基因)。Przibila等，PlantCell3:169(1991)描述了用編碼突變的psbA基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化衣滴蟲(Chlamydomonas)。腈水解酶基因的核苷酸序列披露于Stalker的美國專利號4,810,648，并且含有這些基因的DNA分子可以以ATCC保藏號53435、67441、和67442獲得。編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的DNA的克隆和表達(dá)可以由Hayes等，Biochem.J.285:173(1992)描述。[0094]3.賦予或促成增值(value-added)性狀的基因,諸如:[0095]A)經(jīng)修飾的脂肪酸代謝，例如通過用硬脂酰-ACP去飽和酶的反義基因轉(zhuǎn)化植物以提高植物的硬脂酸含量。參見Knultzon等，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.89:2624(1992)。[0096]B)降低的肌醇六磷酸鹽含量——I)肌醇六磷酸酶編碼基因的導(dǎo)入會增強(qiáng)肌醇六磷酸鹽的分解，向經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物添加更多游離的磷酸鹽。例如，參見VanHartingsveldt等，Gene127:87(1993),關(guān)于黑曲霉(Aspergillusniger)肌醇六磷酸酶基因的核苷酸序列的公開內(nèi)容。2)可以導(dǎo)入降低肌醇六磷酸鹽含量的基因。例如在玉米中，這可以如下實(shí)現(xiàn)，即克隆與單一等位基因有關(guān)的DNA，然后再次導(dǎo)入，所述單一等位基因可以負(fù)責(zé)特征為低水平肌醇六磷酸的玉米突變體。參見Raboy等，Maydica35:383(1990)。[0097]C)例如通過用編碼改變淀粉分支樣式的酶的基因轉(zhuǎn)化植物來實(shí)現(xiàn)的經(jīng)修飾的碳水化合物組成。參見Shiroza等，J.Bacteol.170:810(1988)(鏈球菌(Streptococcus)突變體果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列)，Steinmetz等，Mol.Gen.Genet.20:220(1985)(枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的核苷酸序列可以是果聚糖鹿糖酶(Ievansucrase)基因);Pen等，Bio/Technology10:292(1992)(表達(dá)地衣芽胞桿菌(Bacilluslichenifonn)`a-淀粉酶的轉(zhuǎn)基因植物的生成);E1Iiot等，PlantMolec.Biol.21:515(1993)(番茄轉(zhuǎn)化酶基因的核苷酸序列)；Sogaard等，J.Biol.Chem.268:22480(1993)(定點(diǎn)誘變可以是大麥a-淀粉酶基因的);和Fisher等，PlantPhysiol.102:1045(1993)(玉米胚乳淀粉分支酶II)。實(shí)施例[0098]本發(fā)明在以下實(shí)施例中進(jìn)一步描述，所述實(shí)施例作為例示提供，而并不意圖以任何方式限制本發(fā)明。[0099]實(shí)施例1[0100]肽的合成[0101]表1中列出了以下細(xì)胞穿透肽(CPP)序列；R9(Futakietal.,2001,Suzuki,etal.,2002)>MPG(Morris,1997andMorris,1999)>和y-ZEIN(Koganetal.,2001and2002)。這些肽由AmericanPeptideCompany(Sunnyvale,CA)以C端酰胺合成。使用本領(lǐng)域公知的方案使用質(zhì)譜分光光度計(jì)測試樣品的完整性。[0102]表1:合成肽的氨基酸序列和分子量[0103]【權(quán)利要求】1.一種將感興趣的分子導(dǎo)入具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞中以實(shí)現(xiàn)植物和種子的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的方法，該方法包括:提供所述具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞；使量子點(diǎn)(QD)與一種或多種細(xì)胞穿透肽(CPP)相互作用以形成QD-肽綴合物；將一種或多種感興趣的分子附接于所述一種或多種CPP以形成活化的QD-肽綴合物；將所述具有細(xì)胞壁的細(xì)胞和所述活化的QD-肽綴合物置于彼此接觸中；并容許將所述QD-肽綴合物和所述感興趣的分子攝取到所述具有細(xì)胞壁的細(xì)胞中。2.依照權(quán)利要求1的方法，其中使QD與一種或多種CPP接觸包括將所述一種或多種CPP裝配到所述QD的表面上。3.依照權(quán)利要求1的方法，其中將一種或多種感興趣的分子附接于所述一種或多種CPP包括所述感興趣分子的帶負(fù)電荷的基團(tuán)與所述CPP的末端的帶電荷的氨基基團(tuán)相互作用。4.依照權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括容許將所述QD-肽綴合物攝取到所述包含細(xì)胞壁的植物細(xì)胞的區(qū)室中。5.依照權(quán)利要求4的方法，其中所述區(qū)室選自下組:胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞核、液泡形成體、質(zhì)體、黃化質(zhì)體、色質(zhì)體、白色體、油質(zhì)體、蛋白質(zhì)體、造粉體、葉綠體、和雙層膜的腔。6.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述包含細(xì)胞壁的植物細(xì)胞選自下組:煙草、胡蘿卜、玉米、蕓苔(canola)、油菜籽(rapeseed)、棉花、棕櫚、花生、大豆、稻屬物種(Oryzasp.)、擬南芥屬物種(Arabidopsissp.)、蓖麻屬物種(Ricinussp.)、和甘鹿細(xì)胞。`7.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述植物細(xì)胞來自選自下組的組織:胚、分生組織、愈傷組織、花粉、葉、花藥、根、根尖、花、種子、莢果和莖。8.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種CPP由選自R9、MPG、TAT、Y-玉米醇溶蛋白和MPG肽的組組成。9.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述感興趣的分子包括選自下組的組分:核酸、DNA、RNA、RNAi分子、基因、質(zhì)粒、粘粒、YAC、BAC、多肽、酶、激素、糖肽、糖、脂肪、信號傳導(dǎo)肽、抗體、維生素、信使、第二信使、氨基酸、cAMP、藥物、除草劑、殺真菌劑、抗生素、及其組合。10.依照權(quán)利要求9的方法，其中所述感興趣的分子包括基因。11.依照權(quán)利要求10的方法，其中所述基因是外來蛋白質(zhì)基因、農(nóng)學(xué)基因、或標(biāo)志物基因。12.依照權(quán)利要求9的方法，其進(jìn)一步包括選擇已穩(wěn)定整合所述感興趣分子的細(xì)胞。13.依照權(quán)利要求12的方法，其中所述選定的細(xì)胞是可再生細(xì)胞。14.依照權(quán)利要求13的方法，其進(jìn)一步包括自所述可再生細(xì)胞再生植物。15.—種穩(wěn)定表達(dá)基因的方法,該方法包括:提供具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞；使量子點(diǎn)(QD)與一種或多種細(xì)胞穿透肽(CPP)相互作用以形成QD-肽綴合物；將一種或多種基因附接于所述一種或多種CPP以形成活化的QD-肽綴合物；將所述具有細(xì)胞壁的細(xì)胞和所述活化的QD-肽綴合物置于彼此接觸中；并容許將所述QD-肽綴合物和所述一種或多種基因攝取到所述具有細(xì)胞壁的細(xì)胞中；并在具有所述植物細(xì)胞的植物的后代中表達(dá)所述基因。16.依照權(quán)利要求15的方法，其中在葉綠體中表達(dá)所述基因。17.依照權(quán)利要求15的方法，其進(jìn)一步包括選擇穩(wěn)定表達(dá)所述基因的細(xì)胞。18.一種用于將分子物質(zhì)轉(zhuǎn)移入植物細(xì)胞中的方法，其包括:使量子點(diǎn)(QD)與一種或多種細(xì)胞穿透肽(CPP)相互作用以形成QD-肽綴合物；使所述QD-肽綴合物與質(zhì)粒DNA相互作用以形成活化的QD-肽綴合物結(jié)構(gòu)；并使所述活化的QD-肽綴合物結(jié)構(gòu)與攜帶完整壁的植物細(xì)胞在允許所述一種或多種CPP和來自所述質(zhì)粒DNA的所述一種或多種基因攝取入所述植物細(xì)胞中的條件下接觸。19.權(quán)利要求18的方法，其進(jìn)一步包括在具有所述植物細(xì)胞的植物的后代中穩(wěn)定表達(dá)所述基因。20.一種篩選并鑒定植物轉(zhuǎn)化的方法，其包括:提供具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞；使量子點(diǎn)(QD)與一種或多種細(xì)胞穿透肽(CPP)相互作用以形成QD-肽綴合物；將一種或多種感興趣的分子附接于所述一種或多種CPP以形成活化的QD-肽綴合物；將所述具有細(xì)胞壁的細(xì)胞和所述活化的QD-肽綴合物置于彼此接觸中；容許將所述QD-肽綴合物和所述感興趣的分子攝取到所述具有細(xì)胞壁的細(xì)胞中；并對所述具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞成像?！疚臋n編號】C12N5/10GK103562397SQ201280024901【公開日】2014年2月5日申請日期:2012年3月22日優(yōu)先權(quán)日:2011年3月23日【發(fā)明者】J.P.薩繆爾,N.C.薩姆伯朱,K.Y.姚,林高峰,S.R.韋布,F.G.伯勞格斯申請人:陶氏益農(nóng)公司