具有纖維二糖水解酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸的制作方法

具有纖維二糖水解酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸的制作方法【專利摘要】本發(fā)明涉及具有纖維二糖水解酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細胞，以及產(chǎn)生和使用所述多肽的方法。【專利說明】具有纖維二糖水解酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸[0001]對于在聯(lián)邦資助的研究和開發(fā)下完成的發(fā)明的權(quán)利的聲明[0002]本發(fā)明是部分地在由能源部授予的合作協(xié)議(CooperativeAgreement)DE-FC36-08G018080下以政府支持完成的。政府在本發(fā)明中具有一定權(quán)利。[0003]涉及序列表[0004]本申請包含計算機可讀形式的序列表，其通過提述并入本文。[0005]發(fā)明背景發(fā)明領域[0006]本發(fā)明涉及具有纖維二糖水解酶活性的多肽和編碼所述多肽的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細胞，以及產(chǎn)生和使用所述多肽的方法。[0007]相關領域描述[0008]纖維素是簡單糖葡萄糖通過P-1,4-鍵共價連接的聚合物。許多微生物產(chǎn)生水解連接的葡聚糖的酶。這些酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和(6-葡糖苷酶。內(nèi)切葡聚糖酶在隨機位置消化纖維素聚合物，將其打開(openingit)以受到纖維二糖水解酶攻擊(attack)。纖維二糖水解酶順序地從纖維素聚合物的末端釋放纖維二糖的分子。纖維二糖是水溶性的(6-1,4-連接的葡萄糖二聚體。(6-葡糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖。[0009]將含木素纖維素原料(lignocellulosicfeedstock)轉(zhuǎn)化為乙醇具有以下優(yōu)勢:大量原料現(xiàn)成可用，避免燃燒或填埋材料的合意性和乙醇燃料的清潔性。木材、農(nóng)業(yè)殘余物、草本作物和城市固體廢物被認為是用于乙醇產(chǎn)生的原料。這些材料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。一旦將木素纖維素轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵的糖例如葡萄糖，所述可發(fā)酵的糖容易地由酵母發(fā)酵成乙醇。[0010]本發(fā)明提供了具有纖維二糖水解酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸。[0011]具有纖維二糖水解酶活性的T.byssochlamydoidesGH7多肽(SEQIDN0:2)與來自埃默森踝節(jié)菌(Talaromycesemersonii)的纖維二糖水解酶的推導的氨基酸序列(GENESEQP:AYL28232)共享87.41%同一性(排除缺口)。[0012]具有纖維二糖水解酶活性的T.byssochlamydoidesGH7多肽(SEQIDNO:4)與來自Neosartoryafischeri的糖基水解酶家族7蛋白的推導的氨基酸序列(SWISSPR0T:A1DAP8)共享78.94%同一性(排除缺口)?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0013]本發(fā)明涉及具有纖維二糖水解酶活性的分離的多肽，其選自下組:[0014](a)多肽，其與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少90%序列同一性；或多肽，其與SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少80%序列同一性；[0015](b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少90%序列同一性；或多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少80%序列同一性；[0016](C)SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的成熟多肽的包含一個或多個(例如幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體；和[0017](d)(a)、(b)或(C)的多肽的具有纖維二糖水解酶活性的片段。[0018]本發(fā)明亦涉及分離的多肽，其包含催化域，所述催化域選自下組:[0019](a)催化域，其與SEQIDNO:2的催化域具有至少90%序列同一性；或催化域，其與SEQIDNO:4的催化域具有至少80%序列同一性；[0020](b)催化域，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:1的催化域編碼序列具有至少90%序列同一性；或催化域，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:3的催化域編碼序列具有至少80%序列同一性；[0021](C)SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的催化域的包含一個或多個(幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入的催化域變體；和[0022](d)(a)、(b)或(C)的催化域的具有纖維二糖水解酶活性的片段。[0023]本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明多肽的酶組合物；編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、重組表達載體和重組宿主細胞；和產(chǎn)生所述多肽的方法。[0024]本發(fā)明還涉及降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，包括:在本發(fā)明的具有纖維二糖水解酶活性的多肽的存在下用酶組合物處理纖維素材料。在一個方面，所述方法進一步包括回收經(jīng)降解或轉(zhuǎn)化的纖維素材料。[0025]本發(fā)明還涉及產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括:(a)在本發(fā)明的具有纖維二糖水解酶活性的多肽的存在下用酶組合物糖化纖維素材料；(b)用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(C)從發(fā)酵回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。[0026]本發(fā)明還涉及發(fā)酵纖維素材料的方法，包括:用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵纖維素材料，其中所述纖維素材料是在本發(fā)明的具有纖維二糖水解酶的多肽的存在下用酶組合物糖化的。在一個方面，所述纖維素材料的發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。在另一個方面，所述方法進一步包括從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。[0027]定義[0028]纖維二糖水解酶:術語“纖維二糖水解酶”意指1，4-0-D-葡聚糖纖維二糖水解酶(I,4-beta-D-glucancellobiohydrolase)(E.C.N0.3.2.1.91)，其催化纖維素、纖維素寡糖，或任何包含P-1,4-連接的葡萄糖的聚合物中的1，4-^-D-糖苷鍵的水解，從鏈的還原或非還原末端釋放纖維二糖(Teeri,1997，Crystallinecellulosedegradation:Newinsightintothefunctionofcellobiohydrolases,TrendsinBiotechno1gyI5:160-167;Teeri等,1998,TrichodermareeseiceIlobiohydroIases:whysoefficientoncrystallinecellulose?，Biochem.Soc.Trans.26:173-178)。就本發(fā)明而言，根據(jù)Lever等，1972，Anal.Biochem.47:273-279;vanTilbeurgh等，1982，F(xiàn)EBSLetters,149:152-156;vanTilbeurgh和Claeyssens，1985，F(xiàn)EBSLetters,187:283-288;以及Tomme等，1988，Eur?J.Biochem.170:575-581描述的方法確定纖維二糖水解酶活性。在本發(fā)明中，可釆用Lever等的方法來評價玉米秸桿中的纖維素水解，而vanTilbeurgh等和Tomme等的方法可用于確定對焚光性二糖衍生物4_甲基傘形基--D-乳糖苷(4-methylumbelliferyl--D-lactoside)的纖維二糖水解酶活性。優(yōu)選地，本發(fā)明的纖維二糖水解酶是家族7糖基水解酶(GH7)。在本發(fā)明中，實施例部分中所述的測定法可用于測量纖維二糖水解酶活性。[0029]本發(fā)明的多肽具有SEQIDN0:2或SEQIDNO:4的成熟多肽的纖維二糖水解酶活性的至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%和至少100%。[0030]纖維素分解酶或纖維素酶:術語“纖維素分解酶”或“纖維素酶”意指一種或多種(幾種)水解纖維素材料的酶。此類酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、(6-葡糖苷酶或其組合。測量纖維素分解活性的兩種基本方法包括:(I)測量總纖維素分解活性，和(2)測量單獨的纖維素分解活性(內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和(6-葡糖苷酶)，如Zhang等,Outlookforcellulaseimprovement:Screeningandselectionstrategies,2006,BiotechnologyAdvances24:452-481所綜述的。總纖維素分解活性通常是使用不溶性底物來測定的，所述底物包括WhatmanN0.1濾紙、微晶纖維素、細菌纖維素、藻類纖維素、棉花、經(jīng)預處理的木素纖維素等。最常見的總纖維素分解活性測定法是使用WhatmanN0.1濾紙作為底物的濾紙測定法。該測定法是由InternationalUnionofPureandAppliedChemistry(IUPAC)(Ghose,1987，Measurementofcellulaseactivities,PureApp1.Chem.59:257-68)確立的。[0031]就本發(fā)明而言，纖維素分解酶活性通過測量在下述條件下由纖維素分解酶進行的纖維素材料水解的增加來確定:l_20mg的纖維素分解酶蛋白/g的PCS中纖維素在50°C進行3-7日，與未添加纖維素分解酶蛋白的對照水解相比較。典型條件為:1ml反應液，經(jīng)洗滌或未洗滌的？05，5%不溶性固形物，50禮乙酸鈉pH5，ImMMnSO4,50°C,72小時，通過AMTNKX(R)HPX-87H柱(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)進行糖分析。[0032]內(nèi)切葡聚糖酶:術語“內(nèi)切葡聚糖酶”意指內(nèi)切-1，4-(1,3;1，4)-@-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-1,4_3-D-glucan4-glucanohydrolase)(E.C.3.2.1.4),其催化纖維素、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣淀粉(Iichenin)中的1，4-0-D-糖苷鍵、混合的(6-1,3葡聚糖例如谷類P-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纖維素組分的其它植物材料中的P-1，4鍵的內(nèi)水解(endohydrolysis)。內(nèi)切葡聚糖酶活性可通過測量底物粘度的減少或由還原糖測定法(Zhang等，2006,BiotechnologyAdvances24:452-481)確定的還原端增加來確定。就本發(fā)明而言，根據(jù)Ghose,1987,PureandAppl.Chem.59:257-268的方法，在pH5，40°C，使用羧甲基纖維素(CMC)作為底物來確定內(nèi)切葡聚糖酶活性。[0033]e-葡糖苷酶:術語“3-葡糖苷酶”意指e-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucosideglucohydrolase)(E.C.N0.3.2.1.21)，其催化末端非還原3-D-葡萄糖殘基的水解，并釋放P-D-葡萄糖。就本發(fā)明而言，(6-葡糖苷酶活性是根據(jù)由Venturi等,2002,Extracellularbeta-D-glucosidasefromChaetomiumthermophilumvar.coprophilum:production,purificationandsomebiochemicalproperties,J.BasicMicrobiol.42:55-66所述的基本步驟確定的。一單位的P-葡糖苷酶定義為在25°C，pH4.8從作為底物的ImM對硝基苯基-P-D-葡糖吡喃糖苷在含有0.01%TWEEN?20的50mM檸檬酸鈉中每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾的對硝基苯酚陰離子。[0034]具有纖維素分解增強活性的多肽:術語“具有纖維素分解增強活性的多肽”意指催化具有纖維素分解活性的酶水解纖維素材料的增強的GH61多肽。就本發(fā)明而言，通過測量由纖維素分解酶在下述條件下水解纖維素材料所導致的還原糖增加或纖維二糖與葡萄糖的總量增加來確定纖維素分解增強活性:l_50mg總蛋白/gPCS中的纖維素，其中總蛋白包含50-99.5%w/w的纖維素分解酶蛋白，及0.5-50%w/w的具有纖維素分解增強活性的GH61多肽的蛋白質(zhì)，在50°C歷時1-7天，與用等量的總蛋白加載量而無纖維素分解增強活性(l-50mg纖維素分解蛋白/gPCS中的纖維素)所進行的對照水解相比。在一個優(yōu)選的方面，使用在總蛋白重量的2-3%的米曲霉(Aspergillusoryzae)P-葡糖苷酶(根據(jù)TO02/095014在米曲霉中重組產(chǎn)生)或者總蛋白重量的2-3%的煙曲霉(Aspergillusfumigatus)^-葡糖苷酶(如W02002/095014所述在米曲霉中重組產(chǎn)生)的纖維素酶蛋白加載量存在下的CELLUCLAST?1.5L(NovozymesA/S,BagSVcErd,Denmark)的混合物作為纖維素分解活性的來源。[0035]具有纖維素分解增強活性的GH61多肽通過降低達到相同水解程度所需的纖維素分解酶的量而增強由具有纖維素分解活性的酶催化的纖維素材料的水解，優(yōu)選降低至少1.01倍，更優(yōu)選至少1.05倍，更優(yōu)選至少1.10倍，更優(yōu)選至少1.25倍，更優(yōu)選至少1.5倍，更優(yōu)選至少2倍，更優(yōu)選至少3倍，更優(yōu)選至少4倍，更優(yōu)選至少5倍，甚至更優(yōu)選至少10倍，并且最優(yōu)選至少20倍。[0036]家族7或家族61糖苷水解酶:術語“家族GH7”或“GH7”或“家族7糖苷水解酶”，或者“家族GH61”或“GH61”或“家族61糖苷水解酶”意指根據(jù)Henrissat,1991，AclassificationofglycosyIhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316,及Henrissat和Bairoch，1996，Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases，Biochem.J.316:695-696分別屬于糖苷水解酶家族7或家族61的多肽。[0037]半纖維素分解酶或半纖維素酶:術語“半纖維素分解酶”或“半纖維素酶”意指一種或多種(幾種)水解半纖維素材料的酶。參見，例如Shallom和Shoham2003,Microbialhemicellulases.CurrentOpinionInMicrobiology,6(3):219-228)。半纖維素酶是植物生物質(zhì)降解中的關鍵成分。半纖維素酶的實例包括但不限于乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。這些酶的底物，半纖維素，是支化和直鏈多糖的混雜集團，這些多糖通過氫鍵鍵合于植物細胞壁中的纖維素微纖維，將其交聯(lián)為魯棒(robust)的網(wǎng)絡。半纖維素亦共價地附接于木質(zhì)素，與纖維素一同形成高度復雜的結(jié)構(gòu)。半纖維素的可變的結(jié)構(gòu)和組織形式需要許多酶的協(xié)同作用使其完全降解。半纖維素酶的催化模塊為水解糖苷鍵的糖苷水解酶(GH)，或水解乙酸或阿魏酸側(cè)基酯連接的糖酯酶(CE)。這些催化模塊，基于其一級結(jié)構(gòu)的同源性，可指定為以數(shù)字標記的GH和CE家族。一些家族，具有總體上類似的折疊，可進一步歸類為宗族(clan)，以字母標記(例如，GH-A)。最具信息性和最新的這些和其他糖活性酶的分類可在Carbohydrate-ActiveEnzymes(CAZy)數(shù)據(jù)庫獲得。半纖維素分解酶活性可根據(jù)Ghose和Bisaria,1987,Pure&Appl.Chem.59:1739-1752測量。[0038]木聚糖降解活性或木聚糖分解活性:術語“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含木聚糖材料的生物學活性。兩種測定木聚糖分解活性的基礎方法包括:(I)測定總木聚糖分解活性，和(2)測定單獨的木聚糖分解活性(例如，內(nèi)切木聚糖酶、(6-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、a-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和a-葡糖醒酸酯酶(a-glucuronylesterase))。最近在木聚糖分解酶測定法的進展總結(jié)于幾個公開文獻中，包括Biely和Puchard，Recentprogressintheassaysofxylanolyticenzymes,2006,JournaloftheScienceofFoodandAgriculture86(11):1636-1647；Spanikova和Biely，2006，Glucuronoylesterase-NovelcarbohydrateesteraseproducedbySchizophyllumcommune,FEBSLetters580(19):4597-4601；Herrmann等，1997，Thebeta-D-xylosidaseofTrichodermareeseiisamultifunctionalbeta-D-xylanxylohydrolase,BiochemicalJournal321:375—381。[0039]總木聚糖降解活性可通過確定從多種類型的木聚糖形成的還原糖來測量，所述木聚糖包括例如燕麥小麥(oatspelt)、山毛櫸木(beechwood)和落葉松木(Iarchwood)木聚糖，或者可通過光度法確定從多種共價染色的木聚糖釋放出的染色的木聚糖片段來測量。最常見的總木聚糖分解活性測定法基于從多聚的4-0-甲基葡糖醛酸木聚糖產(chǎn)生還原糖，如Bailey等，1992，Interlaboratorytestingofmethodsforassayofxylanaseactivity,JournalofBiotechnology23(3):257-270中所述。木聚糖酶活性亦可用0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作為底物在37°C在0.01%TRITONSX-100和200mM磷酸鈉緩沖液pH6中確定。一單位的木聚糖酶活性定義為在37°C，pH6從200mM磷酸鈉pH6緩沖液中作為底物的0.2%AZCL阿拉伯木聚糖每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾的天青蛋白(azurine)。[0040]就本發(fā)明而言，木聚糖降解活性是通過測量由木聚糖降解酶在下述典型條件下造成的樺木木聚糖(SigmaChemicalC0.，Inc.，St.Louis,MO,USA)水解的增加來確定的:1ml反應，5mg/ml底物(總固形物),5mg木聚糖分解蛋白/g底物，50mM乙酸鈉，pH5,50°C,24小時，如Lever,1972，Anewreactionforcolorimetricdeterminationofcarbohydrates,Anal.Biochem47:273-279所述使用對羥基苯甲酸酸餅(PHBAH)測定法進行糖分析。[0041]木聚糖酶:術語“木聚糖酶”意指催化木聚糖中1，4-0-D-木糖苷鍵的內(nèi)水解的1，4-&-D-木聚糖-木糖水解酶(E.C.3.2.1.8)。就本發(fā)明而言，木聚糖酶活性是以0.01%TRITON?x-100和200mM磷酸鈉緩沖液pH6中0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作為底物在37°C確定的。一個單位的木聚糖酶活性定義為在37°C，pH6從200mM磷酸鈉pH6緩沖液中作為底物的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾的天青蛋白。[0042]^-木糖苷酶:術語“^-木糖苷酶”意指P-D-木糖苷木糖水解酶(^-D-xylosidexylohydrolase)(E.C.3.2.1.37)，其催化短3(I—4)木寡糖(xylooIigosaccharide)的外水解以從非還原端去除連續(xù)的D-木糖殘基。就本發(fā)明而言，一個單位的(6-木糖苷酶定義為在40°C，pH5從ImM對硝基苯基-P-D-木糖苷作為底物在含有0.01%TWEEN?20的IOOmM檸檬酸鈉中每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾對硝基苯酚陰離子。[0043]乙酰木聚糖酯酶:術語“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(EC3.1.1.72)，其催化乙?；鶑木酆夏揪厶?、乙酰化木糖、乙?；咸烟恰⒁宜酑t-萘酯(alpha-napthylacetate)和乙酸對硝基苯酯(p-nitrophenylacetate)的水解。就本發(fā)明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用0.5mM乙酸對硝基苯酯作為底物，在含有0.01%TWEEN?20的50mM乙酸鈉pH5.0中確定的。一個單位的乙酰木聚糖酯酶定義為能夠在pH5,25°C每分鐘釋放I微摩爾對硝基苯酌陰離子(p-nitrophenolateanion)的酶量。[0044]阿魏酸酯酶:術語“阿魏酸酯酶(feruloylesterase)”意指4_羥基_3_甲氧基肉桂酰-糖水解酶(EC3.1.1.73)，其催化4-羥基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基團從酯化的糖(其在“天然”底物中通常為阿拉伯糖)的水解，以產(chǎn)生阿魏酸(4-羥基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也稱作阿魏酸酯酶(ferulicacidesterase)、羥基肉桂酸酯酶(hydroxycinnamoylesterase)>FAE-1II>肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE_I或FAE-1I。就本發(fā)明而言，阿魏酸酯酶是使用50mM乙酸鈉pH5.0中的0.5mM阿魏酸對硝基苯酯作為底物確定的。一個單位的阿魏酸酯酶活性等于能夠在pH5，25°C每分鐘釋放出I微摩爾對硝基苯酚陰離子的酶量。[0045]a-葡糖醛酸糖苷酶:術語“a-葡糖醛酸糖苷酶”意指a_D_葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(alpha-D-glucosiduronateglucuronohydrolase)(EC3.2.1.139)，其催化a-D-葡糖醛酸糖苷水解為D-葡糖醛酸和醇。就本發(fā)明而言，a-葡糖醛酸糖苷酶活性是根據(jù)deVries,1998,J.Bacteriol.180:243-249確定的。一個單位的a_葡糖醒酸糖苷酶等于能夠在pH5，40°C每分鐘釋放出I微摩爾葡糖醛酸或4-0-甲基葡糖醛酸的酶量。[0046]a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶:術語“a_L_阿拉伯呋喃糖苷酶活性”意指a_L_阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC3.2.1.55)，其催化對a-L-阿拉伯糖苷中的末端非還原性a-L-阿拉伯呋喃糖苷殘基的水解。該酶對a-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，3)_和/或(1，5)_鍵的a-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也稱為阿拉伯糖苷酶、a-阿拉伯糖苷酶、a-L-阿拉伯糖苷酶、a-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、a-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或a-L-阿拉伯聚糖酶。就本發(fā)明而言，a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用總體積200iiI中的每ml的IOOmM乙酸鈉pH5中5mg的中等粘度小麥阿拉伯木聚糖(MegazymeInternationalIreland,Ltd.,Bray,C0.Wicklow,Ireland)在4CTC進行30分鐘，接著通過AMINEX?HPX-87H柱層析(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)的阿拉伯糖分析來確定的。[0047]纖維素材料:術語“纖維素材料”意指包含纖維素的任何材料。生物質(zhì)的初生細胞壁(primarycellwall)中的主要多糖是纖維素,其次最豐富的是半纖維素,而第三是果膠。次生細胞壁(secondarycellwall)在細胞停止生長后產(chǎn)生,其同樣含有多糖并通過共價交聯(lián)至半纖維素的聚合木質(zhì)素而加強。纖維素是脫水纖維二糖的均聚物，并且因此是直鏈3_(l-4)-D-葡聚糖，而半纖維素包括多種化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的復雜分支結(jié)構(gòu)。盡管通常是多形的，存在于植物組織中的纖維素主要是平行葡聚糖鏈的不溶晶體基質(zhì)。半纖維素通常與纖維素以及其它半纖維素以氫鍵鍵合，其幫助穩(wěn)定細胞壁基質(zhì)。[0048]纖維素通常見于例如植物的莖、葉、殼、皮和穗軸，或樹的葉、枝和木材。纖維素材料可以是，但不限于，草本材料、農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、城市固體廢物、廢紙和紙漿與造紙廠殘余物(參見，例如，Wiselogel等，1995，于HandbookonBioethanol(CharlesE.Wyman編),pp.105-118,Taylor&Francis,WashingtonD.C.;Wyman,1994,BioresourceTechnology50:3-16;Lynd,1990,AppliedBiochemistryandBiotechno1gy24/25:695-719;Mosier等，1999，RecentProgressinBioconversionofLignocellulosics,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,T.Scheper主編，Volume65,pp.23-40,Springer-Verlag,NewYork)。在本文中應理解的是，纖維素可以是以木素纖維素的形式，在混合基質(zhì)中包含木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的植物細胞壁材料。在一個優(yōu)選的方面，纖維素材料是木素纖維素，其包含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。[0049]在一個方面，纖維素材料是草本材料。在另一個方面，纖維素材料是農(nóng)業(yè)殘余物。在另一個方面，纖維素材料是林業(yè)殘余物。在另一個方面，纖維素材料是城市固體廢物。在另一個方面，纖維素材料是廢紙。在另一個方面，纖維素材料是紙漿和造紙廠殘余物。[0050]在另一個方面，纖維素材料是玉米秸桿。在另一個方面，纖維素材料是玉米纖維。在另一個方面，纖維素材料是玉米穗軸。在另一個方面，纖維素材料是橙皮。在另一個方面，纖維素材料是稻桿。在另一個方面，纖維素材料是麥桿。在另一個方面，纖維素材料是柳枝稷(switchgrass)。在另一個方面,纖維素材料是芒草屬(miscanthus)。在另一個方面，纖維素材料是甘蔗渣。[0051]在另一個方面，纖維素材料是微晶纖維素。在另一個方面，纖維素材料是細菌纖維素。在另一個方面，纖維素材料是藻類纖維素。在另一個方面，纖維素材料是棉絨(cottonlinter)。在另一個方面，纖維素材料是無定形的磷酸處理的纖維素。在另一個方面，纖維素材料是濾紙。[0052]纖維素材料可以直接使用或進行預處理，使用本領域已知的常規(guī)方法，如本文所述。在一個優(yōu)選的方面，預處理纖維素材料。[0053]預處理的玉米秸桿:術語“PCS”或“預處理的玉米秸桿”意指通過用熱和稀硫酸處理的源自玉米秸桿的纖維素材料。[0054]非常低嚴格條件:術語“非常低嚴格條件”意指對于長度至少100個核苷酸的探針，在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且變性的鮭精DNA和25%的甲酰胺中，根據(jù)標準的South`ern印跡法進行預雜交和雜交12至24小時。使用2XSSC、0.2%SDS在45°C將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。[0055]低嚴格條件:術語“低嚴格條件”意指對于長度至少100個核苷酸的探針，在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且變性的鮭精DNA和25%的甲酰胺中，根據(jù)標準的Southern印跡法進行預雜交和雜交12至24小時。使用2XSSC、0.2%SDS在50°C將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。[0056]中等嚴格條件:術語“中等嚴格條件”意指對于長度至少100個核苷酸的探針，在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且變性的鮭精DNA和35%的甲酰胺中，根據(jù)標準的Southern印跡法進行預雜交和雜交12至24小時。使用2XSSC、0.2%SDS在55°C將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。[0057]中等-高嚴格條件:術語“中等-高嚴格條件”意指對于長度至少100個核苷酸的探針，在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且變性的鮭精DNA和35%的甲酰胺中，根據(jù)標準的Southern印跡法進行預雜交和雜交12至24小時。使用2XSSC、0.2%SDS在60°C將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。[0058]高嚴格條件:術語“高嚴格條件”意指對于長度至少100個核苷酸的探針，在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且變性的鮭精DNA和50%的甲酰胺中，根據(jù)標準的Southern印跡法進行預雜交和雜交12至24小時。使用2XSSC、0.2%SDS在65°C將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。[0059]非常高嚴格條件:術語“非常高嚴格條件”意指對于長度至少100個核苷酸的探針，在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且變性的鮭精DNA和50%的甲酰胺中，根據(jù)標準的Southern印跡法進行預雜交和雜交12至24小時。使用2XSSC、0.2%SDS在70°C將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。[0060]分離的:術語“分離的”意指以不在自然界出現(xiàn)的形式或環(huán)境存在的物質(zhì)。分離的物質(zhì)的非限定性實例包括(I)任何非天然存在的物質(zhì)，(2)任何至少部分地從一種或多種或全部與其天然結(jié)合的天然存在的成分移出的物質(zhì)，包括但不限于任何酶、變體、核酸、蛋白質(zhì)、肽或輔因子；(3)任何相對于見于自然界的該物質(zhì)經(jīng)人工修飾的物質(zhì)；或(4)任何通過相對于與其自然結(jié)合的其他組分增加該物質(zhì)的量(例如，編碼該物質(zhì)的基因的多拷貝；比與編碼該物質(zhì)的基因自然結(jié)合的啟動子更強的啟動子的使用)而修飾的物質(zhì)。分離的物質(zhì)可存在于發(fā)酵液樣品中。[0061]成熟多肽:術語“成熟多肽”意指以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存在的多肽，所述修飾例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:2的氨基酸I至18是信號肽的SignalP程序(Nielsen等,1997,ProteinEngineeringlO:1-6),成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸19至455。本領域中已知宿主細胞可產(chǎn)生兩種或更多種由相同多核苷酸表達的不同成熟多肽(即，具有不同的C端和/或N端氨基酸)的混合物。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDN0:4的氨基酸I至25是信號肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineeringlO:1-6),成熟多妝是SEQIDNO:4的氨基酸26至537。本領域中已知宿主細胞可產(chǎn)生兩種或更多種由相同多核苷酸表達的不同成熟多肽(即，具有不同的C端和/或N端氨基酸)的混合物。[0062]成熟多肽編碼序列:術語“成熟多肽編碼序列”意指編碼具有纖維二糖水解酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:1的核苷酸I至54編碼信號肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，見上)，成熟多肽編碼序列是SEQIDN0:1的核苷酸55至603、668至1235、1311至1507。在另一個方面，根據(jù)預測SEQIDNO:3的核苷酸I至75編碼信號肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，見上)，成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:3的核苷酸76至1614。[0063]催化域:術語“催化域”意指含有酶的催化機構(gòu)(catalyticmachinery)的酶的部分。[0064]纖維素結(jié)合域:術語“纖維素結(jié)合域”意指介導酶對纖維素底物的無定形區(qū)的結(jié)合的酶的部分。纖維素結(jié)合域(CBD)通常見于酶的N末端或C末端。CBD亦稱作纖維素結(jié)合模塊(cellulosebindingmodule)或CBM。在一個實施方案中，CBM是SEQIDN0:4的氨基酸502至537。CBM與催化域由接頭序列分隔。所述接頭在一個實施方案中是SEQIDNO:4的氨基酸452至495。[0065]序列同一性:參數(shù)“序列同一性”描述兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關性。[0066]就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等,2000,TrendsGenet.16:276-277),優(yōu)選5.0.0版或更高版本的Needle程序中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)來測定。使用的可選參數(shù)為缺口開放罰分(gapopenpenalty)10,缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)0.5和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標記為“最高同一I"生(longestidentity)”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項獲得)作為同一丨生百分比，并計算如下:[0067](同樣的殘基X100)/(比對長度一比對中缺口的總數(shù))[0068]就本發(fā)明而言，兩個脫氧核苷酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000，見上文)，優(yōu)選5.0.0版或更高版本的Needle程序中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，見上文)來測定。使用的可選參數(shù)為缺口開放罰分10，缺口延伸罰分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標記為“最高同一性”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項獲得)作為同一性百分比，并計算如下:[0069](同樣的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度一比對中缺口的總數(shù))[0070]片段:術語“片段”意指從成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個(幾個)氨基酸的多肽；其中所述片段具有纖維二糖水解酶活性。在一個方面，片段含有至少390個氨基酸殘基，例如至少400個氨基酸殘基，或至少430個氨基酸殘基。[0071]亞序列:術語“亞序列(subsequence)”意指從成熟多肽編碼序列的5’和/或3’端缺失一個或多個(幾個)核苷酸的多核苷酸；其中所述亞序列編碼具有纖維二糖水解酶活性的片段。在一個方面，亞序列含有至少1170個核苷酸，例如至少1230個核苷酸，或至少1290個核苷酸。[0072]等位變體(allel`icvariant):術語“等位變體”意指占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或更多種可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。[0073]編碼序列:術語“編碼序列”意指直接指定多肽氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或其他起始密碼子例如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子例如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的或重組的多核苷酸。[0074]cDNA:術語“cDNA”意指能夠通過反轉(zhuǎn)錄從得自真核細胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起始的(initial)、初級的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其通過一系列的包括剪接的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。[0075]核酸構(gòu)建體:術語“核酸構(gòu)建體”意指單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離自天然存在的基因，或受修飾以本來不存在于(nototherwiseexist)自然界中的方式含有核酸的區(qū)段，或其為合成的。當所述核酸構(gòu)建體含有表達本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時，術語核酸構(gòu)建體與術語“表達盒”同義。[0076]調(diào)控序列(controlsequence):術語“調(diào)控序列”意指對編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸表達是必需的所有成分。各個調(diào)控序列對于編碼所述多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各個調(diào)控序列對于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調(diào)控序列與編碼多肽的多核苷酸編碼區(qū)的連接。[0077]可操作地連接:術語“可操作地連接”意指這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對于多核苷酸的編碼序列的適當位置，使得調(diào)控序列指導編碼序列的表達。[0078]表達:術語“表達”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。[0079]表達載體:術語“表達載體”意指線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達的額外核苷酸可操作地連接。[0080]宿主細胞:“宿主細胞”意指任何細胞類型，所述細胞類型對于使用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導等是易感的(susceptible)。術語“宿主細胞”涵蓋親本細胞的任何后代，所述后代由于在復制中發(fā)生的突變而不同于親本細胞。[0081]變體:術語“變體”意指具有纖維二糖水解酶活性的多肽，其包含改變，即在一個或多個(幾個)位置的取代、插入和/或缺失一個或多個(幾個)氨基酸殘基。取代意指用不同的氨基酸取代占據(jù)某位置的氨基酸；缺失意指去除占據(jù)某位置的氨基酸；而插入意指鄰接于占據(jù)某位置的氨基酸添加一個或多個(幾個)氨基酸，例如1-5個氨基酸。[0082]發(fā)明詳述[0083]具有纖維二糖水解酶活性的多肽[0084]本發(fā)明涉及具有纖維二糖水解酶活性的分離的多肽，所述多肽選自下組:[0085](a)多肽，其與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少90%序列同一性；或多肽，其與SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少80%序列同一性[0086](b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少90%序列同一性；或多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少80%序列同一性；[0087](C)SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的成熟多肽的包含一個或多個(例如幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體；和[0088](d)(a)、(b)或(C)的多肽的具有纖維二糖水解酶活性的片段。[0089]本發(fā)明涉及分離的多肽，所述分離的多肽與SEQIDN0:2的成熟多肽具有至少90%,例如至少92%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性，所述多肽具有纖維二糖水解酶活性。在一個方面，所述多肽與SEQIDN0:2的成熟多肽相差不超過十個氨基酸，例如相差五個氨基酸，相差四個氨基酸，相差三個氨基酸，相差兩個氨基酸，和相差一個氨基酸。[0090]本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含或組成為(consistof)SEQIDNO:2的氨基酸序列或其等位變體；或為其具有纖維二糖水解酶活性的片段。在另一個方面，所述多肽包含或組成為SEQIDNO:2的成熟多肽。在另一個優(yōu)選方面，所述多肽包含或組成為SEQIDN0:2的氨基酸19至469。[0091]本發(fā)明涉及分離的多肽，所述分離的多肽與SEQIDN0:4的成熟多肽具有至少80%,例如至少85%,至少87%,至少90%,至少92%,至少95%,例如至少96%,至少97%,至少98%，至少99%，或100%的序列同一性，所述多肽具有纖維二糖水解酶活性。在一個方面，所述多肽與SEQIDN0:4的成熟多肽相差不超過十個氨基酸，例如相差五個氨基酸，相差四個氨基酸，相差三個氨基酸，相差兩個氨基酸，和相差一個氨基酸。[0092]本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含或組成為(consistof)SEQIDNO:4的氨基酸序列或其等位變體；或為其具有纖維二糖水解酶活性的片段。在另一個方面，所述多肽包含或組成為SEQIDNO:4的成熟多肽。在另一個優(yōu)選方面，所述多肽包含或組成為SEQIDN0:4的氨基酸26至537。在另一個方面，所述多肽包含或組成為SEQIDNO:4的氨基酸26至465。所述片段包含催化域。[0093]本發(fā)明還涉及具有纖維二糖水解酶活性的分離的多肽，所述分離的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在非常低嚴格條件，低嚴格條件，中等嚴格條件，中等-高嚴格條件，高嚴格條件或非常高嚴格條件下，與以下雜交:(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中包含的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatis,1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,NewYork)0[0094]本發(fā)明還涉及具有纖維二糖水解酶活性的分離的多肽，所述分離的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在非常低嚴格條件，低嚴格條件，中等嚴格條件，中等-高嚴格條件，高嚴格條件或非常高嚴格條件下，與以下雜交:(i)SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:3的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatis,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,NewYork)。[0095]SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的多核苷酸或其亞序列，以及SEQIDN0:2或SEQIDN0:4的氨基酸序列或其片段，可用于設計核酸探針，以根據(jù)本領域內(nèi)公知的方法從不同屬或種的菌株鑒定和克隆編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽的DNA。具體而言，根據(jù)標準的Southern印跡方法,可將這些探針用于與感興趣的屬或種的基因組DNA或cDNA雜交，以鑒定和從其中分離相應的基因。這些探針可明顯短于完整序列，但長度上應為至少14，例如至少25，至少35，或至少70個核苷酸。優(yōu)選地，所述核酸探針是至少100個核苷酸的長度，例如，至少200個核苷酸，至少300個核苷酸，至少400個核苷酸，至少500個，至少600個核苷酸，至少700個核苷酸，至少800個核苷酸，或至少900個核苷酸的長度。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標記以探測相應的基因(例如，用32p、3h、35s、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標記)。這些探針涵蓋于本發(fā)明中。[0096]可從由這些其它株(strain)制備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選DNA，所述DNA與上述探針雜交并且編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽?？梢酝ㄟ^瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或通過其它分離技術分離來自這些其它株的基因組或其它DNA?？梢詫碜晕膸斓腄NA或分離的DNA轉(zhuǎn)移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料并且固定于其上。為了鑒定與SEQIDNO:1或其亞序列同源的克隆或DNA，將所述載體材料優(yōu)選用在Sounthern印跡中。[0097]就本發(fā)明而言，雜交表示多核苷酸在非常低至非常高的嚴格條件下與標記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應于SEQIDN0:1或SEQIDNO:3；SEQIDN0:1或SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列；SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中包含的cDNA序列或SEQIDNO:3的基因組DNA序列；其全長互補鏈；或它們的亞序列?？墒褂美鏧射線片(X-rayfilm)檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。[0098]在一個方面，核酸探針是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列。在另一個方面，核酸探針是SEQIDNO:1的核苷酸55至1507或其cDNA序列。在另一個方面，核酸探針是編碼SEQIDN0:2的多肽或其成熟多肽，或它們的片段的多核苷酸。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1或其cDNA序列。[0099]在一個方面，核酸探針是SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列或其基因組DNA序列。在另一個方面，核酸探針是SEQIDN0:3的核苷酸76至1614或其基因組序列。在另一個方面，核酸探針是編碼SEQIDN0:4的多肽或其成熟多肽，或它們的片段的多核苷酸。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDN0:3或其基因組序列。[0100]對于長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴格條件定義為在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中，并且對于非常低和低嚴格性為25%的甲酰胺、對于中和中等-高嚴格性為35%的甲酰胺、或?qū)τ诟吆头浅８邍栏裥詾?0%的甲酰胺,根據(jù)標準的Southern印跡法進行預雜交和雜交最佳12至24小時。使用2XSSC、0.2%SDS在45°C(非常低嚴格性)，在50°C(低嚴格性)，在55°C(中嚴格性)，在60°C(中等-高嚴格性)，在65°C(高嚴格性)，和在70°C(非常高嚴格性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。[0101]對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴格條件定義為在比使用根據(jù)Bolton和McCarthy計算法(1962,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA48:1390)計算的Tni低大約5°C至大約1(TC，在0.9MNaCl,0.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA，0.5%NP_40，IXDenhardt溶液，ImM焦憐酸鈉(sodiumpyrophosphate),ImM憐酸二氫鈉(sodiummonobasicphosphate),0.1mMATP和每ml0.2mg的酵母RNA中，根據(jù)標準的Southern印跡步驟進行預雜交和雜交最佳12至24小時。將所述載體材料在6XSSC加0.1%SDS中最終洗滌一次15分鐘，并用6XSSC在比計算的Tm低5°C至I(TC的溫度洗滌兩次，每次15分鐘。[0102]本發(fā)明還涉及由多核苷酸編碼的具有纖維二糖水解酶活性的分離的多肽，所述多核苷酸與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少90%，例如至少92%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性。[0103]本發(fā)明還涉及由多核苷酸編碼的具有纖維二糖水解酶活性的分離的多肽，所述多核苷酸與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列或其基因組序列具有至少80%，例如至少85%，至少87%，至少90%，至少92%，至少95%，例如至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性。[0104]本發(fā)明還涉及SEQIDN0:2或SEQIDN0:4的成熟多肽或其同源序列的包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體。優(yōu)選地，氨基酸改變對性質(zhì)是較不重要的(ofaminornature),即保守的氨基酸取代或插入,其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；通常為I至大約30個氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來促進純化的小延伸，如多組氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結(jié)合域(bindingdomain)。[0105]保守取代的實例是在以下組之內(nèi):堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領域已知的，并且由例如H.Neuratt^PR.L.Hill,1979,于TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。[0106]可供選擇的是，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì):使多肽的物理化學性質(zhì)改變。例如，氨基酸改變可改進多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適PH等。[0107]能夠根據(jù)本領域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸掃描誘變法(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)來鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個殘基，并且測試所得突變分子的纖維二糖水解酶活性以鑒定對于所述分子的活性關鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過結(jié)構(gòu)的物理分析而測定，如通過以下這些技術:如核磁共振、晶體學、電子衍射或光親和標記，連同推定的接觸位點氨基酸的突變來測定。參見例如deVos等，1992，Science255:306-312；Smith等，1992,J.Mol.Biol.224:899-904;Wlodaver等，1992,FEBSLett.309:59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能夠從與多肽的同一丨丨生分析來推斷，所述多肽與親本多肽相關。[0108]能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后是有關的篩選方法，例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988，Science241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:2152-2156；W095/17413;或W095/22625公開的那些方法來進行并測試單個或多個氨基酸取代、缺失和/或插入。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、卩遼菌體展不(例如，Lowman等，1991，Biochemistry30:10832-10837;美國專利N0.5，223，409；W092/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire等，1986，Gene46:145；Ner等，1988，DNA7:127)。`[0109]誘變/改組方法能夠與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細胞表達的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等，1999,NatureBiotechnologyl7:893-896)。能夠從宿主細胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領域內(nèi)標準方法快速測序。這些方法允許快速測定多肽中單個氨基酸殘基的重要性。[0110]在一個實施方案中，SEQIDN0:2或SEQIDN0:4的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)不多于10，例如1，2，3，4，5，6，7，8或9。[0111]所述多肽可為雜合多肽，其中一種多肽的一部分融合于另一種多肽的一部分的N端或C端。[0112]所述多肽可為融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一種多肽融合于本發(fā)明多肽的N端或C端。通過將編碼另一個多肽的多核苷酸融合于本發(fā)明的多核苷酸來產(chǎn)生融合的多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術是本領域已知的，并包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們在閱讀框中，并且使融合多肽的表達在相同啟動子和終止子的控制下。融合蛋白亦可使用內(nèi)蛋白(intein)技術構(gòu)建，其中融合物在翻譯后產(chǎn)生(Cooper等，1993，EMBOJ.12:2575-2583;Dawson等，1994，Science266:776-779)。[0113]融合多肽還可以包含在兩個多肽之間的切割位點。在分泌融合多肽時，就切割所述位點，釋放所述兩個多肽。切割位點的實例包括，但不限于，公開于Martin等，2003，J.1nd.Microbiol.Biotechnol.3:568-76;Svetina等，2000，J.Biotechnol.76:245-251;Rasmussen-Wilson等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493;Ward等，1995，Biotechnologyl3:498-503;和Contreras等，1991，Biotechnology9:378-381;Eaton等，1986，Biochem.25:505-512)；Collins-Racie等，1995,Biotechnologyl3:982-987;Carter等，1989,Proteins:Structure,Function,andGenetics6:240-248;以及Stevens,2003，DrugDiscoveryWorld4:35-48中的位點。[0114]具有纖維二糖水解酶活性的多肽的來源[0115]本發(fā)明的具有纖維二糖水解酶活性的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來源有關的術語“獲得自”，意思應為多核苷酸編碼的多肽由所述來源產(chǎn)生，或由其中插入了來自所述來源的多核苷酸的菌株產(chǎn)生。在一個方面，獲得自給定來源的多肽是胞外分泌的。[0116]所述多肽可為踝節(jié)菌屬(Talaromyces)多肽。[0117]在另一個方面,所述多肽是Talaromycesbyssochlamydoides多肽。在另一個方面，所述多妝是TalaromycesbyssochlamydoidesCBS413.71多妝。[0118]會理解的是對于前述的種，本發(fā)明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates),和其它分類學的等同物(equivalent),例如無性型(anamorph),而無論它們已知的種名。本領域技術人員將容易地識別適合的等同物的身份。[0119]這些種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏中心對于公眾能夠容易地取得，所述保藏中心諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSMZ)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。[0120]可以使用上述的探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑒定和獲得所述多肽。用于從天然生境(habitat)分離微生物的技術是本領域內(nèi)公知的。隨后可通過相似地篩選另一種微生物的基因組DNA或cDNA文庫或混合的DNA樣品來獲得編碼所述多肽的多核苷酸。一旦用所述探針檢測到編碼多肽的多核苷酸，就能夠使用本領域普通技術人員熟知的技術分離或克隆所述多核苷酸(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。[0121]催化域[0122]本發(fā)明亦涉及分離的多肽，其包含催化域，所述催化域選自下組:[0123](a)催化域，其與SEQIDNO:2的催化域具有至少90%序列同一性；或催化域，其與SEQIDNO:4的催化域具有至少80%序列同一性；[0124](b)催化域，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:1的催化域編碼序列具有至少90%序列同一性；或催化域，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:3的催化域編碼序列具有至少80%序列同一性；[0125](C)SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的催化域的包含一個或多個(例如幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入的催化域變體；和[0126](d)(a)、(b)或(C)的催化域的具有纖維二糖水解酶活性的片段。[0127]所述催化域優(yōu)選與SEQIDNO:2的催化域具有至少90%，例如至少92%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性程度。在一個方面,所述催化域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的催化域相差十個氨基酸，例如相差五個氨基酸，相差四個氨基酸，相差三個氨基酸，相差兩個氨基酸，和相差一個氨基酸。[0128]所述催化域優(yōu)選包含或組成為(consistof)SEQIDNO:2的催化域或其等位變體；或為其具有纖維二糖水解酶活性的片段。在另一個方面，所述催化域包含或組成為SEQIDN0:2的催化域。在另一個優(yōu)選方面，所述催化域包含或組成為SEQIDN0:2的氨基酸19至455。[0129]所述催化域與SEQIDNO:4的催化域具有至少80%，例如至少85%，至少87%，至少90%,至少92%，至少95%，例如至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性程度。在一個方面，所述催化域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:4的催化域相差十個氨基酸，例如相差五個氨基酸，相差四個氨基酸，相差三個氨基酸，相差兩個氨基酸，和相差一個氨基酸。[0130]所述催化域優(yōu)選包含或組成為(consistof)SEQIDN0:4的催化域或其等位變體；或為其具有纖維二糖水解酶活性的片段。在另一個方面，所述催化域包含或組成為SEQIDN0:4的催化域。在另一個優(yōu)選方面，所述催化域包含或組成為SEQIDNO:4的氨基酸26至465。[0131]在一個實施方案中，所述催化域可由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在非常低嚴格條件，低嚴格條件，中等嚴格條件，中等-高嚴格條件，高嚴格條件或非常高嚴格條件下(如上文定義)，與以下雜交:(i)SEQIDN0:1的催化域編碼序列，(ii)SEQIDN0:1的催化域編碼序列中包含的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈(J.Sambrook等，1989,見上文)。[0132]所述催化域可由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:1的催化域編碼序列具有至少90%，例如至少92%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性程度，其編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽。[0133]在一個方面，所述編碼催化域的多核苷酸包含或組成為SEQIDNO:1的核苷酸55至1507，或其cDNA序列。具體而言，所述編碼催化域的多核苷酸包含或組成為SEQIDNO:1的核苷酸55至603,668至1235，1311至1507。[0134]在另一個實施方案中，所述催化域可由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在非常低嚴格條件，低嚴格條件，中等嚴格條件，中等-高嚴格條件，高嚴格條件或非常高嚴格條件下(如上文定義)，與以下雜交:(i)SEQIDNO:3的催化域編碼序列，(ii)SEQIDNO:3的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈(J.Sambrook等，1989,見上文)。[0135]所述催化域可由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDN0:3的催化域編碼序列具有至少80%，例如至少85%，至少87%，至少90%，至少92%，至少95%，例如至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性程度，其編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽。[0136]在一個方面，所述編碼催化域的多核苷酸包含或組成為SEQIDNO:3的核苷酸76至1395，或其cDNA序列。[0137]多核苷酸[0138]本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸。[0139]用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術是本領域內(nèi)已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合。可通過例如使用熟知的聚合酶鏈式反應(PCR)或表達文庫的抗體篩選來檢測具有共有結(jié)構(gòu)特性的克隆DNA片段，從而實現(xiàn)從這種基因組DNA克隆多核苷酸。參見，例如，Innis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork?？梢允褂闷渌怂釘U增方法,如連接酶鏈式反應(LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(ligatedactivatedtranscription；LAT)和基于多核苷酸的擴增(NASBA)?？梢詮那嗝箤?Penicillium)菌株,或相關生物體克隆所述多核苷酸，并且因此可為例如所述多核苷酸的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或種變體(speciesvariant)。[0140]本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其包含或組成為下述多核苷酸，所述多核苷酸與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少90%，例如至少92%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性程度，其編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽。[0141]本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其包含或組成為下述多核苷酸，所述多核苷酸與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列或其基因組DNA序列具有至少80%，例如至少85%，至少87%,至少90%，至少92%，至少95%，例如至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性程度，其編碼具有纖`維二糖水解酶活性的多肽。[0142]修飾編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸對于合成與所述多肽基本上相似的多肽可為必需的。術語與所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于從其天然來源分離的多肽，例如，比活性、熱穩(wěn)定性、最適PH等方面不同的變體?？梢栽谧鳛镾EQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列呈現(xiàn)的多核苷酸，例如其亞序列的基礎上，和/或通過引入如下核苷酸取代來構(gòu)建變體:所述取代不導致多肽氨基酸序列的改變，但是符合意欲產(chǎn)生酶的宿主生物體的密碼子使用；或者所述取代可產(chǎn)生不同的氨基酸序列。關于核苷酸取代的概述，參見，例如，F(xiàn)ord等，1991，ProteinExpressionandPurification2:95-107。[0143]本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸在非常低嚴格條件、低嚴格條件、中等嚴格條件、中等-高嚴格條件、高嚴格條件或非常高嚴格條件下，與以下雜交:(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈；或它們的等位變體和亞序列(Sambrook等，1989，見上文)，如本文所定義的。[0144]在一個方面，所述多核苷酸包含或組成為SEQIDNO:1,SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，或編碼SEQIDNO:2的具有纖維二糖水解酶活性的片段的SEQIDNO:1的亞序列，如SEQIDNO:1的核苷酸55至1507的多核苷酸，以及它們的cDNA序列。[0145]在另一個方面，所述多核苷酸包含或組成為SEQIDNO:1的催化域編碼序列，如SEQIDNO:1的核苷酸55至603，668至1235,1311至1507。[0146]本發(fā)明亦涉及編碼本發(fā)明的多肽的分離的多核苷酸，所述多核苷酸在非常低嚴格條件、低嚴格條件、中等嚴格條件、中等-高嚴格條件、高嚴格條件或非常高嚴格條件下，與以下雜交:(i)SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈；或它們的等位變體和亞序列(Sambrook等，1989，見上文)，如本文所定義的。[0147]在一個方面，所述多核苷酸包含或組成為SEQIDNO:3，SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列，或編碼SEQIDNO:4的具有纖維二糖水解酶活性的片段的SEQIDN0:3的亞序列，如SEQIDNO:3的核苷酸76至1614的多核苷酸，以及它們的基因組DNA序列。[0148]在另一個方面，所述多核苷酸包含或組成為SEQIDN0:3的催化域編碼序列，如SEQIDNO:3的核苷酸76至1395的多核苷酸，以及它們的基因組DNA序列。[0149]核酸構(gòu)建體[0150]本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述多核苷酸與一個或多個(幾個)調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列在合適的宿主細胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下指導編碼序列的表達。[0151]可以用許多方式操作所述多核苷酸以提供多肽的表達。依賴于表達載體，在將多核苷酸插入載體之前對其進行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸的技術是本領域熟知的。[0152]調(diào)控序列可為啟動子序列，其是由用于表達編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的宿主細胞所識別的多核苷酸。啟動子序列含有介導多肽的表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動子可以是在所選的宿主細胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，并且可以從編碼與宿主細胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。[0153]用于在細菌宿主細胞中指導本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從下述獲得的啟動子:解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)a-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)a-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因、大腸桿菌Iac操縱子、天藍鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)瓊脂糖酶基因(dagA)和原核(6-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731),以及tac啟動子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA80:21-25)。另外的啟動子在〃Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"于Gilbert等,1980,ScientificAmerican,242:74-94中；和在Sambrook等，1989，見上文中描述。[0154]用于指導本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從下列酶的基因獲得的啟動子:構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)乙酰胺酶、黑曲霉(Aspergillusniger)中性a-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性a-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillusawamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉(Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、尖鐮孢(Fusariumoxysporum)胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、鑲片鐮孢(Fusariumvenenatum)淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、鑲片鐮抱Daria(W000/56900)、壤片鍵抱Quinn(W000/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉(Trichodermareesei)0-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶1、里氏木霉纖維二糖水解酶I1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶1、里氏木霉木聚糖酶I1、里氏木霉(6-木糖苷酶，以及NA2_tpi啟動子(一種修飾的啟動子，其來自在曲霉屬中編碼中性a-淀粉酶的基因，其中未翻譯的前導序列由在曲霉屬(Aspergilli)中編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的未翻譯的前導序列所替代；非限制性實例包括修飾的啟動子，其來自在黑曲霉中編碼中性a-淀粉酶的基因，其中未翻譯的前導序列由在構(gòu)巢曲霉或米曲霉中編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的未翻譯的前導序列所替代)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動子。[0155]在酵母宿主中，有用的啟動子從如下酶的基因獲得:釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對于酵母宿主細胞其它有用的啟動子由Romanos等，1992，Yeast8:423-488描述。[0156]調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，其由宿主細胞識別以終止轉(zhuǎn)錄。所述終止子序列與編碼所述多肽的多核苷酸的3’末端可操作地連接?？梢詫⒃谒x宿主細胞中有功能的任何終止子用在本發(fā)明中。[0157]對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得:構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉a-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。[0158]對于酵母宿主細胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得:釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對于酵母宿主細胞其它有用的終止子由Romanos等，1992，見上文描述。[0159]調(diào)控序列還可以是合適的前導序列，當被轉(zhuǎn)錄時其為對于宿主細胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導序列可操作地連接于編碼多肽的多核苷酸的5’-末端?？墒褂迷谒x宿主細胞中有功能的任何前導序列。[0160]對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的前導序列從如下酶的基因獲得:米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。[0161]對于酵母宿主細胞合適的前導序列從如下酶的基因獲得:釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母a因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。[0162]調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與多核苷酸的3’末端可操作地連接的序列，并且在轉(zhuǎn)錄時，宿主細胞將其識別為將聚腺苷殘基添加至轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號?？墒褂迷谒x宿主細胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。[0163]對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得:米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉a-葡糖苷酶。[0164]對于酵母宿主細胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.15:5983-5990描述。[0165]調(diào)控序列還可以是信號肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的N端相連的信號肽，并且指導所述多肽進入細胞分泌途徑。多核苷酸的編碼序列5’端可固有地包含信號肽編碼序列，其與編碼所述多肽的編碼序列的區(qū)段一起天然地連接在翻譯閱讀框中?？晒┻x擇的是，編碼序列5’端可含有對于所述編碼序列異源的信號肽編碼序列。異源信號肽編碼序列在編碼序列不天然地含有信號肽編碼序列時可為必需的?；蛘?，外源信號肽編碼序列可以簡單地取代天然信號肽編碼序列以增強多肽的分泌。然而，可使用指導表達的多肽進入所選宿主細胞的分泌途徑的任何信號肽編碼序列。[0166]對于細菌宿主細胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列:芽孢桿菌屬NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌(6-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT,nprS,nprM)和枯草芽孢桿菌prsA。另外的信號肽由Simonen和Palva,1993,MicrobiologicalReviews57:109-137描述。[0167]對于絲狀真菌宿主細胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列:黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V、疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。[0168]對于酵母宿主細胞有用的信號肽從釀酒酵母a因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得。其它有用的信號肽編碼序列由Romanos等，1992，見上文描述。[0169]調(diào)控序列還可以是前肽編碼序列，其編碼位于多肽N端的前肽。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無活性的，并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉(zhuǎn)化為活性多肽?？梢詮目莶菅挎邨U菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、嗜熱毀絲霉漆酶(W095/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和釀酒酵母a因子的基因獲得前肽編碼序列。[0170]當信號肽和前肽序列二者均出現(xiàn)在多肽的N端時，將前肽序列置于緊接著(nextto)多肽N端，并且將信號肽序列置于緊接著前肽序列的N端。[0171]同樣理想的是添加調(diào)節(jié)序列，其允許相對于宿主細胞的生長來調(diào)節(jié)多肽的表達。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實例是引起基因表達響應化學或物理刺激物，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而開啟或關閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子、米曲霉TAKAa-淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子。調(diào)節(jié)序列的其它實例是那些允許基因擴增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)節(jié)序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的多核苷酸將與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。[0172]表達載體[0173]本發(fā)明還涉及重組表達載體，所述重組表達載體包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。多種核苷酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達載體，所述表達載體可以包括一個或多個(幾個)方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代編碼多肽的多核苷酸。可供選擇的是，可以通過在適當?shù)挠糜诒磉_的載體中插入包含所述序列的多核苷酸或核酸構(gòu)建體來表達所述多核苷酸。在制備表達載體的過程中，將編碼序列置于載體中，從而將該編碼序列與適當?shù)谋磉_調(diào)控序列可操作地連接。[0174]重組表達載體可以是任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?，其能夠方便地進行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生多核苷酸的表達。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。[0175]載體可以是自主復制載體，即，作為染色體外實體(entity)存在的載體，其復制獨立于染色體復制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復制的手段(means)?；蛘?，載體可以是一種當被引入宿主細胞中時，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復制的載體。此外,可以使用單獨的載體或質(zhì)粒或兩個或更多個載體或質(zhì)粒，其共同含有待引入宿主細胞基因組的完整DNA(totalDNA),或可以使用轉(zhuǎn)座子(transposon)。[0176]所述載體優(yōu)選地含有一個或多個(幾個)選擇性標記，其允許簡單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導等的細胞。選擇性標記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。[0177]細菌選擇性標記的實例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性的標記，所述抗生素抗性例如氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素或四環(huán)素抗性。對于酵母宿主細胞合適的標記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRPI和URA3。用于絲狀真菌宿主細胞的選擇性標記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷_5’_憐酸脫羧酶)(orotidine_5’-phosphatedecarboxylase)>sC(硫酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等同物。優(yōu)選用在曲霉屬細胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。[0178]所述載體優(yōu)選含有元件，其允許載體整合入宿主細胞基因組或載體在細胞中獨立于基因組的自主復制。[0179]為了整合入宿主細`胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件?；蛘?，載體可以含有額外的多核苷酸，用于指導通過同源重組整合入宿主細胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應含有足夠數(shù)量的核酸，如100至10，000堿基對，400至10，000堿基對，和800至10，000堿基對，其與相應的目標序列具有高度序列同一性以增強同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細胞基因組中的目標序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的多核苷酸。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細胞的基因組中。[0180]為了自主復制，載體可以進一步包含復制起點，其使載體能夠在所述的宿主細胞中自主地復制。復制起點可以是介導自主復制的任何質(zhì)粒復制子(replicator),其在細胞中發(fā)揮功能。術語“復制起點”或“質(zhì)粒復制子”意指能夠使質(zhì)?；蜉d體體內(nèi)復制的多核苷酸。[0181]細菌復制起點的實例是允許在大腸桿菌中復制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復制起點，和允許在芽孢桿菌屬中復制的質(zhì)粒pUBllO、pE194、pTA1060和PAM^I的復制起點。[0182]用于酵母宿主細胞中的復制起點的實例是2微米復制起點，ARS1,ARS4,ARSl和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。[0183]在絲狀真菌細胞中有用的復制起點的實例是AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsRes.15:9163-9175;W000/24883)。分離AMAl基因和構(gòu)建包含該基因的質(zhì)粒或載體能夠根據(jù)公開于W000/24883中的方法完成。[0184]可以將多于一個拷貝的本發(fā)明的多核苷酸插入宿主細胞以增加多肽的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過如下方法獲得:將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組，或?qū)⒖蓴U增的選擇性標記基因包括于多核苷酸，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細胞來選擇含有選擇性標記基因的擴增拷貝，且由此含有多核苷酸的額外拷貝的細胞。[0185]用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達載體的方法是本領域技術人員熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。[0186]宿主細胞[0187]本發(fā)明還涉及重組宿主細胞，其包含本發(fā)明的多核苷酸可操作地連接于一個或多個(幾個)指導本發(fā)明多肽的產(chǎn)生的調(diào)控序列。將包含多核苷酸的構(gòu)建體或載體導入宿主細胞，使所述構(gòu)建體或載體如前所述作為染色體整合體或者作為自復制的染色體外載體維持。術語“宿主細胞”包括親本細胞的任何后代，其由于復制過程中發(fā)生的突變而不同于親本細胞。宿主細胞的選擇將在很大程度上依賴于編碼多肽的基因及其來源。[0188]宿主細胞可以是在本發(fā)明的多肽的重組產(chǎn)生中有用的任何細胞，例如，原核或真核細胞。[0189]原核宿主細胞可以是任何革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌。革蘭氏陽性細菌包括但不限于，芽抱桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)、腸球菌屬(Enterococcus)、地芽抱桿菌屬(Geobacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、海洋芽抱桿菌屬(Oceanobacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)和鏈霉菌屬(Streptomyces)。革蘭氏陰性細菌包括但不限于,彎曲桿菌屬(Campylobacter)、大腸桿菌(E.coli)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、螺桿菌屬(Helicobacter)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)和服原體屬(Ureaplasma)。[0190]細菌宿主細胞可以是任何芽孢桿菌屬細胞，包括但不限于嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)、凝結(jié)芽抱桿菌(Bacilluscoagulans)、堅強芽抱桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽抱桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽抱桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽抱桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽抱桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽抱桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)和蘇云金芽抱桿菌(Bacillusthuringiensis)細胞。[0191]細菌宿主細胞還可以是任何鏈球菌屬細胞，包括但不限于似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、釀胺鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)和馬鏈球菌獸痕亞種(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)細胞。[0192]細菌宿主細胞還可以是任何鏈霉菌屬細胞，包括但不限于不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesachromogenes)、除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)、天藍鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)和淺青紫鏈霉菌(StreptomycesIividans)細胞。[0193]可通過如下方法實現(xiàn)將DNA引入到芽孢桿菌屬細胞:例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Chang和Cohenj1979，Mol.Gen.Genet.168:111-115)，使用感受態(tài)細胞(參見，例如，Young和Spizizenj1961，J.Bacteriol.81:823-829或Dubnau和Davidoff-AbeIson，1971，J.Mol.Biol.56:209-221)，電穿孔(參見，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)或接合(參見，例如，Koehler和Thorne,1987，J.Bacteriol.169:5771-5278)?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到大腸桿菌細胞:例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Hanahanj1983，J.Mol.Biol.166:557-580)或電穿孔(參見，例如，Dower等，1988，NucleicAcidsRes.16:6127-6145)?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到鏈霉菌屬細胞:例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔(參見，例如，Gong等，2004，F(xiàn)oliaMicrobiol.(Praha)49:399-405)，接合(參見，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171:3583-3585)，或轉(zhuǎn)導(參見，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA98:6289-6294)?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到假單胞菌屬細胞:例如電穿孔(參見，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64:391_397)或接合(參見，例如，Pinedo和Smetsj2005，Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到鏈球菌屬細胞:例如天然感受態(tài)(naturalcompetence)(參見，例如，Perry和Kuramitsuj1981，Infect.1mmun.32:1295-1297)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Catt和Jollickj1991，Microbios.68:189-207)，電穿孔(參見，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(參見，例如，Clewellj1981，Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可以使用本領域已知的將DNA引入宿主細胞的任何方法。[0194]宿主細胞還可以是真核生物，如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞。[0195]宿主細胞可為真菌細胞?！罢婢庇迷诒疚陌ㄒ韵麻T:子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和接合菌門(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于AinsworthandBisby’sDictionaryofTheFungi,第8片反，1995，CABInternational,UniversityPress，Cambridge，UK中所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，見上，171頁中所引用)，和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等，1995，見上文)。[0196]真菌宿主細胞可為酵母細胞。“酵母”用在本文包括產(chǎn)子囊酵母(ascospOTogenousyeast)(內(nèi)抱霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔子酵母(basidiosporogenousyeast)和屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽孢綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來可能改變，就本發(fā)明而言，將酵母定義為如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.，Passmore,S.M.，和Davenport，R.R.編，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesN0.9，1980)中所述。[0197]酵母宿主細胞可假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉屬(Yarrowia)細胞，如乳酸克魯維酵母(KluyveromycesIactis)、卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)、卵形酵母(Saccharomycesoviformis)或解脂西洋蓍霉(YarrowiaIipolytica)細胞。[0198]真菌宿主細胞可為絲狀真菌細胞?！敖z狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth等，1995，見上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復雜多糖構(gòu)成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進行營養(yǎng)生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養(yǎng)生長通過單細胞菌體的出芽生殖(budding)進行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。[0199]絲狀真菌宿主細胞可為枝頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬錯菌屬(Ceriporiopsis)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬(Cryptococcus)、Filibasidium、德抱屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、梨抱菌屬(Magnaporthe)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂糟菌屬(Schizophyllum)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、栓菌屬(Trametes)或木霉屬(Trichoderma)細胞。[0200]例如，絲狀真菌宿主細胞可為泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、黑剌煙管菌(Bjerkanderaadusta)、干擬錯菌(Ceriporiopsisaneirina)、Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、蟲擬錯菌(Ceriporiopsissubvermispora)、Chrysosporiuminops、嗜角質(zhì)金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、ChrysosporiumIucknowense^Chrysosporiummerdarium、租金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporiumqueenslandicum^熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiumzonatum、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、桿抱狀德抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、庫威德抱(Fusariumcrookwellense)、大刀德抱(FusariumcuImorum)、禾本科德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圓德抱(Fusariumtorulosum)、擬絲抱鍵抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片鍵抱(Fusariumvenenatum)、特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)、疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicolalanuginosa)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)、粗糖脈抱菌(Neurosporacrassa)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黃抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、福射射脈菌(Phlebiaradiata)、刺芳:側(cè)耳(Pleurotuseryngii)、土生梭抱霉(Thielaviaterrestris)、長絨毛栓菌(Trametesvillosa)、變色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、長枝木霉(Trichoderma1ngibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或綠色木霉(Trichodermaviride)細胞。[0201]可以將真菌細胞通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細胞壁再生的方法以本身公知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細胞的合適方法在EP238023，Yelton等,1984,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:1470-1474,和Christensen等,1988,Bio/Technology6:1419-1422中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989，Gene78:147-156和W096/00787描述?？梢允褂糜扇缦挛墨I描述的方法轉(zhuǎn)化酵母:Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.1.編，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volumel94,ppl82-187,AcademicPress,Inc.,NewYork；Ito等，1983，J.Bacteriol.153:163；和Hinnen等，1978，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA75:1920。[0202]產(chǎn)生方法[0203]本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括:(a)在有助于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)細胞，所述細胞以其野生型形式產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一個優(yōu)選的方面，所述細胞是踝節(jié)菌屬的細胞。在一個更優(yōu)選的方面，所述細胞是Talaromycesbyssochlamydoides。在一個最優(yōu)選的方面，所述細胞是Talaromycesbyssochlamydoides菌株CBS413.71。[0204]本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，其包括:(a)在有助于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組宿主細胞；和(b)回收所述多肽。[0205]使用本領域熟知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養(yǎng)，和實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細胞。使用本領域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應商獲得或可以根據(jù)公開的組成制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌，則其能夠從細胞裂解物(lysate)回收。[0206]可以使用本領域已知的對于所述多肽是特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，酶試驗(enzymeassay)可用于測定多肽的活性。[0207]多肽可以使用本領域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。[0208]多肽可以通過多種本領域已知的方法純化以獲得基本上純的多肽，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(參見，例如，ProteinPurification,J._C.Janson和LarsRyden編，VCHPublishers,NewYork,1989)。[0209]在一個可選的方面，不回收多肽，而將表達所述多肽的本發(fā)明宿主細胞作為多肽的來源。[0210]植物[0211]本發(fā)明還涉及分離的植物，例如，轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細胞，其包含本發(fā)明的分離的多核苷酸，從而以可回收的量表達和產(chǎn)生所述多肽。多肽可從植物或植物部分回收?；蛘?，同樣可以將含有所述多肽的植物或植物部分用于改進食品或飼料的質(zhì)量，例如，改進營養(yǎng)價值、適口性(palatability)和流變性質(zhì)(rheologicalproperties),或用于破壞抗營養(yǎng)因子。[0212]轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實例是草(grasses),如草地早熟禾(meadowgrass)(藍草(bluegrass)，早熟禾屬(Poa));飼用牧草(foragegrass)如羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium);寒地型牧草(temperategrass),如Agrostis(翦股穎屬)；和谷類,例如，小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。[0213]雙子葉植物的實例是煙草(tobacco),豆類(legumes),如羽扇豆(lupins),馬鈴薯，糖甜菜(sugarbeet),豌豆,豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(familyBrassicaceae)),如花椰菜(cauliflower),油菜桿(rapeseed)和緊密相關的模型生物體擬南芥(Arabidopsisthaliana)。`[0214]植物部分的實例是莖(stem)、愈傷組織(callus)、葉(leaf)、根(root)、果實(fruit)、種子(seed)和塊莖(tuber),以及包含這些部分的獨立組織，例如，表皮(epidermis)、葉肉(mesophyll)、薄壁組織(parenchyme)、維管組織(vasculartissue)、分生組織(meristem)。具體的植物細胞區(qū)室(compartments),如葉綠體(chloroplast)、質(zhì)外體(apoplast)、線粒體(mitochondria)、液泡(vacuole)、過氧化物酶體(peroxisome)和細胞質(zhì)(cytoplasm)也被認為是植物部分。此外，任何植物細胞，無論什么組織來源，都被認為是植物部分。同樣地，植物部分，如分離以促進本發(fā)明的應用的具體組織和細胞也被認為是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和種皮(seedcoat)。[0215]同樣包含于本發(fā)明范圍內(nèi)的還有這些植物、植物部分和植物細胞的后代。[0216]表達多肽的轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞可以依照本領域已知方法構(gòu)建。簡而言之，通過如下方法構(gòu)建所述植物或植物細胞:將編碼多肽的一個或多個(幾個)表達構(gòu)建體并入植物宿主基因組或葉綠體基因組，并且將所得的經(jīng)修飾的植物或植物細胞繁殖為轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞。[0217]表達構(gòu)建體便利地是包含編碼多肽的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述多核苷酸與在選擇的植物或植物部分中表達該多核苷酸所需的適當?shù)恼{(diào)節(jié)序列可操作地連接。此外，表達構(gòu)建體可以包含對于鑒定宿主細胞有用的選擇性標記，在所述宿主細胞中整合了表達構(gòu)建體和將該構(gòu)建體引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依賴于使用的DNA引入方法)。[0218]調(diào)節(jié)序列的選擇，例如啟動子和終止子序列和任選地信號或轉(zhuǎn)運序列的選擇，舉例來說，基于期望何時、何處以及如何表達多肽而確定。例如，編碼多肽的基因的表達可以是組成型的或誘導型的，或可以是發(fā)育、階段或組織特異性的，并且基因產(chǎn)物可以革巴向特定的組織或植物部分例如種子或葉。調(diào)節(jié)序列由例如Tague等，1988，PlantPhysiology86:506所述。[0219]對于組成性表達，可以使用35S_CaMV、玉米泛素I和稻肌動蛋白I啟動子(Franck等，1980，Cell21:285-294，Christensen等，1992，PlantM0.Biol.18:675-689；Zhang等，1991，PlantCell3:1155-1165)。器官特異性啟動子可以是例如來自貯藏庫組織(storagesinktissue)例如種子、馬鈴薯塊莖和果實的啟動子(Edwards和Coruzzi,1990,Ann.Rev.Genet.24:275-303),或來自代謝庫組織(metabolicsinktissue)例如分生組織的啟動子(Ito等，1994，PlantMol.Biol.24:863-878),種子特異性啟動子諸如來自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)啟動子(Wu等，1998，PlantCellPhysiol.39:885-889),來自豆球蛋白(Iegumin)B4和蠶豆(Viciafaba)的未知的種子蛋白基因的蠶豆啟動子(Conrad等，1998，J.0fPlantPhysiol.152:708-711)、來自種子油體蛋白(oilbodyprotein)的啟動子(Chen等，1998，PlantCellPhysiol.39:935-941),來自歐洲油菜(Brassicanapus)的忙藏蛋白napA啟動子，或本【
技術領域：
】公知的任何其他種子特異性的啟動子，例如，在W091/14772中所描述的。此外，啟動子可為葉特異性的啟動子，如來自稻或番爺?shù)膔bcs啟動子(Kyozuka等,1993,PlantPhysiologyl02:991-1000)，小球藻病毒(chlorellavirus)腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(adeninemethyItransferase)基因啟動子(Mitra和Higgins,1994，PlantMol.Biol.26:85-93)，來自稻的aldP基因啟動子(Kagaya等，1995,Mol.Gen.genet.248:668-674)，或傷口誘導的啟動子，如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等，1993，PlantMol.Biol.22:573-588)。同樣地，所述啟動子可通過非生物的處理誘導，所述非生物的處理諸如溫度、干旱或鹽度變化，或通過外源施加的激活所述啟動子的物質(zhì)誘導，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(planthormones)如乙烯、脫落酸(abscisicacid)和赤霉酸(gibberellicacid),和重金屬。[0220]啟動子增強子元件也可以用于實現(xiàn)多肽在植物中的較高表達。例如，啟動子增強子元件可以是內(nèi)含子，其置于啟動子和編碼多肽的多核苷酸之間。例如Xu等，1993，見上，公開了使用稻肌動蛋白I基因的第一內(nèi)含子以增強表達。[0221]選擇性標記基因和表達構(gòu)建體的任何其它部分可以選自本領域內(nèi)可用的那些。[0222]將核酸構(gòu)建體根據(jù)本領域已知的常規(guī)技術并入植物基因組，所述常規(guī)技術包括土壤桿菌屬(Agrobacterium)介導的轉(zhuǎn)化、病毒介導的轉(zhuǎn)化、顯微注射(microinjection)、粒子轟擊、生物射彈轉(zhuǎn)化和電穿孔(Gasser等，1990，Science244:1293；Potrykus,1990,Bio/Technology8:535；Shimamoto等,1989,Nature338:274)。[0223]根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導的基因轉(zhuǎn)移(genetransfer)是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的方法(為了參考，見Hooykas和Schilperoort,1992，PlantMol.Biol.19:15-38)，而且它也可以用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，雖然對于這些植物其他的轉(zhuǎn)化方法是常用的。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的方法，是用粒子(用轉(zhuǎn)化DNA涂覆的微觀的金或鶴粒子)轟擊胚愈傷組織(embryoniccalli)或發(fā)育中的胚(developingembryos)(Christou,1992，PlantJ.2:275-281;Shimamoto,1994,CurrentOpin.Biotech.5:158-162；Vasil等，1992，Bio/TechnologylO:667-674)。轉(zhuǎn)化單子葉植物的可供選擇的方法是基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，如由Omirulleh等，1993，PlantMol.Biol.21:415-428所描述的。其他用于依照本公開使用的轉(zhuǎn)化方法包括那些描述于美國專利6，395，966和7，151，204的那些(兩者均通過提述全文并入本文)。[0224]轉(zhuǎn)化之后，根據(jù)本領域熟知的方法選擇具有并入的表達構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體并且再生成為完整植物。通常設計轉(zhuǎn)化方法用于通過如下方法在再生期間或在后續(xù)世代中選擇性消除選擇基因:例如，使用帶有兩個獨立的T-DNA構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)化或通過特異性重組酶位點特異性地切除選擇基因。[0225]除了用根據(jù)本發(fā)明制備的構(gòu)建體直接轉(zhuǎn)化具體植物基因型之外，還可通過將具有所述構(gòu)建體的植物與缺乏該構(gòu)建體的第二植物雜交來制備轉(zhuǎn)基因植物。舉例而言，可將編碼多肽的構(gòu)建體通過雜交而引入特定植物品種，而根本無需直接轉(zhuǎn)化該給定品種的植物。因此，本發(fā)明不僅涵蓋從依照本發(fā)明經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞直接再生的植物，還包括此類植物的后代(progeny)。如用于本文，后代可指依照本發(fā)明制備的親本植物任何世代的后裔(offspring)。此種后代可包含依據(jù)本發(fā)明制備的DNA構(gòu)建體,或依據(jù)本發(fā)明制備的DNA構(gòu)建體的一部分。雜交導致轉(zhuǎn)基因通過將起始種系與供體植物種系交叉授粉而引入植物種系。此類步驟的非限制性實例進一步闡述于美國專利7，151，204號。[0226]植物可通過回交轉(zhuǎn)化方法生成。舉例而言，植物包括稱作回交轉(zhuǎn)化的基因型、種系、近交體(inbred)或雜交體(hybrid)的植物。[0227]可使用遺傳標記以協(xié)助本發(fā)明的一種或多種轉(zhuǎn)基因從一個遺傳背景基因滲入(introgression)至另一個。標記協(xié)助的選擇提供了相對于常規(guī)育種的優(yōu)勢，在于其可用于避免由表型變異導致的錯誤。進一步，遺傳標記可在特定雜交的個體后代中提供有關良種種質(zhì)相對程度的數(shù)據(jù)。舉例而言，當具有所需性狀但除此之外(otherwise)具有非農(nóng)藝學所需的遺傳背景的植物與良種親本雜交時，可使用遺傳標記來選擇不僅具有該目標性狀，還具有相對較大比例所需種質(zhì)的后代。以此方式，使一種或多種性狀基因滲入特定遺傳背景所需的世代數(shù)得到最小化。[0228]本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，包括:(a)在有助于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)包含編碼所述多肽的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞；和(b)回收所述多肽。[0229]組合物[0230]本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明多肽的酶組合物。優(yōu)選地，所述組合物富集此種多肽。術語“富集”表明組合物的纖維二糖水解酶活性，例如，以至少1.1的富集因數(shù)(enrichmentfactor)增加。[0231]所述組合物可以包含本發(fā)明的多肽作為主要酶成分，例如，單成分組合物。或者，所述組合物可以包含多種酶活性，如一種或多種(幾種)選自下組的酶:纖維素酶、半纖維素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過氧化物酶、蛋白酶和膨脹素。[0232]在一個優(yōu)選實施方案中，所述酶組合物包含至少本發(fā)明的纖維二糖水解酶，至少一種內(nèi)切葡聚糖酶，至少一種3-葡糖苷酶，和至少一種具有纖維素分解增強活性的GH61多肽。[0233]可以依照本領域內(nèi)已知的方法制備多肽組合物，并且可以是液體或干組合物的形式。例如，所述多肽組合物可以是顆粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式?？梢砸勒毡绢I域內(nèi)已知方法使包含于所述組合物中的多肽穩(wěn)定化。[0234]酶組合物可包含任何可用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的蛋白。[0235]在一個方面，所述酶組合物包含或進一步包含一種或多種(幾種)選自下組的蛋白:纖維素酶、具有纖維素分解增強活性的GH61多肽，半纖維素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過氧化物酶、蛋白酶和膨脹素。在另一個方面，所述纖維素酶優(yōu)選為一種或多種(幾種)選自下組的酶:內(nèi)切葡聚糖酶、其它纖維二糖水解酶和(6-葡糖苷酶。在另一個方面，所述半纖維素酶優(yōu)選為一種或多種(幾種)選自下組的酶:乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。[0236]在另一個方面，所述酶組合物包含一種或多種(幾種)纖維素分解酶。在另一個方面，所述酶組合物包含或進一步包含一種或多種(幾種)半纖維素分解酶。在另一個方面，所述酶組合物包含一種或多種(幾種)纖維素分解酶和一種或多種(幾種)半纖維素分解酶。在另一個方面，所述酶組合物包含一種或多種(幾種)選自下組的酶:纖維素分解酶和半纖維素分解酶。在另一個方面，所述酶組合物包含內(nèi)切葡聚糖酶。在另一個方面，所述酶組合物包含纖維二糖水解酶。在另一個方面，所述酶組合物包含3-葡糖苷酶。在另一個方面，所述酶組合物包含具有纖維素分解增強活性的GH61多肽。在另一個方面，所述酶組合物包含內(nèi)切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶。在另一個方面，所述酶組合物包含內(nèi)切葡聚糖酶和3-葡糖苷酶。在另一個方面，所述酶組合物包含纖維二糖水解酶和(6-葡糖苷酶。在另一個方面，所述酶組合物包含內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和3-葡糖苷酶。在另一個方面，所述酶組合物包含內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、3-葡糖苷酶和具有纖維素分解增強活性的GH61多肽。在另一個方面，所述酶組合物包含乙酰甘露聚糖酯酶。在另一個方面，所述酶組合物包含乙酰木聚糖酯酶。在另一個方面，所述酶組合物包含阿拉伯聚糖酶(例如a-L-阿拉伯聚糖酶)。在另一個方面，所述酶組合物包含阿拉伯呋喃糖苷酶(例如a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)。在另一個方面，所述酶組合物包含香豆酸酯酶。在另一個方面，所述酶組合物包含阿魏酸酯酶。在另一個方面，所述酶組合物包含半乳糖苷酶(例如a-半乳糖苷酶和/或3-半乳糖苷酶)。在另一個方面，所述酶組合物包含葡糖醛酸糖苷酶(例如a-D-葡糖醛酸糖苷酶)。在另一個方面，所述酶組合物包含葡糖醛酸酯酶。在另一個方面，所述酶組合物包含甘露聚糖酶。在另一個方面，所述酶組合物包含甘露糖苷酶(例如(6-甘露糖苷酶)。在另一個方面，所述酶組合物包含木聚糖酶。在一個優(yōu)選的方面，所述木聚糖酶是家族10木聚糖酶。在另一個方面，所述酶組合物包含木糖苷酶(例如(6-木糖苷酶)。另一個方面，所述酶組合物包含棒曲霉素。在另一個方面，所述酶組合物包含酯酶。在另一個方面，所述酶組合物包含漆酶。在另一個方面，所述酶組合物包含木質(zhì)素分解酶。在一個優(yōu)選的方面，所述木質(zhì)素分解酶是錳過氧化物酶。在另一個優(yōu)選的方面，所述木質(zhì)素分解酶是木質(zhì)素過氧化物酶。在另一個優(yōu)選的方面，所述木質(zhì)素分解酶是產(chǎn)生H202的酶。在另一個方面，所述酶組合物包含果膠酶。在另一個方面,所述酶組合物包含過氧化物酶。在另一個方面，所述酶組合物包含蛋白酶。在另一個方面，所述酶組合物包含膨脹素。[0237]在本發(fā)明的方法中，酶可在發(fā)酵之前或過程中添加，例如在糖化過程中，或在發(fā)酵生物繁殖過程中或之后添加。[0238]所述酶組合物的一種或多種(幾種)組分可為野生型蛋白、重組蛋白或野生型蛋白和重組蛋白的組合。舉例而言，一種或多種(幾種)組分可為細胞的天然蛋白，其用作宿主細胞以重組表達酶組合物的一種或多種(幾種)其他組分。酶組合物的一種或多種(幾種)組分可作為單組分產(chǎn)生，然后將其組合以形成酶組合物。所述酶組合物可為多組分和單組分蛋白制備物的組合。[0239]用于本發(fā)明方法中的酶可為任何適于使用的形式，如例如去除或不去除細胞的發(fā)酵原液，含或不含細胞碎片的細胞裂解液，半純化或純化的酶制備物，或宿主細胞，作為酶的來源。所述酶組合物可為干粉或顆粒，無粉塵的顆粒，液體，穩(wěn)定化液體或穩(wěn)定化受保護的酶。液體酶制備物可根據(jù)確立的工藝，例如通過添加穩(wěn)定劑如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有機酸來穩(wěn)定化。[0240]具有纖維二糖水解酶活性的酶和多肽的最適量取決于幾個因素，其包括但不限于，組分纖維素分解酶的混合物、纖維素材料、纖維素材料的濃度、纖維素材料的預處理、溫度、時間、pH和包括發(fā)酵生物體(例如，同步糖化和發(fā)酵的酵母)。[0241]在一個優(yōu)選的方面，纖維素分解酶對于纖維素材料的有效量是約0.5至約50mg，優(yōu)選約0.5至約40mg,更優(yōu)選約0.5至約25mg,更優(yōu)選約0.75至約20mg,更優(yōu)選約0.75至約15mg,甚至更優(yōu)選約0.5至約IOmg,并且最優(yōu)選約2.5至約IOmg每g纖維素材料。[0242]在另一個優(yōu)選的方面，具有纖維二糖水解酶活性的多肽對于纖維素材料的有效量是約0.01至約50.0mg,優(yōu)選約0.01至約40mg,更優(yōu)選約0.01至約30mg,更優(yōu)選約0.01至約20mg,更優(yōu)選約0.01至約IOmg,更優(yōu)選約0.01至約5mg,更優(yōu)選約0.025至約1.5mg,更優(yōu)選約0.05至約1.25mg,更優(yōu)選約0.075至約1.25mg,更優(yōu)選約0.1至約1.25mg,甚至更優(yōu)選約0.15至約1.25mg,并且最優(yōu)選約0.25至約1.0mg每g纖維素材料。[0243]在另一個優(yōu)選的方`面，具有纖維二糖水解酶活性的多肽對于纖維素分解酶的有效量是約0.005至約1.0g,優(yōu)選約0.01至約1.0g,更優(yōu)選約0.15至約0.75g，更優(yōu)選約0.15至約0.5g,更優(yōu)選約0.1至約0.5g,甚至更優(yōu)選約0.1至約0.5g,并且最優(yōu)選約0.05至約0.2g每g纖維素分解酶。[0244]具有纖維素分解酶活性或半纖維素分解酶活性的多肽，以及其它可用于纖維素材料的降解的蛋白/多肽，例如具有纖維素分解增強活性的多肽(在本文中稱為具有酶活性的多肽)可源自或獲得自任何合適的來源，包括細菌、真菌、酵母、植物或哺乳動物來源。術語“獲得的”在本文中意指所述酶可從將該酶作為天然酶天然產(chǎn)生的生物體分離。術語“獲得的”在本文中還意指該酶可在宿主生物中使用本文中所述的方法重組產(chǎn)生，其中經(jīng)重組產(chǎn)生的酶對于宿主生物是天然的或異源的，或具有修飾的氨基酸序列，例如，具有一個或多個(幾個)缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重組產(chǎn)生的酶，其為天然氨基酸序列的片段和/或突變體或通過本領域已知的氨基酸改組方法產(chǎn)生的酶。天然酶的含義中涵蓋的是天然變體，而外來酶的含義中涵蓋的是重組(如通過定位誘變或改組)獲得的變體。[0245]所述酶組合物的一種或多種(幾種)組分可以是重組組分，亦即，通過克隆編碼所述單獨組分的DNA序列并隨后用該DNA序列轉(zhuǎn)化細胞并在宿主中表達(參見，例如，W091/17243和W091/17244)產(chǎn)生。所述宿主優(yōu)選是異源宿主(酶對宿主是異源的)，但該宿主在一定條件下也可以是同源宿主(酶對宿主是天然的)。單組分纖維素分解蛋白還可以通過從發(fā)酵液中提純這樣的蛋白來制備。[0246]在一個方面，所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶包括商業(yè)性纖維素分解酶制備物。適用于本發(fā)明的商業(yè)的纖維素分解酶制備物的實例包括，例如，CELLIC?Ctec(NovozymesA/S)、CELLIC?CTec2(NovozymesA/S)、CELLUCLAST?(NovozymesA/S)、NOVOZYMtmI88(NovozymesA/S)、CELLUZYME?(NovozymesA/S)、CEREFLO?(NovozymesA/S)和ULTRAFLO?(NovozymesA/S)，ACCELERASE?(GenencorInt.)、LAMINEX?(GenencorInt.)、SPEZYME?CP(GenencorInt.)，R0HAMENT?7069ff(RohmGmbH)，F(xiàn)IBREZYME?LDI(DyadicInternational,Inc.)、FIBREZYME?LBR(DyadicInternational,Inc.)或VISCOSTAR?150L(DyadicInternational,Inc.)。所述纖維素酶以固體的約0.001到約5.0wt%,更優(yōu)選固體的約0.025到約4.0wt%,且最優(yōu)選固體的約0.005到約2.0wt%的有效量添加。[0247]可以用于本發(fā)明的方法的細菌內(nèi)切葡聚糖酶的實例包括但不僅限于，解纖維熱酸菌(Acidothermuscellulolyticus)內(nèi)切葡聚糖酶(W091/05039；W093/15186;美國專利5,275,944；W096/02551;美國專利5,536,655，W000/70031,W005/093050)；Thermobifidafusca內(nèi)切葡聚糖酶III(W005/093050)jPThermobifidafusca內(nèi)切葡聚糖酶V(W005/093050)。[0248]可以用于本發(fā)明的真菌內(nèi)切葡聚糖酶的實例包括但不僅限于，里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶KPenttila等，1986，Gene45:253-263;里氏木霉Cel7B內(nèi)切葡聚糖酶I；GENBANK?登錄號M15665);里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IKSaloheimo等，1988,Gene63:11-22;里氏木霉Cel5A內(nèi)切葡聚糖酶II;GENBANK?登錄號M19373);里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(Okada等，1988，Appl.Environ.Microbiol.64:555-563;GENBANK?登錄號AB003694);里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V(Saloheimo等,1994,MolecularMicrobiology13:219-228；GENBANK?登錄號Z33381);棘抱曲霉內(nèi)切葡聚糖酶(Ooi等，1990，NucleicAcidsResearchl8:5884)；川地曲霉(Aspergilluskawachii)內(nèi)切葡聚糖酶(Sakamoto等,1995,CurrentGenetics27:435-439);胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwiniacarotovara)內(nèi)切葡聚糖酶(Saarilahti等，1990，Gene90:9-14);尖鐮孢內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK?登錄號L29381)；灰腐質(zhì)霉thermoidea變種內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK?登錄號AB003107)；Melanocarpusalbomyces內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK?登錄號MAL515703);粗糙脈孢菌內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK?登錄號XM_324477);特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V;嗜熱毀絲霉CBSl17.65內(nèi)切葡聚糖酶；擔子菌綱(basidi0myCete)CBS495.95內(nèi)切葡聚糖酶；擔子菌綱CBS494.95內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL6B內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL6C內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7C內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7E內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7F內(nèi)切葡聚糖酶；CladorrhinumfoecundissimumATCC62373CEL7A內(nèi)切葡聚糖酶；以及里氏木霉菌株N0.VTT-D-80133內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK?登錄號Ml5665)。[0249]可用于生物質(zhì)水解的其它纖維二糖水解酶的實例包括但不僅限于，里氏木霉纖維二糖水解酶I;里氏木霉纖維二糖水解酶II;特異腐質(zhì)霉纖維二糖水解酶I;嗜熱毀絲霉纖維二糖水解酶II;土生梭孢霉纖維二糖水解酶II(CEL6A);嗜熱毛殼菌(Chaetomiumthermophilum)纖維二糖水解酶I;以及嗜熱毛殼菌纖維二糖水解酶II。[0250]可用于本發(fā)明的(6-葡糖苷酶的實例包括但不僅限于米曲霉(6-葡糖苷酶；煙曲霉(6-葡糖苷酶；巴西青霉(Penicilliumbrasilianum)IBT20888P-葡糖苷酶；黑曲霉葡糖苷酶；以及棘孢曲霉(6-葡糖苷酶。[0251]具有具有(6-葡糖苷酶活性的米曲霉多肽可根據(jù)W02002/095014獲取。具有^-葡糖苷酶活性的煙曲霉多肽可根據(jù)W02005/047499獲取。具有P-葡糖苷酶活性的巴西青霉多肽可根據(jù)W02007/019442獲取。具有P_葡糖苷酶活性的黑曲霉多肽可根據(jù)Dan等，2000,J.Biol.Chem.275:4973-4980獲取。具有P-葡糖苷酶活性的棘孢曲霉多肽可根據(jù)Kawaguchi等，1996，Genel73:287-288獲取。[0252](6-葡糖苷酶可為融合蛋白。在一個方面，所述(6-葡糖苷酶為根據(jù)W02008/057637獲得的米曲霉P-葡糖苷酶融合蛋白或米曲霉P_葡糖苷酶變體BG融合蛋白。[0253]其它可用的內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和P-葡糖苷酶使用根據(jù)Henrissat,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316和Henrissat和Bairoch,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696的分類公開于許多糖基水解酶家族中。[0254]其它可用于本發(fā)明的纖維素分解酶描述于EP495，257、EP531，315、EP531，372、W089/09259、W094/07998、W095/24471、W096/11262、W096/29397、W096/034108,W097/14804、W098/08940、W098/012307、W098/13465、W098/015619、W098/015633、W098/028411,W099/06574、W099/10481、W099/025846、W099/025847、W099/031255、W02000/009707,W02002/050245,W02002/0076792,W02002/101078,W02003/027306,W02003/052054,W02003/052055,W02003/052056,W02003/052057,W02003/052118,W02004/016760,W02004/043980,W02004/048592,W02005/001065,W02005/028636,W02005/093050,W02005/093073,W02006/074005,W02006/117432,W02007/071818,W02007/071820、W02008/008070、W02008/008793、美國專利N0.4，435，307、美國專利N0.5，457，046、美國專利N0.5，648，263、美國專利N0.5，686，593、美國專利N0.5，691，178、美國專利N0.5，763，254以及美國專利N0.5，776，757。[0255]在本發(fā)明的方法中，可使用任何具有纖維素分解增強活性的GH61多肽。[0256]可用于本發(fā)明的方法的具有纖維素分解增強活性的多肽的實例包括但不限于來自土生梭孢霉的具有纖維素分解增強活性的多肽(W02005/074647);來自桔橙嗜熱子囊菌的具有纖維素分解增強活性的多肽(W02005/074656);來自里氏木霉的具有纖維素分解增強活性的多肽(W02007/089290);和來自嗜熱毀絲霉的具有纖維素分解增強活性的多肽(W02009/085935,W02009/085859,W02009/085864,W02009/085868)。[0257]在一個方面，所述一個或多個(幾個)半纖維素分解酶包含商業(yè)性半纖維素分解酶制備物。適用于本發(fā)明的商業(yè)性半纖維素分解酶制備物的實例包括，例如SHEARZYME?(NovozymesA/S)、CELLIC?HTec(NovozymesA/S)、CELLIC?HTec2(NovozymesA/S)>YISGOZYME?(NovozymesA/S)>ULTRAFLO?(NovozymesA/S)>PULP^YME?HG(NovozymesA/S)>MULTIFEGI1?Xylanase(Genencor)、ECOPULP?TX-200A(ABEnzymes)、HSP6000Xylanase(DSM)、DEP0L?333P(BiocatalystsLimit,Wales,UK),DEP0L?740L.(BiocatalystsLimit,Wales,UK)和DEP0L?762P(BiocatalystsLimit,Wales,UK)。[0258]可用于本發(fā)明方法的木聚糖酶的實例包括但不限于棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)木聚糖酶(GeneSeqP:AAR63790;W094/21785)、煙曲霉(AspergiIIusfumigatus)木聚糖酶(W02006/078256)和土生梭抱霉(Thielaviaterrestris)NRRL8126木聚糖酶(TO2009/079210)。[0259]可用于本發(fā)明方法的P-木糖苷酶的實例包括但不限于里氏木霉(Trichodermareesei)P-木糖苷酶(UniProtKB/TrEMBL登錄號Q92458)、埃默森踩節(jié)菌(Talaromycesemersonii)(SwissProt登錄號Q8X212)和粗糖脈抱菌(Neurosporacrassa)(SwissProt登錄號Q7S0W4)。[0260]可用于本發(fā)明方法的乙酰木聚糖酯酶的實例包括但不限于紅褐肉座菌(Hypocreajecorina)乙酰木聚糖酯酶(W02005/001036)、粗糙脈孢菌乙酰木聚糖酯酶(UniProt登錄號q7s259)、土生梭孢霉NRRL8126乙酰木聚糖酯酶(W02009/042846)、球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登錄號Q2GWX4)、細麗毛殼菌(Chaetomiumgracile)乙酰木聚糖酯酶(GeneSeqP登錄號AAB82124)、穎枯殼針孢(Phaeosphaerianodorum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登錄號Q0UHJ1)和特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)DSM1800乙酰木聚糖酯酶(W02009/073709)。[0261]可用于本發(fā)明方法的阿魏酸酯酶的實例包括但不限于特異腐質(zhì)霉DSM1800阿魏酸酯酶(W02009/076122)、粗糙脈孢菌阿魏酸酯酶(UniProt登錄號Q9HGR3)和費希新薩托菌(Neosartoryafischer)阿魏酸酯酶(UniProt登錄號A1D9T4)。[0262]可用于本發(fā)明方法的阿拉伯呋喃糖苷酶的實例包括但不限于特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)DSM1800阿拉伯呋喃糖苷酶(W02009/073383)和黑曲霉(Aspergillusniger)阿拉伯呋喃糖苷酶(GeneSeqP登錄號AAR94170)。[0263]可用于本發(fā)明方法的a-葡糖醛酸糖苷酶的實例包括但不限于棒曲霉(Aspergillusclavatus)a-葡糖醒酸糖苷酶(UniProt登錄號alccl2)、里氏木霉a-葡糖醒酸糖苷酶(Uniprot登錄號Q99024)、埃默森踝節(jié)菌a-葡糖醒酸糖苷酶(UniProt登錄號Q8X211)、黑曲霉a-葡糖醒酸糖苷酶(Uniprot登錄號Q96WX9)、土曲霉(Aspergillusterreus)a-葡糖醒酸糖苷酶(SwissProt登錄號Q0CJP9)和煙曲霉a-葡糖醒酸糖苷酶(SwissProt登錄號Q4WW45)。[0264]用于本發(fā)明方法的酶和蛋白可通過使用本領域已知方法(參見，例如Bennett,J.W.和LaSure,L.(編)，MoreGeneManipulationsinFungi,AcademicPress,CA,1991),在含有合適碳源和氮源和無機鹽的營養(yǎng)培養(yǎng)基上發(fā)酵上述指出的微生物菌株來產(chǎn)生。合適的培養(yǎng)基可從供應商獲得，或可根據(jù)已公開的組成制備(例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄)。適于生長和酶產(chǎn)生的溫度范圍和其他條件在本領域是已知的(參見，例如Bailey,J.E?和Ollis,D.F.，BiochemicalEngineeringFundamentals,McGraw-HillBookCompany,NY,1986)。[0265]所述發(fā)酵可以是任何其結(jié)果為表達或分離酶或蛋白的培養(yǎng)細胞的方法。因此，發(fā)酵可以理解為包括在合適的培養(yǎng)基中并在允許所述酶得以表達或分離的條件下進行的搖瓶培養(yǎng)，或在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小-或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵)。通過上述方法產(chǎn)生的所得的酶可從發(fā)酵培養(yǎng)基回收并通過常規(guī)方法純化。[0266]下面給出本發(fā)明的多肽組合物的優(yōu)選用途。本發(fā)明的多肽組合物的劑量和其他使用所述組合物的條件可基于本領域已知方法來確定。[0267]用途[0268]本發(fā)明還涉及下述使用具有纖維二糖水解酶活性的多肽或其組合物的方法。[0269]本發(fā)明還涉及降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，包括:在本發(fā)明的具有纖維二糖水解酶的多肽的存在下用酶組合物處理纖維素材料。在一個方面，對所述纖維素材料進行預處理。在另一個方面，所述方法還包括回收經(jīng)降解或轉(zhuǎn)化的纖維素材料。纖維素材料的降解或轉(zhuǎn)化的可溶性產(chǎn)物可從不溶性纖維素材料使用本領域中公知的技術如例如離心、過濾和重力沉降來分離。[0270]本發(fā)明還涉及產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括:(a)在存在本發(fā)明的具有纖維二糖水解酶的多肽的條件下，用酶組合物糖化纖維素材料；(b)用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(C)從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。[0271]本發(fā)明還涉及發(fā)酵纖維素材料的方法，其包括:用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵纖維素材料，其中在存在本發(fā)明的具有纖維二糖水解酶的多肽的條件下，用酶組合物糖化纖維素材料。在一個方面，纖維素材料的發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。在另一個方面，所述方法進一步包括從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。[0272]本發(fā)明的方法可用于將纖維素材料糖化為可發(fā)酵的糖，并將可發(fā)酵的糖轉(zhuǎn)化為許多有用物質(zhì)，例如燃料、飲用乙醇和/或發(fā)酵產(chǎn)物(例如酸、醇、酮、氣體等)。從纖維素材料產(chǎn)生所需的發(fā)酵產(chǎn)物通常涉及預處理、酶水解(糖化)和發(fā)酵。[0273]根據(jù)本發(fā)明的纖維素材料的處理可以使用本領域的常規(guī)過程完成。此外，本發(fā)明的方法能使用經(jīng)配置以依照發(fā)明操作的任何常規(guī)生物質(zhì)處理設備進行。[0274]水解(糖化)和發(fā)酵，分別或同時，包括但不限于，分開的水解和發(fā)酵(SHF)、同步糖化和發(fā)酵(SSF)、同步糖化和共發(fā)酵(SSCF)、混合的水解和發(fā)酵(HHF)、分開的水解和共發(fā)酵(SHCF)、混合的水解和共發(fā)酵(HHCF)，和直接微生物轉(zhuǎn)化(DMC)。SHF使用分開的處理步驟以首先將纖維素材料酶水解為可發(fā)酵糖，例如，葡萄糖，纖維二糖、纖維三糖和戊糖，然后將可發(fā)酵糖發(fā)酵成為乙醇。在SSF中，纖維素材料的酶水解和糖變?yōu)橐掖嫉陌l(fā)酵組合在一個步驟中(PhiIippidiS，G.P.,1996,Cellulosebioconversiontechnology,于HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization,Wyman,C.E編,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。SSCF包括多種糖的共發(fā)酵(Sheehan,J.,和Himmel,M.，1999，Enzymes,energyandtheenvironment:AstrategicperspectiveontheU.S.DepartmentofEnergy’sresearchanddevelopmentactivitiesforbioethanol,Biotechnol.Prog.15:817-827)。HHF在同步糖化和水解步驟之外,還涉及單獨的水解步驟，所述步驟可以在同一個反應器中進行。HHF過程中的步驟可以在不同的溫度進行，即，高溫酶糖化，然后在發(fā)酵菌株能夠耐受的較低溫度進行SSF。DMC在一個或多個(幾個)步驟中組合了所有三個過程(酶產(chǎn)生、水解和發(fā)酵)，其中使用相同的生物體產(chǎn)生用于將纖維素材料轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖并將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成終產(chǎn)物的酶(Lynd等，2002,Microbialcelluloseutilization!Fundamentalsandbiotechnology,Microbiol.Mol.Biol.Reviews66:506-577)。在本文可以理解的是，本領域中任何已知的方法，包括預處理、酶水解(糖化)、發(fā)酵，或它們的組合，可用于實施本發(fā)明的方法。[0275]常規(guī)設備包括補料分批攪拌反應器、分批攪拌反應器、具有超濾的連續(xù)流攪拌反應器和/或連續(xù)活塞流柱式反應器(Corazza等，2003，Optimalcontrolinfed—batchreactorforthecellobiosehydrolysis,ActaScientiarum.Techno1gy25:33-38;Gusakov和Sinitsyn，1985，Kineticsoftheenzymatichydrolysisofcellulose:1.Amathematicalmodelforabatchreactorprocess,Enz.Microb.Technol.7:346-352)、研磨反應器(Ryu和Lee,1983，Bioconversionofwastecellulosebyusinganattritionbioreactor,Biotechnol.Bioeng.25:53-65),或者具有由電磁場引起的強烈攪拌的反應器(Gusakov等，1996，Enhancementofenzymaticcellulosehydrolysisusinganoveltypeofbioreactorwithintensivestirringinducedbyelectromagneticfield，Appl.Biochem.Biotechnol.56:141-153)。其它反應器類型包括:流化床、升流層(upflowblanket)、固定化和擠出機型反應器以供水解和/或發(fā)酵。[0276]預處理。在本發(fā)明的方法的實施中，可以使用本領域已知的任何預處理過程破壞植物細胞壁的纖維素材料組分(Chandra等，2007，Substratepretreatment:Thekeytoeffectiveenzymatichydrolysisoflignocellulosics?Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:67-93;Galbe和Zacchi，2007，Pretreatmentoflignocellulosicmaterialsforefficientbioethanolproduction,Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:41-65;Hendriks和Zeeman，2009，Pretreatmentstoenhancethedigestibilityoflignocellulosicbiomass，BioresourceTechnol.100:10-18;Mosier等，2005，F(xiàn)eaturesofpromisingtechnologiesforpretreatmentoflignocellulosicbiomass，BioresourceTechnol.96:673-686;Taherzadeh和Karimi，2008，Pretreatmentoflignocellulosicwastestoimproveethanolandbiogasproduction:Areview,Int.J.0fMo`l.Sc1.9:1621-1651;Yang和Wyman，2008，Pretreatment:thekeytounlockinglow-costcellulosicethanol,BiofuelsBioproductsandBiorefining-Biofpr.2:26-40)。[0277]纖維素材料也可以在預處理之前使用本領域中已知的方法進行粒度減小、預浸泡、潤濕、洗滌和/或調(diào)節(jié)。[0278]常規(guī)的預處理包括但不限于，蒸汽預處理(伴隨或不伴隨爆炸)、稀酸預處理、熱水預處理、堿性預處理、石灰預處理、濕氧化、濕爆炸、氨纖維爆炸、有機溶劑預處理和生物預處理。其它預處理包括氨滲濾、超聲、電穿孔、微波、超臨界CO2、超臨界1120、臭氧和Y輻射預處理。[0279]可以在水解和/或發(fā)酵之前預處理纖維素材料。預處理優(yōu)選在水解前進行?；蛘?，預處理可以與酶水解同時進行以釋放可發(fā)酵糖，如葡萄糖、木糖和/或纖維二糖。在大多數(shù)情況下，預處理步驟本身使一些生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖(甚至在不存在酶的情況下)。[0280]蒸汽預處理:在蒸汽預處理中，加熱纖維素材料以破壞植物細胞壁成分，包括木質(zhì)素、半纖維素和纖維素，使酶可接觸纖維素和其它部分，例如，半纖維素。使所述纖維素材料通過或穿過反應容器，其中注入蒸汽以增加溫度至需要的溫度和壓力，并且在其中保持期望的反應時間。蒸汽預處理優(yōu)選在140-230°C，更優(yōu)選160-200°C，并且最優(yōu)選170-190°C進行，其中最優(yōu)的溫度范圍依賴于任何化學催化劑的添加。蒸汽預處理的停留時間優(yōu)選1-15分鐘，更優(yōu)選3-12分鐘，并且最優(yōu)選4-10分鐘，其中最優(yōu)的停留時間依賴于溫度范圍和任何化學催化劑的添加。蒸汽預處理允許相對較高的固體加載量，使纖維素材料在預處理過程中通常僅僅變得潮濕。蒸汽預處理經(jīng)常與預處理后的物質(zhì)的爆炸放料(explosivedischarge)組合，這稱為蒸汽爆炸，即，快速閃變至大氣壓和物質(zhì)的瑞流，以通過破碎增加可接觸的表面積(Duff和Murray,1996,BioresourceTechnology855:1-33;Galbe和Zacchi,2002,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:618-628;美國專利申請?zhí)?002/0164730)。在蒸汽預處理過程中，切割半纖維素乙?；鶊F，并且得到的酸自催化半纖維素部分水解成單糖和寡糖。去除木質(zhì)素至有限的程度。[0281]經(jīng)常在蒸汽預處理之前加入催化劑如H2SO4或SO2(通常0.3至3%w/w)，其可減少時間，降低溫度，增加回收率，并改進酶水解(Ballesteros等,2006,Appl.Biochem.Biotechnol.129-132:496-508;Varga等,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.113-116:509-523;Sassner等?,2006,EnzymeMicrob.Technol.39:756-762)。[0282]化學預處理:術語“化學處理”指促進纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素分離和/或釋放的任何化學預處理。合適的化學預處理過程的實例包括例如稀酸預處理、石灰預處理、濕氧化、氨纖維/冷凍爆炸(AFEX)、氨滲濾(APR)和有機溶劑預處理。[0283]在稀酸預處理中，將纖維素材料與稀酸(通常是比504)和水混合以形成漿料，由蒸汽加熱至期望的溫度，并在一段停留時間后閃變至大氣壓?？梢杂煤芏喾磻髟O計進行稀酸預處理，例如，活塞流反應器、逆流反應器或連續(xù)逆流收縮床反應器(Duff和Murray,1996，supra;Schell等，2004，BioresourceTechnol.91:179-188;Lee等,1999,Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:93-115)。[0284]還可以使用堿性條件下的幾種預處理方法。這些堿預處理包括，但不限于，石灰預處理、濕氧化、氨滲濾(APR)和氨纖維/冷凍爆炸(AFEX)。[0285]用碳酸鈣、氫氧化鈉或氨，在85-150V的低溫進行石灰預處理，停留時間從I小時到幾天(Wyman等，2005，BioresourceTechnol.96:1959-1966;Mosier等，2005，BioresourceTechnol.96:673-686)。W02006/110891、W02006/110899、W02006/110900和W02006/110901公開了使用氨的預處理方法。[0286]濕法氧化是熱預處理，通常在180-20(TC進行5-15分鐘，加入氧化劑如過氧化氧或過壓氧(Schmidt和Thomsen,1998，BioresourceTechnol.64:139-151;Palonen等，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.117:1-17;Varga等，2004，Biotechnol.Bioeng.88:567-574;Martin等,2006,J.Chem.Technol.Biotechnol.81:1669-1677)。預處理以優(yōu)選1-40%干物質(zhì)，更優(yōu)選2-30%干物質(zhì)，并且最優(yōu)性5-20%干物質(zhì)進行，并且由于加入堿如碳酸鈉，初始PH經(jīng)常會增加。[0287]濕法氧化預處理方法的修改方法，稱為濕爆炸(濕氧化和蒸汽爆炸的組合)，能夠處理高達30%的干物質(zhì)。在濕爆炸中，在預處理過程中，在一定的停留時間后引入氧化劑。然后通過閃變至大氣壓而結(jié)束預處理(W02006/032282)。[0288]氨纖維爆炸(AFEX)涉及在溫和溫度如90-100°C和高壓如17_20bar，用液體或氣體氨將纖維素材料處理5-10分鐘，其中干物質(zhì)含量可以高達60%(Gollapalli等，2002，Appl.Biochem.Biotechnol.98:23-35;Chundawat等，2007，Biotechnol.Bioeng.96:219-231;Alizadeh等,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.121:1133-1141;Teymouri等，2005，BioresourceTechnol.96:2014-2018)。AFEX預處理導致纖維素解聚，和半纖維素的部分水解。木質(zhì)素-糖復合物得到切割。[0289]有機溶劑預處理通過用含水乙醇(40-60%乙醇)在160-200°C提取30-60分鐘而將纖維素材料去木質(zhì)素化(Pan等,2005,Biotechnol.Bioeng.90:473-481;Pan等，2006，BiotechnoI?Bioeng.94:851-86I;Kurabi等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121:219-230)。經(jīng)常加入硫酸作為催化劑。在有機溶劑預處理中，去除大部分半纖維素。[0290]合適的預處理方法的其他實例如Schell等，2003，Appl.BiochemandBiotechn.Vol.105-108:69-85,和Mosier等，2005，BioresourceTechnology96:673-686，和美國已公開的申請2002/0164730所述。[0291]在一個方面，化學預處理優(yōu)選作為酸處理，并且更優(yōu)選作為連續(xù)稀酸和/或弱酸(mildacid)處理進行。酸通常是硫酸，但也可以使用其它酸，如乙酸、檸檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氫或其混合物。弱酸處理在優(yōu)選1-5，更優(yōu)選1-4，并且最優(yōu)選1-3的pH范圍內(nèi)進行。在一個方面，酸濃度在優(yōu)選0.01至20wt%酸，更優(yōu)選0.05至10wt%酸，甚至更優(yōu)選0.1至5wt%酸，并且最優(yōu)選0.2至2.0wt%酸的范圍內(nèi)。酸與纖維素材料接觸，并在優(yōu)選160-220°C，和更優(yōu)選165-195°C范圍內(nèi)的溫度保持數(shù)秒到數(shù)分鐘，例如I秒-60分鐘的時間。[0292]在另一個方面，預處理作為氨纖維爆炸步驟(AFEX預處理步驟)進行。[0293]在另一個方面，預處理發(fā)生在含水漿料中。在優(yōu)選的方面，在預處理過程中纖維素材料以優(yōu)選10-80wt%，更優(yōu)選20-70wt%，并且最優(yōu)選30-60wt%，如約50wt%的量存在。預處理的纖維素材料可以不洗滌或者使用本領域任何已知的方法洗滌，例如，用水洗滌。[0294]機械預處理:術語“機械預處理”指各種類型的磨制(grinding)或粉碎(milling)(例如，干磨、濕磨或振動球磨)。[0295]物理預處理:術語“物理預處理”指促進纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素從纖維素材料分離和/或釋放的任何預處理。例如，物理預處理可涉及輻射(例如，微波輻射)、汽蒸/蒸汽爆炸、水熱解(hydrothermolysis)和它們的組合。[0296]物理預處理可以涉及高壓和/或高溫(蒸汽爆炸)。在一個方面，高壓指范圍在優(yōu)選約300至約600psi，更優(yōu)選約350至約550psi，并且最優(yōu)選約400至約500psi，如約450psi的壓強。在另一個方面，高溫指范圍在約100至約300°C，優(yōu)選約140至約235°C的溫度。在一個優(yōu)選的方面，機械預處理在使用如上所定義的高溫和高壓的分批過程、蒸汽槍水解器系統(tǒng)，例如來自SundsDefibratorAB,Sweden的SundsHydrolyzer中進行。[0297]組合的物理和化學預處理:可以對纖維素材料進行物理和化學預處理。例如，預處理步驟可以涉及稀酸或弱酸處理和高的溫度和/或壓力處理。根據(jù)需要，可以順序或同時進行物理和化學預處理。還可以包括機械預處理。[0298]因此，在一個優(yōu)選的方面，對纖維素材料進行機械、化學或物理預處理，或者它們的任意組合，以促進纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素的分離和/或釋放。[0299]生物預處理:術語“生物預處理”指促進纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素從纖維素材料分離和/或釋放的任何生物預處理。生物預處理技術可以包括應用溶解木質(zhì)素的微生物(參見，例如，Hsu,T.-A.,1996,Pretreatmentofbiomass,于HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization,Wyman,C.E編,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212;Ghosh和Singh,1993，Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333;McMillan,J.D.,1994,Pretreatinglignocellulosicbiomass:areview,于EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction,Himmel,M.E.,Baker,J.0.,和Overend,R.P.，編,ACSSymposiumSeries566,AmericanChemicalSociety,Washington,DC,第15章;Gong,C.5.,Cao,N.J.,Du,J.,和Tsao,G.T.，1999，Ethanolproductionfromrenewableresources,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.,編,Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241;01sson和Hahn-HagerdaI,1996,Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312-331;和Vallander和Eriksson,1990,Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。[0300]趣化。在水解(也稱作糖化)步驟中,將纖維素材料(例如經(jīng)預處理的)水解以將纖維素或亦將半纖維素分解成可發(fā)酵糖，如葡萄糖、纖維二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶的寡糖。水解由酶組合物以酶法在本發(fā)明的具有纖維二糖水解酶活性的多肽的存在下進行。組合物的酶可順序加入。[0301]酶水解優(yōu)選在易于由本領域技術人員確定的條件下，在合適的含水環(huán)境中進行。在一個方面，水解在適于酶的活性，即對于酶最優(yōu)的條件下進行。水解可以以補料分批或連續(xù)的工藝進行，其中將纖維素材料逐漸補入，例如，含酶的水解溶液中。[0302]糖化通常在攪拌釜反應器或發(fā)酵罐中，在受控的pH、溫度和混合條件下進行。合適的處理時間、溫度和pH條件可以由本領域技術人員容易地確定。例如，糖化可以持續(xù)長達200小時，但是通常優(yōu)選進行約12至約96小時，更優(yōu)選約16至約72小時，并且最優(yōu)選約24至約48小時。溫度優(yōu)選約25°C至約70°C，更優(yōu)選約30°C至約65°C，并且更優(yōu)選約40°C至約60°C，特別是約50°C。pH優(yōu)選約3至約8，更優(yōu)選約3.5至約7，并且最優(yōu)選約4至約6,特別是約pH5。干燥固體含量優(yōu)選約5至約50wt%,更優(yōu)選約10至約40wt%,并且最優(yōu)選約20至約30wt%。[0303]發(fā)璧?？赏ㄟ^一種或多種(幾種)能將糖直接或間接發(fā)酵成所需發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵微生物發(fā)酵自經(jīng)水解的纖維素材料獲得的可發(fā)酵糖。“發(fā)酵”或“發(fā)酵方法”指任何發(fā)酵方法或包含發(fā)酵步驟的任何方法。發(fā)酵方法還包括用于消費品醇工業(yè)(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品業(yè)(例如，發(fā)酵乳制品)、皮革業(yè)和煙草業(yè)的發(fā)酵方法。發(fā)酵條件依賴于期望的發(fā)酵產(chǎn)物和發(fā)酵生物體，并且能由本領域的技術人員容易地確定。[0304]在發(fā)酵步驟中，作為預處理和酶水解步驟的結(jié)果從纖維素材料釋放的糖，通過發(fā)酵生物體(如酵母)發(fā)酵成為產(chǎn)物，例如，乙醇。如本文中所述，水解(糖化)和發(fā)酵可以是分開的或同時的。[0305]在實施本發(fā)明時，在發(fā)酵步驟中可以使用任何合適的經(jīng)水解的纖維素材料。通常根據(jù)所需的發(fā)酵產(chǎn)品(即，要從發(fā)酵獲得的物質(zhì))和使用的方法來選擇所述材料，如本領域中所公知的。[0306]術語“發(fā)酵培養(yǎng)基”在本文中可理解為指加入發(fā)酵微生物之前的培養(yǎng)基，如，由糖化過程產(chǎn)生的培養(yǎng)基，以及同步的糖化和發(fā)酵方法(SSF)中使用的培養(yǎng)基。[0307]“發(fā)酵微生物”指適用于理想的發(fā)酵方法產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的任何微生物，包括細菌和真菌生物體。發(fā)酵生物體可以是(:6和/或(:5發(fā)酵生物體，或它們的組合。Cf^PC5發(fā)酵生物體均在本領域公知。合適的發(fā)酵微生物能將糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖或寡糖)直接或間接地發(fā)酵(即，轉(zhuǎn)化)成所需的發(fā)酵產(chǎn)品。[0308]產(chǎn)生乙醇的細菌和真菌發(fā)酵生物體的實例如Lin等，2006，Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627-642所述。[0309]能發(fā)酵C6糖的發(fā)酵微生物的實例包括細菌和真菌生物體，如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬菌種，優(yōu)選釀酒酵母。[0310]能發(fā)酵C5糖的發(fā)酵生物體的實例包括細菌和真菌生物體，如一些酵母。優(yōu)選的C5發(fā)酵酵母包括畢赤酵母屬，優(yōu)選樹干畢赤酵母(Pichiastipitis)的菌株,如樹干畢赤酵母CBS5773;假絲酵母屬，優(yōu)選博伊丁假絲酵母(Candidaboidinii)、蕓薹假絲酵母(Candidabrassicae)、休哈塔假絲酵母(Candidasheatae)、迪丹斯假絲酵母(Candidadiddensii)、假熱帶假絲酵母(Candidapseudotropicalis)或產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)的菌株。[0311]其它發(fā)酵生物體包括發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas),如運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis);漢遜酵母屬，如異常漢遜酵母(Hansenulaanomala);克魯維酵母屬，如脆壁克魯維酵母；裂殖酵母屬，如粟酒裂殖酵母(S.pombe);大腸桿菌，特別是已經(jīng)經(jīng)過遺傳修飾而改進乙醇產(chǎn)量的大腸桿菌；梭菌屬(Clostridium)，如丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum),熱纖維梭菌(Chlostridiumthermocellum)，和Chlostridiumphytofermentans;地芽抱桿菌屬菌種(Geobacillussp.);熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacter),如角軍糖熱厭氧桿菌(ThermoanaerobactersaccharoIyticum);和芽孢桿菌屬，如凝結(jié)芽孢桿菌。[0312]在一個優(yōu)選的方面，酵母是酵母屬菌種。在一個更優(yōu)選的方面，酵母是釀酒酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是糖化酵母(Saccharomycesdistaticus)。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是克魯維酵母屬。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)。在另一個更優(yōu)選的方面,酵母是脆壁克魯維酵母。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是假絲酵母屬。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是博伊丁假絲酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是蕓薹假絲酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是迪丹斯假絲酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是假熱帶假絲酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是產(chǎn)朊假絲酵母。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是棒孢酵母屬(Clavispora)。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(ClavisporaIusitaniae)。在另一個更優(yōu)選的方面,酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavisporaopuntiae)。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是管囊酵母屬(Pachysolen)。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是嗜鞋管囊酵母(Pachysolentannophilus)。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是畢赤酵母屬。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是樹干畢赤酵母。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是酒香酵母屬(Bretannomyces)。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是克勞森酒香酵母(Bretannomycesclausenii)(Philippidis,G.P.,1996,Cellulosebioconversiontechnology,于HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization,Wyman,C.E.編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。[0313]能有效地將己糖和戊糖發(fā)酵成乙醇的細菌包括，例如，運動發(fā)酵單胞菌和丙酮丁醇梭菌，熱纖維梭菌，Chlostridiumphytofermentans，地芽孢桿菌屬菌種，解糖熱厭氧桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌(Philippidis，1996，見上文)。[0314]在一個優(yōu)選的方面，細菌是發(fā)酵單胞菌屬。在更優(yōu)選的方面，細菌是運動發(fā)酵單胞菌。在另一個優(yōu)選的方面，細菌是梭菌屬。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌是熱纖維梭菌。[0315]商業(yè)上可得到的適合乙醇產(chǎn)生的酵母包括，例如ETHANOLRED?酵母(RedStar/Lesaffre,USA)、FALI?(Fleischmann’sYeast,USA)、SUPERSTART?和THERMOSACC?新鮮酵母(EthanolTechnology，WI，USA)、BIOFERM?AFT和XR(NABC-NorthAmericanBioproductsCorporation,GA,USA).GERTSTRAND?(GertStrandABjSweden)和FERMIOL?(DSMSpecialties)。[0316]在一個優(yōu)選的方面，發(fā)酵微生物已經(jīng)經(jīng)過遺傳修飾，提供發(fā)酵戊糖的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。[0317]通過將異源基因克隆入多種發(fā)酵微生物已經(jīng)構(gòu)建了能將己糖和戊糖轉(zhuǎn)化成乙醇(共發(fā)酵)的生物體(Chen和Ho，1993,CloningandimprovingtheexpressionofPichiastipitisxylosereductasegeneinSaccharomycescerevisiae,Appl.Biochem.Biotechnol.39-40:135-147;Ho等，1998，GeneticallyengineeredSaccharomycesyeastcapableofeffectivelycofermentingglucoseandxylose,Appl.Environ.Microbiol.64:1852-1859;Kotter和Ciriacy，1993，XylosefermentationbySaccharomycescerevisiae,Appl.Microbiol.Biotechnol.38:776—783;Walfridsson等，1995,Xylose-metabolizingSaccharomycescerevisiaestrainsoverexpressingtheTKLlandTALlgenesencodingthepentosephosphatepathwayenzymestransketolaseandtransaldolase,Appl.Environ.Microbiol.61:4184—4190;Kuyper等，2004，MinimalmetabolicengineeringofSaccharomycescerevisiaeforefficientanaerobicxylosefermentation:aproofofprinciple,FEMSYeastResearch4:655-664;BealI等，1991，ParametricstudiesofethanolproductionfromxyloseandothersugarsbyrecombinantEscherichiacoli,Biotech.Bioeng.38:296-303;Ingram等，1998，Metabolicengineeringofbacteriaforethanolproduction，Biotechnol.Bioeng.58:204-214;Zhang等，1995，MetabolicengineeringofapentosemetabolismpathwayinethanologenicZymomonasmobilis，Science267:240-243;Deanda等，1996，Developmentofanarabinose-fermentingZymomonasmobilisstrainbymetabolicpathwayengineering,Appl.Environ.Microbiol.62:4465-4470;WO2003/062430，xyloseisomerase)。[0318]在一個優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是釀酒酵母。在另一個優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是運動發(fā)酵單胞菌。在另一個優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是大腸桿菌。在另一個優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)。在另一個優(yōu)選的方面,所述經(jīng)遺傳修飾的發(fā)酵微生物是克魯維酵母菌種。[0319]本領域中公知的是，上述生物體還能用于產(chǎn)生其它物質(zhì)，如本文所述。[0320]通常向降解的木素纖維素或水解物加入發(fā)酵微生物，并進行約8至約96小時，如約24至約60小時發(fā)酵。溫度通常為約26°C至約60°C，特別是約32°C或50°C，并且在約pH3至約pH8，如約pH4-5、6或7。[0321]在一個優(yōu)選的方面，對降解的纖維素材料施用酵母和/或另一種微生物，并進行約12至約96小時，如通常為24-60小時發(fā)酵。在一個優(yōu)選的方面，溫度優(yōu)選為約20°C至約60°C，更優(yōu)選約25°C至約50°C，并且最優(yōu)選約32°C至約50°C，特別是約32°C或50°C，并且pH通常為約pH3至約pH7，優(yōu)選約pH4-7。然而，一些發(fā)酵生物體例如細菌，具有更高的最適發(fā)酵溫度。酵母或另一種微生物優(yōu)選以約IO5-1O12,優(yōu)選約IO7-1Oltl,特別是約2xl08活細胞計數(shù)每ml發(fā)酵液的量施用。關于使用酵母進行發(fā)酵的進一步指導可以在例如“TheAlcoholTextbook，，(K.Jacques,T.P.Lyons和D.R.Kelsall編,NottinghamUniversityPress,UnitedKingdoml999)中找到，其通過提述并入本文。[0322]對于乙醇生產(chǎn)，在發(fā)酵后蒸餾發(fā)酵的漿料以提取乙醇。根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的乙醇可以用作，例如燃料乙醇；飲料乙醇，即，中性飲料酒，或工業(yè)乙醇。[0323]發(fā)酵刺激劑可以與本文所述的任何方法組合使用，以進一步改進發(fā)酵工藝，而且特定地，改進發(fā)酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率?！鞍l(fā)酵刺激劑”指用于發(fā)酵微生物(特別是酵母)生長的刺激劑。優(yōu)選的用于生長的發(fā)酵刺激劑包括維生素和礦物質(zhì)。維生素的實例包括多種維生素、生物素、泛酸(鹽)、煙酸、內(nèi)消旋肌醇(meso-1nositol)、硫胺素、吡唆醇(pyridoxine)、對氨基苯甲酸、葉酸、核黃素和維生素A、B、C、D^PE。參見，例如，Alfenore等，ImprovingethanolproductionandviabilityofSaccharomycescerevisiaebyavitaminfeedingstrategyduringfed—batchprocess,Springer-Verlag(2002),其通過提述并入本文。礦物質(zhì)的實例包括能夠提供營養(yǎng)物的礦物質(zhì)和礦物質(zhì)鹽，所述營養(yǎng)物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。[0324]發(fā)酵產(chǎn)物:發(fā)酵產(chǎn)物可以是源自發(fā)酵的任何物質(zhì)。發(fā)酵產(chǎn)物可以是，不限于，醇(例如，阿拉伯醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3_丙二醇、山梨醇和木糖醇)；有機酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)；和氣體(例如，甲烷、氫氣(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))。發(fā)酵產(chǎn)物還可以是作為高價值產(chǎn)品的蛋白質(zhì)。[0325]在一個優(yōu)選的方面，發(fā)酵產(chǎn)物是醇。可理解的是，術語“醇”包括包含一個或多個羥基基團(moiety)的物質(zhì)。在更優(yōu)選的方面，所述醇是阿拉伯醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是丁醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是乙醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是甘油。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是甲醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是1，3-丙二醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是山梨醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是木糖醇。參見，例如，Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,和Tsao,G.T.,1999,Ethanolproductionfromrenewableresources,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.編,Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241;Silveira,M.M.,和Jonas,R.，2002，Thebiotechnologicalproductionofsorbitol,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400-408;Nigam和Singh,1995,ProcessesforfermentativeproductionofxyIitol-asugarsubstitute,ProcessBiochemistry30(2):117-124;Ezeji等，2003，Productionofacetone,butanolandethanolbyClostridiumbeijerinckiiBAlOlandinsiturecoverybygasstripping,WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnologyl9(6):595-603。[0326]在另一個優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是有機酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是乙酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是醋酮酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是己二酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是抗壞血酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是檸檬酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是2，5-二酮-D-葡糖酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是甲酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是反丁烯二酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是葡糖二酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是葡糖酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是葡糖醛酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是戊二酸。在另一個優(yōu)選的方面，所述有機酸是3-羥基丙酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是衣康酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是乳酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是蘋果酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是丙二酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是草酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是丙酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是琥珀酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是木糖酸。參見，例如，Chen和Lee,1997，Membrane-mediatedextractivefermentationforlacticacidproductionfromcellulosicbiomass,Appl.Biochem.Biotechnol.63—65:435—448。[0327]在另一個優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是酮?？衫斫獾氖切g語“酮”涵蓋含有一個或多個酮基團的物質(zhì)。在另一個更優(yōu)選的方面，所述酮是丙酮。參見，例如，Qureshi和Blaschek,2003,見上文。[0328]在另一個優(yōu)選的`方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是氨基酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機酸是天冬氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是賴氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是絲氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是蘇氨酸。參見，例如，Richard和Margaritis,2004，Empiricalmodelingofbatchfermentationkineticsforpoly(glutamicacid)productionandothermicrobialbiopolymers,BiotechnologyandBioengineering87(4):501-515。[0329]在另一個優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是氣體。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是甲烷。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是H2。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是C02。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是CO。參見,例如,Kataoka等，1997，Studiesonhydrogenproductionbycontinuousculturesystemofhydrogen-producinganaerobicbacteria,WaterScienceandTechnology36(6-7):41-47;和Gunaseelan,1997，于BiomassandBioenergy,13(1~2),83-114,Anaerobicdigestionofbiomassformethaneproduction:Areview。[0330]通|?？梢允褂帽绢I域已知的任何方法，任選地從發(fā)酵培養(yǎng)基回收發(fā)酵產(chǎn)物，所述方法包括，但不限于，層析、電泳方法、差示溶解度、蒸餾或提取。例如，通過常規(guī)蒸餾方法從發(fā)酵的纖維素材料分離并純化醇?？梢垣@得純度高達約96vol%的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、飲用乙醇，即，中性飲料酒,或工業(yè)乙醇。[0331]信號肽[0332]本發(fā)明還涉及編碼信號肽的分離的多核苷酸，所述信號肽包含或組成為SEQIDNO:2的氨基酸I至18或SEQIDN0:4的I至25。在一個方面，所述多核苷酸是SEQIDNO:1的核苷酸I至54或SEQIDNO:3的I至75。所述多核苷酸還可包含編碼蛋白質(zhì)的基因，其可操作地連接于所述信號肽。[0333]本發(fā)明還涉及包含此種多核苷酸的核酸構(gòu)建體、表達載體和重組宿主細胞。[0334]本發(fā)明還涉及產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，包括:(a)培養(yǎng)重組宿主細胞，所述重組宿主細胞包含此種可操作地連接于編碼蛋白的基因的多核苷酸；和(b)回收所述蛋白質(zhì)。[0335]所述蛋白質(zhì)對于宿主細胞可以是天然的或異源的。術語“蛋白質(zhì)”在本文的意思不是指特定長度的編碼產(chǎn)物，并且因此包含肽、寡肽和多肽。術語“蛋白質(zhì)”還包含組合以形成編碼產(chǎn)物的兩種或更多種多肽。所述蛋白質(zhì)還包括雜合多肽和融合多肽。[0336]優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)是激素或其變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分，或報道蛋白(reporter)。例如，所述蛋白質(zhì)可為氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶(lyase)、異構(gòu)酶或連接酶，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、3-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡糖苷酶、3-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、另外的脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酹氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。[0337]基因可以從任何原核、真核或其它來源獲得。[0338]優(yōu)選實施方案的列表[0339]實施方案1.一種具有纖維二糖水解酶活性的分離的多肽，其選自下組:[0340](a)多肽，其與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少90%序列同一性；或多肽，其與SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少80%序列同一性；[0341](b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少90%序列同一性；或多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列或其基因組DNA序列具有至少80%序列同一性；[0342](C)SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的成熟多肽的包含一個或多個(幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體；和[0343](d)(a)、(b)或(C)的多肽的具有纖維二糖水解酶活性的片段。[0344]實施方案2.實施方案I的多肽，其與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少90%，例如至少92%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性。[0345]實施方案3.實施方案I的多肽，其與SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少80%，例如至少85%，至少87%，至少90%，至少92%，至少95%，例如至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性。[0346]實施方案4.實施方案1-3任一項的多肽，其包含或組成為SEQIDNO:2或SEQIDN0.4。[0347]實施方案5.實施方案4的多肽，其包含或組成為SEQIDNO:2或SEQIDN0.4的成熟多肽。[0348]實施方案6.實施方案5的多肽，其中所述成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸19至455或SEQIDNO:4的氨基酸26至537。[0349]實施方案7.—種分離的多肽，其包含催化域，所述催化域選自下組:[0350](a)催化域，其與SEQIDNO:2的催化域具有至少90%序列同一性；或催化域，其與SEQIDNO:4的催化域具有至少80%序列同一性；[0351](b)催化域，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:1的催化域編碼序列具有至少90%序列同一性；或催化域，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:3的催化域編碼序列具有至少80%序列同一性；[0352](C)SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的催化域的包含一個或多個(幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入的催化域變體；和[0353](d)(a)、(b)或(C)的催化域的具有纖維二糖水解酶活性的片段。[0354]實施方案8.實施方案7的多肽，其包含或組成為SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的催化域。[0355]實施方案9.實施方案8的多肽，其中所述催化域是SEQIDNO:2的氨基酸19至455或SEQIDNO:4的氨基酸26至465。[0356]實施方案10.實施方案7-9任一項的多肽，其進一步包含纖維素結(jié)合域。[0357]實施方案11.一種組合物，其包含實施方案1-10任一項的多肽。[0358]實施方案12.—種分離的多核苷酸,其編碼實施方案1-10任一項的多肽。[0359]實施方案13.—種核酸構(gòu)建體或表達載體,其包含實施方案12的多核苷酸,所述多核苷酸可操作地連接于一個或多個(幾個)調(diào)控序列，所述調(diào)控序列指導所述多肽在表達宿主中的產(chǎn)生。[0360]實施方案14.一種重組宿主細胞,其包含實施方案12的多核苷酸,所述多核苷酸可操作地連接于一個或多個調(diào)控序列，所述調(diào)控序列指導多肽的產(chǎn)生。[0361]實施方案15.—種產(chǎn)生實施方案1-10中任一項的多肽的方法，其包括:[0362](a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細胞，所述細胞以其野生型形式產(chǎn)生所述多肽；和[0363](b)回收所述多肽。[0364]實施方案16.—種產(chǎn)生具有纖維二糖水解酶活性的多肽的方法，其包括:[0365](a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)實施方案14的重組宿主細胞；和[0366](b)回收所述多肽。[0367]實施方案17.—種降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，其包括:在實施方案1-10中任一項的具有纖維二糖水解酶活性的多肽存在下用酶組合物處理所述纖維素材料。[0368]實施方案18.實施方案17的方法，其中所述纖維素材料經(jīng)過預處理。[0369]實施方案19.實施方案17或18的方法，進一步包括回收經(jīng)降解的纖維素材料。[0370]實施方案20.實施方案17-19任一項的方法，其中所述酶組合物包含一種或多種(幾種)選自下組的酶:纖維素酶、具有纖維素分解增強活性的GH61多肽、半纖維素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過氧化物酶、蛋白酶和膨脹素。[0371]實施方案21.實施方案20的方法，其中所述纖維素酶是一種或多種選自下組的酶:內(nèi)切葡聚糖酶、其它纖維二糖水解酶和3-葡糖苷酶。[0372]實施方案22.實施方案21的方法，其中所述半纖維素酶是一種或多種選自下組的酶:木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。[0373]實施方案23.—種產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括:[0374](a)在實施方案1-10中任一項的具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽存在下，用酶組合物糖化纖維素材料；[0375](b)用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和[0376](C)從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。[0377]實施方案24.實施方案23的方法，其中所述纖維素材料經(jīng)過預處理。[0378]實施方案25.實施方案23或24的方法，其中所述酶組合物包含一種或多種選自下組的酶:纖維素酶、具有纖維素分解增強活性的GH61多肽、半纖維素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過氧化物酶、蛋白酶和膨脹素。[0379]實施方案26.實施方案25的方法,其中所述纖維素酶是一種或多種選自下組的酶:內(nèi)切葡聚糖酶、其它纖維二糖水解酶和3-葡糖苷酶。[0380]實施方案27.實施方案25的方法,其中所述半纖維素酶是一種或多種選自下組的酶:木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。[0381]實施方案28.實施方案23-27中任一項的方法，其中步驟(a)和(b)在同步糖化和發(fā)酵中同時進行。[0382]實施方案29.實施方案23-28中任一項的方法，其中發(fā)酵產(chǎn)物是醇、有機酸、酮、氨基酸或氣體。[0383]實施方案30.—種發(fā)酵纖維素材料的方法,其包括:用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵纖維素材料，其中所述纖維素材料是在實施方案1-10中任一項的具有纖維二糖水解酶活性的多肽的存在下用酶組合物糖化的。[0384]實施方案31.實施方案30的方法，其中所述纖維素材料在糖化前經(jīng)過預處理。[0385]通過以下實施例進一步對本發(fā)明進行描述，但不應將其理解為對本發(fā)明范圍的限制。實施例[0386]菌株[0387]Talaromycesbyssochlamydoides菌株CBS413.71用作家族GH7基因的來源。[0388]米曲霉MT3568菌株用于異源表達家族GH7基因，所述基因編碼與具有纖維二糖水解酶活性的多肽具有同源性的多肽。米曲霉MT3568是米曲霉JaL355(W02002/40694)的amdS(乙酰胺酶)破壞的基因衍生物，其中通過用pyrG基因破壞米曲霉乙酰胺酶(amdS)基因而恢復了PyrG營養(yǎng)缺陷。[0389]培養(yǎng)基[0390]YP+2%葡萄糖培養(yǎng)基包含1%酵母提取物，2%蛋白胨和2%葡萄糖。[0391]PDA瓊脂平板包含馬鈴薯浸出物(馬鈴薯浸出物通過將300g切片的(經(jīng)洗滌，但未經(jīng)剝皮)的馬鈴薯在水中煮沸30分鐘，然后將湯液傾去或通過干酪包布過濾來制備)。然后添加蒸餾水直至懸液的總體積為一升，接著添加20g的右旋糖和20g的瓊脂粉。培養(yǎng)基通過在15psi蒸汽滅菌15分鐘來滅菌(BacteriologicalAnalyticalManual,8thEdition,RevisionA,1998)。[0392]LB平板包含IOg的Bacto-Tryptone,5g的酵母提取物，IOg的氯化鈉，15g的Bacto-瓊脂,和去離子水加至I升。[0393]LB培養(yǎng)基包含IOg的Bacto-Tryptone,5g的酵母提取物,和IOg的氯化鈉,和去離子水加至I升。[0394]COVE蔗糖平板包含342g的蔗糖，20g的瓊脂粉，20ml的COVE鹽溶液，和去離子水加至I升。培養(yǎng)基通過在15psi蒸汽滅菌15分鐘來滅菌(BacteriologicalAnalyticalManual,8thEdition,RevisionA,1998)。將培養(yǎng)基冷卻至60°C,并添加IOmM乙酸胺，15mMCsCl,TritonX-100(50ul/500ml)。[0395]COVE鹽溶液包含26g的MgSO4?7H20,26g的KCL，26g的KH2PO4,50ml的COVE微量金屬溶液，和去離子水加至I升。[0396]COVE微量金屬溶液包含0.04g的Na2B4O7?IOH20,0.4g的CuSO4?5H20,1.2g的FeSO4?7H20，0.7g的MnSO4?H20,0.8g的Na2MoO4?2H20,IOg的ZnSO4?7H20，和去離子水加至I升。[0397]實施例1:從Talaromycesbyssochlamydoides克隆兩個家族GH7基因[0398]根據(jù)Rose等，1998,NucleicAcidsResearch26:1628-1635所述的策略設計了一組下示的簡并引物以靶向編碼屬于家族GH7的纖維二糖水解酶的基因。[0399]ForlGTCGTTCTTGATGCgaaytggmgntggSEQIDNO:5[0400]For2CCTGCGCCCAGAACtgygcnbtngaSEQIDNO:6[0401]For3TGACGTCGATGTCTCCAATytnccntgyggSEQIDNO:7[0402]RevlGCATCCGTCGGGTAGTCGswrtcnarccaSEQIDNO:8[0403]Rev2GTCGGGTAGTCGGAATCCarccanwncatSEQIDNO:9[0404]Rev3GCCTGGCGTGTCGcanggrtgnggSEQIDNO:10[0405]大寫字母核苷酸代表引物的共同箍(consensusclamp),而小寫字母核苷酸代表寡核昔酸的簡并核心(Rose等，1998,NucleicAcidsResearch26:1628-1635)。[0406]PCR篩選使用兩個連續(xù)的PCR進行。用引物對Forl/Revl，F(xiàn)orl/Rev2，F(xiàn)or2/Revl,For2/Rev2,For3/Revl,For3/Rev2,Forl/Rev3,For2/Rev3,和For3/Rev3進行九個PCR反應。將正向引物(0.33iU的IOiiM儲液)與其對應的反向引物(0.33iU的IOuM儲液)在IOiU混合物中合并，所述混合物含有0.33uI基因組DNA和5iU的REDDYMIX?ExtensorPCRMasterMixl(ABgeneLtd.,Surrey,UnitedKingdom)。基因組DNA從根據(jù)FastDNA?SPINKit(Q-BIOgene，CarIsbad，CA，USA)中所述的步驟在PDA(參見培養(yǎng)基部分)上生長的Talaromycesbyssochlamydoides(參見菌株部分)的新鮮菌絲體獲得。PCR反應使用DYAD?ThermalCycler(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA，USA)進行，其程序如下:一個循環(huán)，在94°C進行2分鐘；9個循環(huán)，每個在94°C進行15秒，68°C進行30秒，每循環(huán)降低1°C，和68°C進行I分45秒；24個循環(huán)，每個在94°C進行15秒，68°C進行30秒，和68°C進行I分45秒；和在68°C延伸7分鐘。[0407]將在第一PCR過程中獲得的PCR產(chǎn)物用其相應的引物重新擴增，即將0.5iU的第一PCR反應物轉(zhuǎn)移至含有相同濃度的引物、dNTP、DNA聚合酶，和緩沖液的第二20UI混合物。第二PCR使用DYAD?ThermalCycler進行,其程序如下:一個循環(huán)，在94°C進行2分鐘；34個循環(huán)，每個在94°C進行15秒，58°C進行30秒，和68°C進行I分45秒；和在68°C最終延伸7分鐘。[0408]將在第二擴增過程中獲得的PCR產(chǎn)物通過使用40mMTris堿-20mM乙酸鈉-1mMEDTA二鈉鹽(TAE)緩沖液的1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。將大小范圍為200至1200個核苷酸的單個條帶從凝膠切出并使用GFX?PCRDNAandGelBandPurificationKit(GEHealthcare,HillerodDenmark)根據(jù)生產(chǎn)商的指示進行純化。將純化的DNA樣品用用于擴增的引物直接測序。序列通過SeqManv7.2.1(DNAstar,Madison,WI,USA)匯編為重疊群，將重疊群用作模板遵循GENEWALKINGSPEEDUP?Kit實驗方案(Seegene，Inc.，Seoul,Korea)中所述的限制條件設計下示的GeneWalking引物?！緳?quán)利要求】1.一種具有纖維二糖水解酶活性的分離的多肽，其選自下組:(a)多肽，其與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少90%序列同一性；或多肽，其與SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少80%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少90%序列同一性；或多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列或其基因組DNA序列具有至少80%序列同一性；(C)SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的成熟多肽的包含一個或多個(幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體；和(d)(a)、(b)或(c)的多肽的具有纖維二糖水解酶活性的片段。2.權(quán)利要求1的多肽，其與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少90%，例如至少92%，至少95%,至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性。3.權(quán)利要求1的多肽，其與SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少80%，例如至少85%，至少87%,至少90%，至少92%，至少95%，例如至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一,I"生。4.權(quán)利要求1-3任一項的多肽，其包含或組成為SEQIDNO:2或SEQIDN0.4。5.權(quán)利要求4的多肽，其包含或組成為SEQIDN0:2或SEQIDN0.4的成熟多肽。6.權(quán)利要求5的多肽，其中所述成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸19至455或SEQIDNO:4的氨基酸26至537。7.一種分離的多肽，其包含催化域，所述催化域選自下組:(a)催化域，其與SEQIDN0:2的催化域具有至少90%序列同一性；或催化域，其與SEQIDNO:4的催化域具有至少80%序列同一性；(b)催化域，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:1的催化域編碼序列具有至少90%序列同一性；或催化域，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:3的催化域編碼序列具有至少80%序列同一性；(C)SEQIDN0:2或SEQIDNO:4的催化域的包含一個或多個(幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入的催化域變體；和(d)(a)、(b)或(c)的催化域的具有纖維二糖水解酶活性的片段。8.權(quán)利要求7的多肽，其包含或組成為SEQIDN0:2或SEQIDNO:4的催化域。9.權(quán)利要求8的多肽，其中所述催化域是SEQIDNO:2的氨基酸19至455或SEQIDNO:4的氨基酸26至465。10.權(quán)利要求7-9任一項的多肽，其進一步包含纖維素結(jié)合域。11.一種組合物，其包含權(quán)利要求1-10任一項的多肽。12.—種分離的多核苷酸,其編碼權(quán)利要求1-10任一項的多肽。13.—種核酸構(gòu)建體或表達載體,其包含權(quán)利要求12的多核苷酸,所述多核苷酸可操作地連接于一個或多個(幾個)調(diào)控序列，所述調(diào)控序列指導所述多肽在表達宿主中的產(chǎn)生。14.一種重組宿主細胞，其包含權(quán)利要求12的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地連接于一個或多個調(diào)控序列，所述調(diào)控序列指導多肽的產(chǎn)生。15.一種產(chǎn)生具有纖維二糖水解酶活性的多肽的方法，其包括:(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求14的重組宿主細胞；和(b)回收所述多肽。16.一種降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，其包括:在權(quán)利要求1-10中任一項的具有纖維二糖水解酶活性的多肽存在下用酶組合物處理所述纖維素材料。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述纖維素材料經(jīng)過預處理。18.權(quán)利要求16或17的方法，進一步包括回收經(jīng)降解的纖維素材料。19.一種產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括:(a)在權(quán)利要求1-10中任一項的具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽存在下，用酶組合物糖化纖維素材料；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(C)從發(fā)酵回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。20.權(quán)利要求19的方法，其中步驟(a)和(b)在同步糖化和發(fā)酵中同時進行。21.權(quán)利要求19或20的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是醇、有機酸、酮、氨基酸或氣體。22.一種發(fā)酵纖維素材料的方法，其包括:用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵纖維素材料，其中所述纖維素材料是在權(quán)利要求1-10中任一項的具有纖維二糖水解酶活性的多肽的存在下用酶組合物糖化的。`【文檔編號】C12N9/42GK103534348SQ201280015147【公開日】2014年1月22日申請日期:2012年1月26日優(yōu)先權(quán)日:2011年1月26日【發(fā)明者】M.D.莫蘭特,P.哈里斯申請人:諾維信公司,諾維信股份有限公司