免疫刺激性寡脫氧核苷酸的制作方法

免疫刺激性寡脫氧核苷酸的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及免疫刺激性寡脫氧核苷酸、包含此寡脫氧核苷酸的載體和疫苗、它們作為藥物的用途、它們?cè)陬A(yù)防或抵御傳染病中的用途、用于檢測(cè)此寡脫氧核苷酸的方法、以及要在這些方法中使用的細(xì)胞。
【專利說(shuō)明】免疫刺激性寡脫氧核苷酸
[0001]本發(fā)明涉及免疫刺激性寡脫氧核苷酸、包含此寡脫氧核苷酸的載體和疫苗、它們作為藥物的用途、它們?cè)陬A(yù)防或抵御傳染病中的用途、用于檢測(cè)此寡脫氧核苷酸的方法、以及要在這些方法中使用的細(xì)胞。
[0002]在過(guò)去20年中，免疫科學(xué)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)具有通過(guò)受體介導(dǎo)識(shí)別病原體的獨(dú)特特征而檢測(cè)微生物感染并觸發(fā)快速免疫活化的機(jī)制，即所謂與同源宿主病原體識(shí)別受體(PRR)相互作用的病原體相關(guān)分子模式(PAMP) (Iwasaki A, Medzhitov R.2001.Science 327, 291-295 ；Medzhitov R., 2009.1mmunity 30, 766-775)。
[0003]現(xiàn)在清楚某些形式的病原體脫氧核糖核酸(DNA)在這些PAMP之中。在1995年，報(bào)道稱，細(xì)菌DNA中的非甲基化CpG基序觸發(fā)鼠B細(xì)胞活化(Krieg等，1995)。此研究首次形成了細(xì)菌的含免疫刺激性非甲基化CpG的DNA的特異性識(shí)別與此前認(rèn)識(shí)到的CpG抑制以及哺乳動(dòng)物DNA中普遍的CpG甲基化之間的關(guān)聯(lián)。證明最有效的B細(xì)胞刺激性非甲基化CpG寡脫氧核苷酸(CpG 0DN)具有序列元件GACGTT。
[0004] 本領(lǐng)域中接下來(lái)的里程碑式的論文由日本大阪的Shizuo Akira實(shí)驗(yàn)室發(fā)表(Hemmi等，2000)。通過(guò)小鼠中的基因克隆和靶向基因敲除方法，能夠明確地顯示小鼠中對(duì)CpG-ODN的細(xì)胞應(yīng)答由toll樣受體9(TLR9)介導(dǎo)。隨后，證明CpG-ODN是主要通過(guò)NFK-B途徑的TLR9信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激動(dòng)劑(Medzhitov 2001)。在隨后的十年中，已經(jīng)發(fā)表了相當(dāng)大量關(guān)于基礎(chǔ)研究課題以及關(guān)于常規(guī)的潛在免疫治療應(yīng)用的研究(例如綜述于Krieg
2002、2003、2006;Klinman 2004 ；Vollmer 2005 ；ffilson 等，2006 ;Kindrachuk 等，2008;Dorn 和 Kippenberger 2008 ;Vollmer 和 Krieg 2009 ;Wilson 等，2009)。很多綜述文章集中在CpG-ODN的抗感染應(yīng)用(Krieg 2007)、TLR9激動(dòng)劑在癌癥治療中的應(yīng)用(Krieg
2007；ffeiner 2009)、TLR9活化用于哮喘和變態(tài)反應(yīng)治療(Kline 2007 ;Kline和Krieg
2008;Fonseca 和 Kline 2009)，以及作為疫苗佐劑(Klinman 等，2004 ;Klinman 2006 ；Daubenberger 2007 ；ffagner 2009 ；Mutwiri 等,2009 ;Klinman 等，2009)中的應(yīng)用。
[0005]還已經(jīng)描述并討論了 CpG ODN作為獸醫(yī)應(yīng)用中的免疫刺激劑和疫苗佐劑，特別是在牛、豬、綿羊、狗、雞和魚中(Babiuk 等，2003 ;Carrington 和 Secombes 2006 ;Griebel 等，2005 ；Mutwiri 等，2003 ；Singh 和 O，Hagan 2003 ；fferling 和 Jungi 2003)。
[0006]在雞中的獸醫(yī)用途領(lǐng)域中，已描述了在例如疫苗中的CpG寡脫氧核苷酸，用于保護(hù)雞以抵抗新城疫的用途(Linghua 2007)。
[0007]近期顯示，在雞中，TLR21在CpG寡脫氧核苷酸的識(shí)別中發(fā)揮哺乳動(dòng)物TLR9的功能同源物的作用(Brownlie等,2009)。
[0008]迄今為止，作為免疫調(diào)節(jié)劑的特異性CpG ODN的設(shè)計(jì)相當(dāng)隨機(jī)。對(duì)于非哺乳動(dòng)物CpG ODN尤其如此。其原因是多因素的；首先沒(méi)有關(guān)于用于人類TLR的免疫調(diào)節(jié)CpG基序與用于非人類(更不用說(shuō)非哺乳動(dòng)物物種)中的TLR的免疫調(diào)節(jié)CpG基序之間的相關(guān)性的知識(shí)。其次，沒(méi)有可用的具有足夠低的背景噪音比水平的細(xì)胞系統(tǒng)，以選擇性地測(cè)試非常低濃度的CpG ODN的作用。此外，沒(méi)有可用的高通量篩選方法，并且即便有，CpG ODN作為在非哺乳動(dòng)物物種中的免疫調(diào)節(jié)劑的體內(nèi)與體外功效之間也沒(méi)有清楚的相關(guān)性。[0009]因此，顯然需要具有高免疫調(diào)節(jié)作用并且因此在低劑量下有效的新CpG ODN0并且，還需要選擇性且靈敏的CpG ODN選擇系統(tǒng)，用于顯示CpG-活性的體外和體內(nèi)活性之間的相關(guān)性的獸醫(yī)目的。[0010]本發(fā)明的目的之一是提供這樣的新CpG ODNo
[0011]在此方面，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式涉及具有通式*' [G], ([TJpTT C GTC mnh r的免疫刺激性非甲基化寡脫氧核苷酸或其藥學(xué)可接受的鹽，其中 P = 1-15，q = 1-15，η = 2-100，x = 3-10 且 z = O-1O0
[0012]“免疫刺激性非甲基化寡脫氧核苷酸”是指包含非甲基化的胞苷-磷酸-鳥(niǎo)苷二核苷酸序列的寡脫氧核苷酸，該序列刺激啟動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子，例如NF-κ B或干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)的活化。正是這種活化進(jìn)而導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，以及其它細(xì)胞活化事件。Schindler和Baichwal (1994)尤其描述了 NF-κ B結(jié)合位點(diǎn)以及受到NF-κ B影響的基因表達(dá)。
[0013]術(shù)語(yǔ)寡脫氧核苷酸是指，脫氧核苷酸的短核酸聚合物；即，包含連接到磷酸基團(tuán)且連接到可交換的有機(jī)堿基的大量脫氧核糖的分子。此類有機(jī)堿基是取代的嘧啶或取代的嘌呤。實(shí)例分別為胞嘧啶和胸腺嘧啶，腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤。
[0014]本發(fā)明的寡核苷酸可包含修飾。此類修飾的實(shí)例為，例如位于核苷的3’和/或5’末端的磷酸二酯核苷間橋中的修飾。此類修飾尤其涉及由例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯
替換磷酸二酯。
[0015]其它修飾為，例如由脫磷橋替換磷酸二酯橋。脫磷橋的實(shí)例為甲基羥胺、甲乙縮醛(formacetal)和二亞甲基諷基團(tuán)。
[0016]還有其它的修飾是，涉及由非天然核苷堿基(例如5-氟胞嘧啶、7-脫氮-7-取代的鳥(niǎo)嘌呤、7-脫氮-8-取代的鳥(niǎo)嘌呤、2-硫尿嘧啶、二氫尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、6-取代的胞嘧啶、N4-取代的胞嘧啶)替換天然核苷堿基的修飾。
[0017]再其它的修飾是，涉及糖單元的替換(通過(guò)修飾的糖單元，例如，如L-2’ -脫氧核糖或2’ -L-阿拉伯糖，替換β -核糖的糖或β -D-2’ -核糖的糖單元)的修飾。
[0018]給出關(guān)于寡核苷酸的進(jìn)一步理解的教科書是，例如“PCR Primer: A LaboratoryManual ”,第二版，2003, Carl V.Dieffenbach 編輯Institute of Allergy andInfectious Diseases ；Gabriela S.Drekslerj Uniformed Services University of theHealth Sciences, Cold Spring Harbor Laboratory Press ISBN 978-087969654-2。
[0019]攜帶CpG基序的結(jié)構(gòu)COp T T C G T C [TWn代表了本發(fā)明ODN的活性免疫刺激部分。因此，本發(fā)明提供了包含這種所謂“骨架”的免疫刺激性寡脫氧核苷酸。
[0020]發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的寡脫氧核苷酸的骨架，結(jié)構(gòu){[TlpTTC GTC Uhh ,必須存在至少兩次，優(yōu)選三次。因此，η應(yīng)當(dāng)是至少2。還發(fā)現(xiàn)，所述寡脫氧核苷酸的活性在η增大時(shí)提高。在η增大時(shí)此效果趨平(leveling)。因此，基本上，骨架結(jié)構(gòu)的數(shù)量η應(yīng)當(dāng)是至少2。優(yōu)選地，η的范圍是3 ^ n ^ 100，這僅僅是因?yàn)楹铣傻男蛄性介L(zhǎng)，其越難以制備的事實(shí)。在實(shí)踐中，優(yōu)選η的范圍是2 ^ n ^ 18ο更優(yōu)選η的范圍是3 ^ n ^ 18，甚至更優(yōu)選η的范圍是4≤η≤18,仍甚至更優(yōu)選η的范圍是5≤η≤18。
[0021]尤其通過(guò)使用比目前用于檢測(cè)NF- κ B活化的系統(tǒng)選擇性更好的檢測(cè)系統(tǒng)，使得鑒定本發(fā)明的CpG ODN成為可能。Brownlie等(2009)描述了基于NF-κ B熒光素酶的報(bào)告系統(tǒng)。其它系統(tǒng)，例如，基于IL-8轉(zhuǎn)錄物測(cè)量，或細(xì)胞因子分泌，或NO分泌物的檢測(cè)。
[0022]與此相反，在本發(fā)明中使用了基于分泌的堿性磷酸酶的檢測(cè)系統(tǒng)(SEAP)。SEAP是哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中的報(bào)告酶(Yang等，1997)。此系統(tǒng)變得出人預(yù)料地靈敏，并且還出人預(yù)料地提供了所測(cè)試的CpG ODN的體外和體內(nèi)活性之間的密切相關(guān)性。以對(duì)硝基苯基磷酸鹽(pNPP)作為底物，使用SEAP系統(tǒng)。
[0023]超過(guò)現(xiàn)有系統(tǒng)的另一個(gè)改進(jìn)是將攜帶SEAP基因的質(zhì)粒引入并穩(wěn)定保持在細(xì)胞中。迄今為止，所有檢測(cè)系統(tǒng)均使用報(bào)告基因?qū)?xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。正是由于將報(bào)告基因引入并穩(wěn)定保持在細(xì)胞中，現(xiàn)在弟一次能夠繪制劑量/響應(yīng)曲線。如果要進(jìn)彳丁各種CpG ODN的活性之間的可靠比較，這種曲線是必需的。
[0024]因此，本發(fā)明實(shí)施例部分中詳細(xì)描述的方法和細(xì)胞系首次允許進(jìn)行各種CpG ODN之間的可靠的并排比較。
[0025]實(shí)施例部分中給出了所使用的系統(tǒng)的進(jìn)一步細(xì)節(jié)。
[0026]由于本發(fā)明的方法和細(xì)胞系現(xiàn)允許各種CpG ODN之間的可靠的并排比較，因此，可以確定其中P > I的本發(fā)明的寡脫氧核苷酸具有比P = I時(shí)更高的活性水平。因此，在此實(shí)施方式的優(yōu)選形式中，P > I。以優(yōu)先度的順序，更優(yōu)選2、3、4、5或6的P值。還更優(yōu)選>6的P值，盡管活性的提高趨于穩(wěn)定。
[0027]超過(guò)15的P值將愈發(fā)難以合成。因此，優(yōu)選地，P的數(shù)值不應(yīng)超過(guò)15。
[0028]還可以確定，其中q > I的本發(fā)明的寡脫氧核苷酸具有比q = I時(shí)更高的活性水平。因此，在此實(shí)施方式的優(yōu)選形式中，q > I。以優(yōu)先度的順序，更優(yōu)選2、3、4、5或6的q值。還更優(yōu)選>6的q值，盡管活性的提高趨于穩(wěn)定。
[0029]超過(guò)15的Q值將愈發(fā)難以合成。因此，優(yōu)選地，q的數(shù)值不應(yīng)超過(guò)15。
[0030]發(fā)現(xiàn)在結(jié)構(gòu)^ [GKTOTTCGTCmcKIG], τ的5’ -末端的G的數(shù)量增加，導(dǎo)致CpG ODN活性提高。數(shù)值X應(yīng)當(dāng)是至少3，但提高G的數(shù)量至20個(gè)G，改進(jìn)了 CpG ODN的活性。因此，優(yōu)選地，以優(yōu)先度提高的順序4是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20。
[0031]還發(fā)現(xiàn)在結(jié) 的3’-末端的G的數(shù)量增加，導(dǎo)
致CpG ODN活性(輕微)下降。數(shù)值ζ應(yīng)當(dāng)為10或小于10，但減少G的數(shù)量至O個(gè)G，改進(jìn)了 CpG ODN的活性。因此，更優(yōu)選地，以優(yōu)先度提高的順序，ζ是9、8、7、6、5、4、3、2、1或
O0
[0032]如上文所述，位于核苷的3’和/或5’末端的磷酸二酯核苷間橋中的多種修飾是可行的。但是，基本上，基于合成的方式，兩個(gè)核苷酸之間的常見(jiàn)普通類型的鍵為:磷酸二酯(PDE)鍵和硫代磷酸酯(PTO)鍵。為了改進(jìn)CpG ODN的穩(wěn)定性和免疫刺激作用，通常向合成寡脫氧核苷酸的構(gòu)建嵌段提供硫代磷酸酯，以便它們形成PTO鍵。
[0033]然而，`意外地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)只有5’ [G] χ和3’ [G] ζ核苷酸通過(guò)PTO鍵鍵合且其它核苷酸通過(guò)PDE鍵鍵合時(shí)，本發(fā)明的寡脫氧核苷酸的功效進(jìn)一步提高。(在這種情況下，5’⑴丸與{ TT C G TC [TU 的鍵是 PTO 鍵,而《TlpTTCGTCrnq)與[G],的鍵是 PDE 鍵。)
因此，這種實(shí)施方式的另一個(gè)優(yōu)選形式涉及本發(fā)明的寡脫氧核苷酸，其中5’3’[G]z核苷酸具有硫代磷酸酯鍵且其它核苷酸具有磷酸二酯鍵。
[0034]本發(fā)明的寡脫氧核苷酸的骨架，結(jié)構(gòu)5 OTpTTCGTC ΡΙ,Ι? y不必對(duì)
每個(gè)η都相同。這意味著，本發(fā)明的寡脫氧核苷酸骨架可以看起來(lái)尤其類似于::TTTCGTCT;jT*r*reG*reTT;丨ttttcgtct;。這樣一系列的三個(gè)不同的連
續(xù)的不同骨架可以稱作雜聚物。一段三個(gè)相同的拷貝可以稱作同聚物。
[0035]優(yōu)選地，本發(fā)明的寡脫氧核苷酸包含^ {rnPTTCGTC[T]q>n y同聚物。
[0036]本發(fā)明的CpG寡脫氧核苷酸在皮摩爾(亞-納摩爾)的量下具有活性；其EC50低于 I nM。
[0037]寡脫氧核苷酸的半-最大有效濃度(EC50)是在報(bào)告細(xì)胞(HEK293-pNifty2_雞TLR21或HDll-pNifTy2Hyg)中誘導(dǎo)給出半-最大酶促反應(yīng)速率的量的報(bào)告酶SEAP (其產(chǎn)生具有405 nm吸收的有色產(chǎn)物)所必需的寡脫氧核苷酸的量。如果寡脫氧核苷酸在這些細(xì)胞中的EC50低于I nM,則認(rèn)為其在皮摩爾(亞-納摩爾)的量下具有活性。
[0038]通過(guò)反應(yīng)性的化學(xué)基團(tuán)將本發(fā)明的寡脫氧核苷酸連接到載體或半抗原，是完全可以的。這種連接增強(qiáng)了組合分子的免疫刺激作用。
[0039]此類組分的單純實(shí)例為，例如地高辛(digoxigenin)、氨基己基_、得克薩斯紅和生物素。
[0040]優(yōu)選的載體或半抗原是3’ -和5’ -標(biāo)記的得克薩斯紅和5’ -標(biāo)記的地高辛。寡脫氧核苷酸與半抗原/載體的連接是本領(lǐng)域中公知的。
[0041]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式涉及包含本發(fā)明的免疫刺激性非甲基化寡脫氧核苷酸的載體。此載體可以是核酸分子，例如質(zhì)粒、病毒、噬菌體或分子生物學(xué)中使用的任何其它載體。僅作為實(shí)例:包含免疫刺激性非甲基化寡脫氧核苷酸的載體可以例如是DNA分子(如能夠在細(xì)菌中增殖的質(zhì)粒)，所述DNA分子中已經(jīng)克隆了本發(fā)明的免疫刺激性非甲基化寡脫氧核苷酸。此類質(zhì)粒優(yōu)選具有活躍的復(fù)制起始點(diǎn)，導(dǎo)致在所述宿主中存在大量的所述質(zhì)粒。大規(guī)模培養(yǎng)所述細(xì)菌和隨后分離質(zhì)粒，提供了本發(fā)明的免疫刺激性非甲基化寡脫氧核苷酸的合成生產(chǎn)的備選方案。
[0042]本發(fā)明的目的之一是提供新的CpG 0DN,其能夠作為成功的免疫刺激性組分，與抗原組分或編碼抗原組分的遺傳信息，以及藥學(xué)可接受的載體一起用在預(yù)防或抵御傳染病的疫苗中。
[0043]通常，術(shù)語(yǔ)抗原組分是指包含至少一個(gè)表位的物質(zhì)組合物，所述表位在向人或動(dòng)物施用時(shí)能夠誘導(dǎo)、刺激或增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
[0044]所述抗原組分可以是任何種類的抗原組分，但優(yōu)選源自在其野生型形式下對(duì)人或動(dòng)物具有致病性的微生物或病毒。
[0045]所述抗原組分可以是完整病原體，優(yōu)選滅活或減毒形式的完整病原體，病原體的提取物，或者病原體的免疫原性蛋白。
[0046]如果所述抗原組分是病原體的免疫原性蛋白，則該免疫原性蛋白優(yōu)選從體外培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)并回收。
[0047]因此，另一個(gè)實(shí)施方式涉及用于預(yù)防或抵御傳染病的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含免疫刺激量的本發(fā)明的寡脫氧核苷酸和/或本發(fā)明的載體，免疫原性量的抗原組分或編碼抗原組分的遺傳信息，以及藥學(xué)可接受的載體。
[0048]當(dāng)然，所述寡脫氧核苷酸的免疫刺激量和抗原組分的免疫原性量是強(qiáng)烈相關(guān)的。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)之一在于，本發(fā)明的寡脫氧核苷酸的存在能夠降低預(yù)防或抵御傳染病所必需的抗原組分的量。
[0049]預(yù)防或抵御傳染病所必需的抗原組分的量稱作抗原組分的免疫原性量。
[0050]寡脫氧核苷酸的免疫刺激量是能夠降低抗原組分的免疫原性量(即，預(yù)防或抵御傳染病所必需的抗原組分的量)的量。[0051 ] 因此，基本上，表述“寡脫氧核苷酸的免疫刺激量”與“免疫原性量”必須被視為是彼此相關(guān)的。
[0052]不言而喻地，如果所述疫苗包含編碼抗原組分的遺傳信息，則由這種遺傳信息表達(dá)的抗原組分的量應(yīng)足以預(yù)防或抵御傳染病，即，其必須為免疫原性量。
[0053]本發(fā)明的非甲基化寡脫氧核苷酸是免疫刺激性的，這個(gè)事實(shí)是指它們?cè)鰪?qiáng)疫苗中的抗原組分的免疫功效。因此，與不存在本發(fā)明的寡脫氧核苷酸的情況相比，本發(fā)明的疫苗在很多情況下可包含較少的抗原組分或編碼抗原組分的遺傳信息。
[0054]在一些情況下，沒(méi)有添加免疫刺激性寡核苷酸的同樣的抗原組分，可具有如此之低的免疫原性性質(zhì)，以至于無(wú)論如何也必須給予高劑量，即便沒(méi)有達(dá)到期望的免疫原性水平。然而現(xiàn)在，在這些情況下，可以與本發(fā)明的寡脫氧核苷酸一起給予通常的高濃度的所述抗原組分，從而以此獲得期望的免疫原性水平。
[0055]因此，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，與本發(fā)明的寡核苷酸一起施用的抗原組分或編碼抗原組分的遺傳信息的量可以等于或低于在不存在所述寡核苷酸的情況下給予的量。參與特定疫苗制造的技術(shù)人員知曉用于該特定疫苗的量。此外，實(shí)施例還給出了，例如，如在以下3種不同的滅活病毒疫苗中使用的抗原組分的量的充分指導(dǎo):新城疫病毒疫苗、傳染性支氣管炎病毒疫苗和火雞鼻氣管炎疫苗。
[0056]需要與抗原組分或編碼抗原組分的遺傳信息一起施用的本發(fā)明的寡脫氧核苷酸的量取決于所選擇的寡脫氧核苷酸和抗原組分二者。
[0057]本發(fā)明的寡脫氧核苷酸的非常適合的量通?？稍贗和100納摩爾之間變化。已例如，使用1-10 μg曾在體外測(cè)試中顯示在納摩爾范圍內(nèi)具有活性的，平均長(zhǎng)度為30個(gè)脫氧核苷酸的本發(fā)明的寡脫氧核苷酸，獲得了非常好的體內(nèi)結(jié)果。
[0058]如果寡脫氧核苷酸選自在皮摩爾范圍內(nèi)具有活性的寡脫氧核苷酸的組，則技術(shù)人員可意識(shí)到，在測(cè)試納摩爾的量之前，值得測(cè)試低于、可能遠(yuǎn)低于I納摩爾的量，即皮摩爾的量。
[0059]本發(fā)明的疫苗包含藥學(xué)可接受的載體。此載體的性質(zhì)特別依賴于施用途徑。如果施用途徑是通過(guò)口服或鼻內(nèi)途徑，則所述載體可以如無(wú)菌水、生理鹽溶液或緩沖液一樣簡(jiǎn)單。如果注射是優(yōu)選的途徑，則所述載體應(yīng)優(yōu)選是等滲的且具有PH的限制，以使其適合用于注射。然而，此類載體是本領(lǐng)域中廣泛知曉的。
[0060]本發(fā)明的疫苗，在所述抗原組分或編碼抗原組分的遺傳信息以及本發(fā)明的寡脫氧核苷酸之外，還包含佐劑。佐劑通常是以非特異性的方式增強(qiáng)宿主免疫應(yīng)答的物質(zhì)。
[0061]本領(lǐng)域中已知很多佐劑都是適合的，例如弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，維生素E，非離子型嵌段聚合物和聚陰離子，如硫酸葡聚糖，卡波普(carbopol)和吡喃，氫氧化鋁(alum hydroxide)。經(jīng)常使用的是磷酸鋁、皂苷類、植物油，例如生育酚和礦物油。非常有效的佐劑是水包油乳劑，并且特別是油包水乳劑，進(jìn)一步也稱作水包油佐劑和油包水佐劑。這些乳劑是本領(lǐng)域中公知的。因此，優(yōu)選地，所述疫苗包含油包水佐劑。
[0062]優(yōu)選地，所述抗原組分是或源自在其野生型形式下對(duì)家禽具有致病性的病毒或微生物。
[0063]更優(yōu)選地，所述病毒或微生物選自:傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒、傳染性法氏囊病(甘布羅病，Gumboro)、雞貧血病原體、禽呼腸孤病毒、雞毒支原體(Mycoplasma
火雞鼻氣管炎病毒、副雞嗜血桿菌(鼻炎)、雞痘病毒、禽腦脊髓炎病毒、減蛋綜合癥病毒、傳染性喉氣管炎病毒、火雞的皰疫病毒、艾美蟲屬物種、鼻腔鳥(niǎo)桿菌(Pm i thobacterium rhino tracheal e)、多殺巴斯德氏菌 iPasteurella mu I toe i da)、關(guān)節(jié)液支原體{Mycoplasma synoviae)、沙門氏菌屬物種和大腸桿菌{Escherichia coif)。
[0064]本發(fā)明的再另一個(gè)實(shí)施方式涉及本發(fā)明的免疫刺激性非甲基化寡脫氧核苷酸，其作為藥物使用。
[0065]本發(fā)明的再另一個(gè)實(shí)施方式涉及本發(fā)明的免疫刺激性非甲基化寡脫氧核苷酸，其用于預(yù)防或抵御家禽中的傳染病。 [0066]迄今為止，所有檢測(cè)系統(tǒng)均使用報(bào)告基因?qū)?xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。此類瞬時(shí)系統(tǒng)不允許可靠地并排比較CpG ODN的功效。如上文所述，超過(guò)現(xiàn)有系統(tǒng)的主要改進(jìn)是將攜帶報(bào)告基因的質(zhì)粒引入并穩(wěn)定保持在細(xì)胞中。穩(wěn)定是指質(zhì)粒在數(shù)個(gè)細(xì)胞分裂周期后仍存在于細(xì)胞中。
[0067]常常通過(guò)在一種或多種選擇試劑(例如抗生素)的壓力下培養(yǎng)細(xì)胞，從而獲得質(zhì)粒的穩(wěn)定保持，其中在所述質(zhì)粒上存在針對(duì)該選擇試劑的抗性基因。因而，質(zhì)粒的丟失將導(dǎo)致丟失該質(zhì)粒的細(xì)胞死亡。剩余的活細(xì)胞將仍帶有所述質(zhì)粒。
[0068]穩(wěn)定保持的另一種方式是使用線性化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。此類質(zhì)粒通常變得整合到細(xì)胞的基因組中，并因此被穩(wěn)定地保持。
[0069]因此，本發(fā)明的再另一個(gè)實(shí)施方式涉及包含TLR21受體和編碼NF-κ B報(bào)告基因的質(zhì)粒的細(xì)胞，其中，所述質(zhì)粒穩(wěn)定保持在所述細(xì)胞中。此類細(xì)胞非常適合用于篩選CpG分子，更具體地，篩選本發(fā)明的CpG分子。
[0070]實(shí)施例給出了關(guān)于如何獲得包含能夠穩(wěn)定地保持在細(xì)胞中的編碼報(bào)告基因的質(zhì)粒的此類細(xì)胞的充分指導(dǎo)。
[0071]此外，如上所述，發(fā)現(xiàn)基于分泌的堿性磷酸酶(SEAP)的檢測(cè)系統(tǒng)非常適合于所使用的檢測(cè)系統(tǒng)。
[0072]因此，優(yōu)選地，所述報(bào)告基因是編碼分泌的堿性磷酸酶的基因。
[0073]基本上，允許引入且優(yōu)選穩(wěn)定保持?jǐn)y帶NF- κ B報(bào)告基因(優(yōu)選如上所述的SEAP基因)的質(zhì)粒的攜帶且表達(dá)TLR21的任何細(xì)胞或細(xì)胞系，都適合用于測(cè)試TLR21-特異性CpG ODN。
[0074]用于測(cè)試TLR21-特異性CpG ODN的此類適合的細(xì)胞系的優(yōu)選實(shí)例是雞細(xì)胞系HDl I。
[0075]因此，優(yōu)選地，用于所述檢測(cè)系統(tǒng)中的細(xì)胞系是包含編碼報(bào)告基因的穩(wěn)定質(zhì)粒的HDll細(xì)胞系。
[0076]雞細(xì)胞系例如HDll細(xì)胞系展示了雞-TLR的全體成員。這在一定的條件下可產(chǎn)生
一定的背景活性 。
[0077]因此，非家禽細(xì)胞系，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是更優(yōu)選的細(xì)胞系。此類哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的實(shí)例是其中已克隆了 TLR21的HEK293細(xì)胞。此細(xì)胞系對(duì)于TLR21-活化信號(hào)具有更特異的選擇性。
[0078]因此，更優(yōu)選地，用于所述檢測(cè)系統(tǒng)中使用的細(xì)胞系是包含穩(wěn)定保持的報(bào)告基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系HEK293，并且在所述HEK293細(xì)胞中已經(jīng)克隆了 TLR21。
[0079]本發(fā)明的再另一個(gè)實(shí)施方式涉及用于檢測(cè)本發(fā)明的免疫刺激性寡脫氧核苷酸的方法，其中，所述方法包括以下步驟:a)使寡脫氧核苷酸與本發(fā)明的細(xì)胞接觸，b)檢測(cè)報(bào)告基因的產(chǎn)物的水平。
[0080]在此方法的優(yōu)選形式中，報(bào)告基因的產(chǎn)物是SEAP。
[0081]此實(shí)施方式的更優(yōu)選的形式涉及用于檢測(cè)本發(fā)明的免疫刺激性寡脫氧核苷酸的方法，其中，所述細(xì)胞是雞細(xì)胞系HDll的細(xì)胞，或者其中已經(jīng)克隆了雞TLR21的HEK293細(xì)胞系的細(xì)胞。
實(shí)施例
[0082]實(shí)施例1:
雞TLR21的基因克隆和異源表達(dá)
雞TLR研究中的最新進(jìn)展表明，TLR21是禽類物種中的哺乳動(dòng)物TLR9的功能性同源物(Keestra 2008 ；Brownlie 等，2009)。
[0083]TLR21某閔克降的概要
基于Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)序列NM_001030558，合成用于雞TLR21基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增的引物對(duì):

tla-TLR21-fori

CI>\A<1C:TXM:C^ATCATC1fiAr?AC:AClC:r>C]A(iAAClGC:

Ga-TLRIl^revI

(1G￡H1￡CM:TA(:ATC:TC1T11X1T(:1X；X:TIX XXTCi
[0084]設(shè)計(jì)所述引物以提供在起始和終止密碼子(粗體)側(cè)翼的限制性克隆位點(diǎn)(下劃線)和Kozak序列(斜體)。使用這些引物以及作為模板的雞脾總RNA進(jìn)行RT-PCR。將預(yù)期大?。▇ 3000 bp)的PCR產(chǎn)物克隆到pCR2.1-Topo中，并對(duì)5個(gè)獨(dú)立的質(zhì)?？寺?P1、P2、P12、P13、P14)進(jìn)行測(cè)序。
[0085]所使用的雞TLR21的DNA序列。
【權(quán)利要求】
1.具有以下通式的免疫刺激性非甲基化寡脫氧核苷酸，或其藥學(xué)可接受的鹽:!Cl*IITIpTTCGTCm, 1?1C], y 其中，P = 1-15，q = 1-15，η = 2-100，x = 3-10 且 z = O-1O0
2.如權(quán)利要求1的寡脫氧核苷酸，其中p> I。
3.如權(quán)利要求1的寡脫氧核苷酸，其中P> 2。
4.如權(quán)利要求1的寡脫氧核苷酸，其中q> I。
5.如權(quán)利要求1的寡脫氧核苷酸，其中q> 2。
6.如權(quán)利要求1的寡脫氧核苷酸，其中η= 3-18。
7.如權(quán)利要求1的寡脫氧核苷酸，其特征在于所述5’3’ [G]z核苷酸具有硫代磷酸酯鍵且其它核苷酸具有磷酸二酯鍵。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的寡脫氧核苷酸，其特征在于IiTIp T TCCT C ITU 是同聚物。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的寡脫氧核苷酸，其中所述寡脫氧核苷酸偶聯(lián)到載體或半抗原。
10.載體，其包含如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的寡脫氧核苷酸。
11.用于預(yù)防或抵御傳染病的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含免疫刺激量的如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的寡脫氧核苷酸和/或如權(quán)利要求10的載體，免疫量的抗原組分或編碼抗原組分的遺傳信息，以及藥學(xué)可接受的載體。
12.如權(quán)利要求11的疫苗，其特征在于，所述抗原組分是或源自在其野生型形式下對(duì)家禽具有致病性的病毒或微生物。
13.如權(quán)利要求12的疫苗，其特征在于，所述病毒或微生物選自:傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒、傳染性法氏囊病(甘布羅病)、雞貧血病原體、禽呼腸孤病毒、雞毒支原體(Mycoplasma、火雞鼻氣管炎病毒、副雞嗜血桿菌(鼻炎)、雞痘病毒、禽腦脊髓炎病毒、減蛋綜合癥病毒、傳染性喉氣管炎病毒、火雞的皰疫病毒、艾美蟲屬物種、鼻腔鳥(niǎo)桿菌{Ornithobacterium、多殺巴斯德氏菌(Pasteurella、關(guān)節(jié)液支原體(Mycoplasma、沙門氏菌屬{Salmonella、物種和大腸桿菌{Escherichia coif)。
14.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的免疫刺激性非甲基化寡脫氧核苷酸或如權(quán)利要求10的載體，其作為藥物使用。
15.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的免疫刺激性非甲基化寡脫氧核苷酸或如權(quán)利要求10的載體，其用于預(yù)防家禽中的傳染。
16.用于檢測(cè)如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的免疫刺激性寡脫氧核苷酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟:a)使寡脫氧核苷酸與包含TLR21受體和編碼NF-K B報(bào)告基因的質(zhì)粒的細(xì)胞接觸，其中所述質(zhì)粒穩(wěn)定保持在所述細(xì)胞中，和b)檢測(cè)所述報(bào)告基因的產(chǎn)物的水平。
17.如權(quán)利要求16的方法，其中所述報(bào)告基因的產(chǎn)物是分泌的堿性磷酸酶。
18.如權(quán)利要求16或17的用于檢測(cè)免疫刺激性寡脫氧核苷酸的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是雞細(xì)胞系HDll的細(xì)胞，或其中已經(jīng)克隆了雞TLR21受體基因的HEK293細(xì)胞系的細(xì)胞?！?br> 【文檔編號(hào)】C12N15/117GK103547674SQ201280024794
【公開(kāi)日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2012年5月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月26日
【發(fā)明者】C.C.施里爾, T.S.伊爾克 申請(qǐng)人:英特維特國(guó)際股份有限公司