乙酰金剛烷胺的單克隆抗體的制作方法
【專利摘要】一種制備抗體的方法，其包含用乙酰金剛烷胺的胺衍生物免疫哺乳動(dòng)物，用乙酰金剛烷胺免疫該哺乳動(dòng)物，和從該哺乳動(dòng)物制備抗體。該抗體識(shí)別乙酰金剛烷胺但不識(shí)別金剛烷胺。
【專利說(shuō)明】乙酰金剛院胺的單克隆抗體
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)61/484，521的優(yōu)先權(quán)，所述臨時(shí)專利申請(qǐng)2012年5月10日提交并且全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文。
【背景技術(shù)】【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及用于量化定量精胺/精脒N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶(SSAT)酶活性的方法和組合物。
_4] 相關(guān)技術(shù)說(shuō)明
[0005]精脒/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶(SSAT)普遍分布于哺乳動(dòng)物組織中并且在細(xì)胞的多胺的分解代謝和消除中起作用。SSAT為誘導(dǎo)酶，其催化乙?；鶑囊阴］o酶A到多胺的氨丙基部分的轉(zhuǎn)移。SSAT這一行為有利于多胺降解、排泄和循環(huán)和/或胞內(nèi)循環(huán)。以此方式，SSAT參與哺乳動(dòng)物細(xì)胞中多胺體內(nèi)平衡的維持。然而，在正?；蚍钦T導(dǎo)的哺乳動(dòng)物組織中，SSAT以極低水平存在。
[0006]不同藥物、生長(zhǎng)因子、多胺、多胺類似物、有毒物質(zhì)、激素和生理刺激可以誘導(dǎo)SSAT表達(dá)。雖然所有前述化合物均可能誘導(dǎo)SSAT表達(dá)，但對(duì)于每個(gè)單獨(dú)化合物，誘導(dǎo)發(fā)生在不同的時(shí)間。SSAT表達(dá)的調(diào)節(jié)在轉(zhuǎn)錄、mRNA穩(wěn)定性、mRNA翻譯和蛋白穩(wěn)定性的水平發(fā)生。在體外實(shí)驗(yàn)可能成功進(jìn)行之前，SSAT的誘導(dǎo)或過(guò)量表達(dá)通常需要細(xì)胞中有足夠的SSAT酶或100，OOOxg 上清液。
[0007]雖然當(dāng)前文獻(xiàn)教導(dǎo)了 SSAT為乙?；?，其特異性底物包括精胺和精脒或其類似物，但SSAT活性、SSAT酶動(dòng)力學(xué)和用于SSAT的非精胺/精脒底物的測(cè)定方法尚未被理解。目前存在量化SSAT活性的方法。然而，這些技術(shù)依賴于高技能人員和復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)方法。更具體地說(shuō)，測(cè)定方法中，需要通過(guò)檢測(cè)非精胺的乙?；问絹?lái)量化SSAT活性。包括金剛胺在內(nèi)的SSAT的精脒底物可用于檢測(cè)各種病理狀態(tài)。
[0008]傳統(tǒng)方法如單獨(dú)的或與質(zhì)譜分析聯(lián)用的氣液色譜法(GLC)、高壓液相色譜法(HPLC)用于測(cè)定乙酰化代謝物如乙酰金剛烷胺。檢測(cè)靈敏性需要十億分之幾的目標(biāo)分析物，這成為一個(gè)挑戰(zhàn)。GLC和HPLC已經(jīng)表明對(duì)于體外測(cè)定是有效的，但可能不適用于體內(nèi)測(cè)定。引入氘化分析物作為HPLC-MS-MS方法的內(nèi)標(biāo)來(lái)測(cè)定乙酰金剛烷胺是成功的。
[0009]這些傳統(tǒng)方法需要致使高操作成本和資本成本的勞動(dòng)密集型分析服務(wù)。所有這些增加了醫(yī)療保健經(jīng)濟(jì)的低效率。另外，生物樣品必須經(jīng)物流處理并且運(yùn)送至用于測(cè)定的中央實(shí)驗(yàn)室。這些操作可能致使樣品質(zhì)量改變并且致使結(jié)果的錯(cuò)誤解釋。
[0010]因此醫(yī)療點(diǎn)的測(cè)試方法需要最小化樣品不穩(wěn)定性并且降低醫(yī)療保健成本。在門(mén)診辦公室處的體外測(cè) 試診斷的形式還將允許迅速醫(yī)療決策。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0011] 本發(fā)明的一個(gè)目的為提供一種抗體、或其功能等同物或其功能部分，其識(shí)別乙酰金剛烷胺但不識(shí)別金剛烷胺。
[0012]因此相應(yīng)地提供了一種產(chǎn)生抗體的方法，包括用乙酰金剛烷胺的胺衍生物免疫哺乳動(dòng)物，用乙酰金剛烷胺免疫上述哺乳動(dòng)物，和由上述哺乳動(dòng)物制備抗體。該方法可能包括用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺將乙酰金剛烷胺的胺衍生物結(jié)合到卵白蛋白載體上以及在弗氏佐劑中乳化乙酰金剛烷胺-卵白蛋白結(jié)合物。該方法還可包括用偶合到所述乙酰金剛烷胺的抗生物素蛋白免疫上述哺乳動(dòng)物。該動(dòng)物可能由乙酰金剛烷胺的胺衍生物進(jìn)行增強(qiáng)?？贵w可以通過(guò)以下方法制備:獲得來(lái)自哺乳動(dòng)物外周血單核細(xì)胞的樣品，在B淋巴細(xì)胞被多克隆活化的條件下培養(yǎng)該外周血單核細(xì)胞，和活化該B淋巴細(xì)胞以增殖和分化為抗體分泌細(xì)胞。所制備的抗體可能是單克隆抗體。
[0013]該單克隆抗體對(duì)由抗體-產(chǎn)生細(xì)胞產(chǎn)生的乙酰金剛烷胺可能是特異性的，所述抗體-產(chǎn)生細(xì)胞來(lái)自用結(jié)合到載體蛋白的乙酰金剛烷胺以及佐劑免疫的哺乳動(dòng)物。
[0014]該單克隆抗體對(duì)乙酰金剛烷胺可能是特異性的，該乙酰金剛烷胺通過(guò)用在完全弗氏佐劑中乳化的10-500 μ g乙酰金剛烷胺-卵白蛋白結(jié)合物肌內(nèi)免疫哺乳動(dòng)物來(lái)制備。
[0015]該單克隆抗體對(duì)乙酰金剛烷胺可能是特異性的，該乙酰金剛烷胺通過(guò)用在完全佐劑中乳化的10-500 μ g乙酰金剛烷胺-卵白蛋白結(jié)合物肌內(nèi)免疫哺乳動(dòng)物來(lái)制備。
[0016]該單克隆抗體對(duì)乙酰金剛烷胺可能是特異性的，該乙酰金剛烷胺通過(guò)用在完全弗氏佐劑中乳化的100-400 μ g乙酰金剛烷胺-卵白蛋白結(jié)合物肌內(nèi)免疫哺乳動(dòng)物來(lái)制備。
[0017]該單克隆抗體對(duì)乙酰金剛烷胺可能是特異性的，該乙酰金剛烷胺通過(guò)用在完全弗氏佐劑中乳化的200-300 μ g乙酰金剛烷胺-卵白蛋白結(jié)合物肌內(nèi)免疫哺乳動(dòng)物來(lái)制備。
[0018]該單克隆抗體對(duì)乙酰金剛烷胺可能是特異性的，該乙酰金剛烷胺通過(guò)用與作為佐劑的明礬一起給藥的10-200 μ g乙酰金剛烷胺-卵白蛋白結(jié)合物每1-6周對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行2-15次肌內(nèi)免疫增強(qiáng)來(lái)制備。
[0019]該單克隆抗體對(duì)乙酰金剛烷胺可能是特異性的，該乙酰金剛烷胺通過(guò)用與作為佐劑的明礬一起給藥的20-150 μ g乙酰金剛烷胺-卵白蛋白結(jié)合物每1-6周對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行2-15次肌內(nèi)免疫增強(qiáng)來(lái)制備。
[0020]該單克隆抗體對(duì)乙酰金剛烷胺可能是特異性的，該乙酰金剛烷胺通過(guò)用與作為佐劑的明礬一起給藥的30-100 μ g乙酰金剛烷胺-卵白蛋白結(jié)合物每1-6周對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行2-15次肌內(nèi)免疫增強(qiáng)來(lái)制備。
[0021]該單克隆抗體對(duì)乙酰金剛烷胺可能是特異性的，該乙酰金剛烷胺通過(guò)用與作為佐劑的明礬一起給藥的10-200 μ g乙酰金剛烷胺-卵白蛋白結(jié)合物每2-5周對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行2-15次肌內(nèi)免疫增強(qiáng)來(lái)制備。
[0022]該單克隆抗體對(duì)乙酰金剛烷胺可能是特異性的，該乙酰金剛烷胺通過(guò)用與作為佐劑的明礬一起給藥的20-150 μ g乙酰金剛烷胺-卵白蛋白結(jié)合物每2-5周對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行2-15次肌內(nèi)免疫增強(qiáng)來(lái)制備。
[0023]該單克隆抗體對(duì)乙酰金剛烷胺可能是特異性的，該乙酰金剛烷胺通過(guò)用與作為佐劑的明礬一起給藥的30-100 μ g乙酰金剛烷胺-卵白蛋白結(jié)合物每2-5對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行2-15次肌內(nèi)免疫增強(qiáng)來(lái)制備。
[0024]該單克隆抗體對(duì)乙酰金剛烷胺可能是特異性的，其中該哺乳動(dòng)物是在上一次增強(qiáng)的4周之后通過(guò)肌內(nèi)免疫增強(qiáng)的，是用1-8 μ g抗生物素蛋白結(jié)合過(guò)量生物素化乙酰金剛烷胺和作為佐劑的明礬進(jìn)行免疫。
[0025]該單克隆抗體對(duì)乙酰金剛烷胺可能是特異性的，其中該哺乳動(dòng)物是在上一次增強(qiáng)的4周之后通過(guò)肌內(nèi)免疫被增強(qiáng)的，是用2-6 μ g抗生物素蛋白結(jié)合過(guò)量生物素化乙酰金剛烷胺和作為佐劑的明礬進(jìn)行免疫。
[0026]該單克隆抗體對(duì)乙酰金剛烷胺可能是特異性的，其中該哺乳動(dòng)物是在上一次增強(qiáng)的4周之后通過(guò)肌內(nèi)免疫被增強(qiáng)的，是用3-5 μ g抗生物素蛋白結(jié)合過(guò)量生物素化乙酰金剛烷胺和作為佐劑的明礬進(jìn)行免疫。
[0027]該單克隆抗體可以包括其任何功能等同物抗體或其功能部分，所述抗體辨別乙酰金剛烷胺和金剛烷胺并因此檢測(cè)酶活性。
[0028]該單克隆抗體可被用作乙酰金剛烷胺的量化工具。
[0029]該單克隆抗體可被用作檢測(cè)精胺/精脒N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的量化工具。
[0030]該單克隆抗體可被用作診斷工具來(lái)測(cè)定患者體內(nèi)的精胺/精脒N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶。
【具體實(shí)施方式】
[0031]此處公開(kāi)的是根據(jù)以下改進(jìn)方案成功免疫動(dòng)物的實(shí)施例，在該實(shí)施例中是兔子。這能夠證明能產(chǎn)生可辨別乙酰金剛烷胺和金剛烷胺的獨(dú)特的抗體。這表明能產(chǎn)生這樣的單克隆抗體，其特異性結(jié)合到乙酰金剛烷胺，但這些相同抗體不結(jié)合到金剛烷胺。
[0032]乙酰金剛烷胺蛋白結(jié)合物的制備
[0033]根據(jù)制造商的操作說(shuō)`明，用通過(guò)1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺結(jié)合乙酰金剛烷胺的胺衍生物的載體蛋白卵白蛋白的結(jié)合物免疫兔子。在該實(shí)施例中，制造商為 Thermo Fisher Scientific Inc., 3747North Meridian Road,羅克福德,伊利諾伊州，美國(guó)，61101。
[0034]乙酰金剛烷胺的胺衍生物采用下述合成方案合成。
[0035]金剛烷胺衍生物的合成
[0036]
【權(quán)利要求】
1.一種抗體，所述抗體識(shí)別乙酰金剛烷胺但不識(shí)別金剛烷胺。
2.如權(quán)利要求1所述的抗體，其中所述抗體為單克隆抗體。
3.一種制備抗體的方法，包括: 用乙酰金剛烷胺的胺衍生物免疫哺乳動(dòng)物； 用乙酰金剛烷胺免疫所述哺乳動(dòng)物；和 從所述哺乳動(dòng)物制備所述抗體。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，還包括將所述乙酰金剛烷胺的胺衍生物結(jié)合到卵白蛋白載體上。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，還包括用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺將所述乙酰金剛烷胺的胺衍生物結(jié)合到所述卵白蛋白載體上。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，還包括在弗氏佐劑中乳化所述乙酰金剛烷胺的胺衍生物和所述卵白蛋白載體。
7.如權(quán)利要求3所述的方法，還包括用偶合到所述乙酰金剛烷胺的抗生物素蛋白免疫所述哺乳動(dòng)物。
8.如權(quán)利要求3所述的方法，還包括用所述乙酰金剛烷胺的胺衍生物對(duì)所述哺乳動(dòng)物進(jìn)行增強(qiáng)。
9.如權(quán)利要求3所述的方法，還包括: 獲得來(lái)自所述哺乳動(dòng)物的外`周血單核細(xì)胞的樣品； 在B淋巴細(xì)胞被多克隆活化的條件下培養(yǎng)所述外周血單核細(xì)胞；和 活化所述B淋巴細(xì)胞以增殖和分化為抗體分泌細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求1或2所述的抗體的用途，所述抗體作為診斷工具來(lái)測(cè)定患者中的精胺/精脒N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶。
【文檔編號(hào)】C12P21/00GK103608358SQ201280024582
【公開(kāi)日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2012年5月10日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月10日
【發(fā)明者】布萊恩·鄭, 拉希德·巴克斯, 格雷戈里奧·阿韋爾薩, 布拉姆·拉姆賈汪, 丹尼爾·西塔爾 申請(qǐng)人:百奧馬克科技有限公司