專利名稱：一種提取純化小麥胚芽脂肪酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提取純化植物脂肪酶的方法，特別是指純化小麥胚芽脂肪酶的方法，屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
脂肪酶(EC 3.1.1. 3)是一種重要的水解酶類，在食品、藥品、化工等行業(yè)得到廣泛應用。脂肪酶種類很多，其中絕大多數(shù)來自于微生物，少數(shù)來自于動物，而極少數(shù)來自于植物。小麥胚芽脂肪酶是一種存在于小麥中的脂肪酶，由于其熱穩(wěn)定性以及在小麥發(fā)芽中的重要性，為大家所關(guān)注。一般認為小麥胚芽當中富含多種酶類，有α-淀粉酶、脂肪酶、酯酶、脂肪氧化酶和蛋白酶等，其中主要是脂肪酶以及酯酶；尤其是在發(fā)芽后所顯示的酶活主要是脂肪酶酶活。小麥胚芽脂肪酶的存在對小麥胚芽的保藏是十分不利的，它能短時間內(nèi)水解油月旨，使其脂肪酸值大幅度升高，引起麥胚酸敗變質(zhì)；同時，微生物生長繁殖快，也會導致麥胚出現(xiàn)結(jié)塊、霉變和發(fā)酵等變質(zhì)現(xiàn)象。所以，目前對小麥胚芽脂肪酶的研究大多集中在該酶在小麥胚芽中穩(wěn)定性以及如何快速降低其水解活性，防止麥胚酸化變質(zhì)。對小麥胚芽脂肪酶用于催化生物反應過程研究相對較少，主要集中在手性拆分和油脂工業(yè)方面。據(jù)報道，小麥胚芽脂肪酶在立體選擇性方面并不符合Kazlauskas規(guī)則，呈現(xiàn)為反K氏規(guī)則，是現(xiàn)有唯一天然來源的反K氏規(guī)則的脂肪酶，這在手性拆分和脂肪酶催化分子機理解析方面具有重要的意義。在油脂催化方面，目前認為，小麥胚芽脂肪酶對短鏈的甘油三酯具有較好的催化作用?？傮w而言，相對于其它脂肪酶，小麥胚芽脂肪酶具有來源廣泛，可以從小麥加工廢棄物麥胚中提取獲得，如能利用，將能獲得一種質(zhì)優(yōu)價廉適合大宗油脂產(chǎn)品加工的脂肪酶。相較微生物來源脂肪酶，小麥胚芽脂肪酶是植物脂肪酶，植物中含有多種色素、雜蛋白和糖類物質(zhì)等，因此分離純化特別困難；而小麥胚芽脂肪酶粗酶具有穩(wěn)定性差和專一性差等缺點，因此如不分離純化將會限制了小麥胚芽脂肪酶的進一步應用。長期以來，硫酸銨沉淀、透析、離子交換和凝膠層析等傳統(tǒng)方法被用于小麥胚芽脂肪酶的提取與制備?？傮w而言，由于粗酶中雜質(zhì)較多，各自的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)各不相同，目前尚無成熟的分離純化小麥胚芽脂肪酶的報道。因此需要提供一種快速分離純化小麥胚芽脂肪酶的方法，以達到高回收率，收獲高純度的小麥胚芽脂肪酶。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服小麥胚芽脂肪酶粗酶穩(wěn)定性差和專一性差的缺點，提出一種高效提取純化小麥胚芽脂肪酶的方法。該方法通過設計合成一種親和配體，輔以常見的分離手段，經(jīng)過簡單的幾步反應就達到了分離純化的目的。在分離純化過程中，反應條件溫和，所用試劑毒性均較低，對人體和環(huán)境危害小，易于放大。本發(fā)明的技術(shù)方案一種提取純化小麥胚芽脂肪酶的方法， 具體包括如下幾個步驟(I)高效提取粗酶將小麥胚芽機械粉碎至100目，然后用含有Triton X-100，吐溫-20，吐溫-80或SDS中的一種表面活性劑的磷酸鈉緩沖液；以小麥胚芽緩沖液質(zhì)量比
O.3-1 I混合，其中磷酸鈉緩沖液ρΗ=7.0，混合振蕩30min，控制與混合液質(zhì)量比1:1加入正己烷溶解除油，12000rpm室溫離心IOmin后取上清，得粗酶液。(2)硫酸銨沉淀和濃縮將提取的粗酶液邊攪拌邊加入固體硫酸銨，使其中硫酸銨濃度為10%_15%，搖勻后靜置，然后在轉(zhuǎn)速4000rpm下離心lOmin，棄去上清，將蛋白質(zhì)沉淀用蒸餾水溶解得到鹽析液，回收率大于90%，純化倍數(shù)1. 40 ;選用過濾分子量為10000 -15000Da的超濾膜對脂肪酶鹽析液進行濃縮，獲得超濾液。(3)離子交換層析采用 DEAE-sepharose, DEAE-纖維素，Q-sepharose 或superQ-sepharose中的一種離子交換柱層析純化步驟(2)所得超濾液中的脂肪酶，較佳的米用 DEAE-sepharose 或 Q-sepharose ； 裝柱后并用緩沖液平衡；將超濾液上樣，上樣量為柱體積的2 — 3倍，以含有l(wèi)mol/L的NaCl的pH 8的0. 05 mol/L磷酸鈉緩沖液線性或梯度洗脫，流速為1_5 mL/min，出現(xiàn)兩個洗脫峰；收集活性峰，用透析袋濃縮。(4)合成親和介質(zhì)小麥胚芽脂肪酶親和配體是苯甲嘧啶、胞嘧啶或精氨酸中的一種；層析介質(zhì)是Sepharose、殼聚糖、娃膠或陶瓷顆粒中的一種,較佳的采用Sepharose或娃膠；
小麥胚芽脂肪酶親和配體和由環(huán)氧氯丙烷活化后的層析介質(zhì)通過和乙二胺、1，3-丙二胺、2-羥基-1，3丙二胺、1，4-丁二胺、1，6-己二胺中的一種作為間隔臂進行連接，合成親和介質(zhì)；
(5)吸附和洗脫將經(jīng)過離子交換后步驟(3)收集的酶液用步驟(4)合成的親和介質(zhì)進行親和吸附，親和吸附的條件為pH值6. 5^8. O,電導率為5-10 ms/cm ;然后采用清洗液沖洗所述脂肪酶親和介質(zhì)，清洗液沖洗條件為PH 6. 5 7. 5，電導率5 10 ms/cm ;最后用洗脫緩沖液洗脫親和介質(zhì)上吸附的酶，洗脫條件為PH 3. 0-4. 5，較佳的在pH為3. 5時收集得到純酶。所得純酶,立即用0.1M Tris溶液中和至中性。本發(fā)明的有益效果
1.本發(fā)明通過采用小麥胚芽脂肪酶抑制劑核心構(gòu)件嘧啶的結(jié)構(gòu)類似物作為層析用親和配體，與層析介質(zhì)連接合成親和介質(zhì)，可快速高效純化，適于大規(guī)模推廣應用；
2.本發(fā)明通過輔以常規(guī)層析手段使得小麥胚芽脂肪酶的純化效率顯著增加，具有較大工業(yè)應用潛力，體現(xiàn)出較大的經(jīng)濟效益。
具體實施例方式為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實施例詳細說明。實施例1 :小麥胚芽脂肪酶粗酶的提取
將新鮮小麥胚芽50g通過機械粉碎至100目，然后用含有5% (v/v)吐溫-20的pH
7.O的磷酸鈉緩沖液50mL混合振蕩30min,加入IOOmL正己燒溶解,振蕩IOmin,重復一次，12000rpm室溫離心IOmin后取上清,得粗酶液。實施例2 :硫酸銨沉淀和濃縮
將提取的粗酶液邊攪拌邊加入固體硫酸銨，使其中硫酸銨飽和濃度為10%-15%，搖勻后靜置5min，然后在轉(zhuǎn)速4000rpm下離心lOmin，棄去上清，將蛋白質(zhì)沉淀用蒸餾水溶解得到鹽析液，回收率大于90%，純化倍數(shù)1. 40 ;選用過濾分子量為10000 - 15000Da的超濾膜對脂肪酶鹽析液進行濃縮脫鹽。獲得超濾液。實施例3 :離子交換層析
采用DEAE-sepharose離子交換柱層析純化超濾液中的脂肪酶,裝柱后并用pH 8的
O.05 mol/L磷酸鈉緩沖液平衡；將超濾液上樣,上樣量為柱體積的2倍，以含有l(wèi)mol/L的NaCl的pH 8的O. 05 mol/L磷酸鈉緩沖液線性洗脫，流速為2mL/min，出現(xiàn)兩個洗脫峰；根據(jù)洗脫峰的電泳實驗，確定并收集活性峰，用透析袋濃縮。實施例4 :層析介質(zhì)Sepharose-精氨酸的合成及應用
Sepharose CL 4 B (50 g)用500mL體積的去離子水洗漆,抽干成濕餅狀；懸浮于50 mL活化緩沖液(0.8 M NaOH, 20% 二甲亞砜，10%環(huán)氧氯丙烷，0. 5mg/mL硼氫化鈉)40°C搖床震蕩2. 5 h，然后倒入玻璃磨砂漏斗中，在抽濾下經(jīng)過每次500mL體積的蒸餾水洗滌，直到洗漆液pH至中性,在抽干成濕餅狀?；罨腟epharose CL 4 B介質(zhì)懸浮于500 mL、0.1MNaOH溶液中，加入20 mL己二胺，凝膠在攪拌(200 rpm)下30 °C恒溫12 h，用去離子水清洗。將所得之己二胺-Sepharose CL 4 B (50 g)用500mL體積的去離子水洗漆,抽干成濕餅狀；懸浮于50 mL活化緩沖液(0.8 M NaOH, 20% 二甲亞砜，10%環(huán)氧氯丙烷，0. 5mg/mL硼氫化鈉)40°C搖床震蕩2. 5 h，然后倒入玻璃磨砂漏斗中，在抽濾下經(jīng)過每次500mL體積的蒸餾水洗滌，直到洗滌液PH至中性，在抽干成濕餅狀。IOg精氨酸溶于0.1M NaOH溶液中與上述己二胺-Sepharose CL 4 B介質(zhì)在60 °C恒溫振蕩12 h。反應完畢，用500 mL去離子水充分洗滌，抽干，得到親和介質(zhì)精氨酸-己二胺-Sepharose CL 4 B。( I)介質(zhì)最大吸附量的確定
確定介質(zhì)的最大吸附量。取小麥胚芽脂肪酶標準品(sigma)，用去離子水稀釋至濃度為 100，200，300，400，500，600，700，800，900 Pg/mL，調(diào)節(jié) pH 值為 7. 0，分別加入 0. 01 g濕親和介質(zhì)，4 1充分振蕩2 h后，測定上清中的酶濃度，計算介質(zhì)的最大吸附量；達到80. 5±1. 9 mg/g 介質(zhì)。(2)特異性吸附的驗證
考察該介質(zhì)對小麥胚芽脂肪酶的特異性識別，分別取Img小麥胚芽脂肪酶標品(sigma)與20mg麥胚蛋白(提取液采用20mM PBS, pH 7. 0)混合，與該組介質(zhì)進行吸附，使用pH 7. O的20mM PBS清洗，最后用0.1 M HAc洗脫，測定酶活、含量并進行電泳分析，特異性吸附含量達到3.4μ8/ιΛ。蛋白含量測定使用Bradford法。小麥胚芽脂肪酶水解酶活性采用橄欖油乳化法。實施例5 :親和介質(zhì)娃膠-苯甲喃唳的合成及應用
硅膠(50 g)用500mL體積的去離子水洗滌，抽干成濕餅狀；懸浮于50 mL活化緩沖液(0.8 M NaOH, 20% 二甲亞砜，10%環(huán)氧氯丙烷，0. 5mg/mL硼氫化鈉)40°C搖床震蕩2. 5 h，然后倒入玻璃磨砂漏斗中，在抽濾下經(jīng)過每次500mL體積的蒸餾水洗滌，直到洗滌液pH至中性，在抽干成濕餅狀?；罨墓枘z介質(zhì)懸浮于500 mL 0.1M NaOH溶液中，加入20 mL 1,6-己二胺，凝膠在攪拌(200 rpm)下30 °C恒溫12 h，用去離子水清洗。己二胺-硅膠(50 g)用500mL體積的去離子水洗滌，抽干成濕餅狀；懸浮于50 mL活化緩沖液(0.8 M NaOH, 20% 二甲亞砜，10%環(huán)氧氯丙烷，O. 5mg/ml硼氫化鈉)40 °C搖床震蕩2. 5 h，然后倒入玻璃磨砂漏斗中，在抽濾下經(jīng)過每次500mL體積的蒸餾水洗滌，直到洗滌液pH至中性，在抽干成濕餅狀。IOg苯甲嘧啶與己二胺-硅膠介質(zhì)在O.1M NaOH溶液中60°C恒溫12 h。反應完畢，用500 mL去離子水充分洗滌，抽干，得親和介質(zhì)苯甲嘧啶-己二胺-硅膠。(I)介質(zhì)最大吸附量的確定
同實施例4。吸附量達到103 ±2. 8 mg/g介質(zhì)。( 2)特異性吸附的驗證
同實施例4，特異性吸附為2. 9 μ g/mL。實施例6吸附和洗脫
將小麥胚芽脂肪酶經(jīng)過實施例1，2，3制備得到粗酶液，再用實施例5制得的硅膠一苯甲嘧啶進行親和吸附，親和吸附的條件為PH值6. 5，電導率為5-10 ms/cm;然后采用
O.lmol/L NaCl清洗液沖洗所述脂肪酶親和介質(zhì),清洗液沖洗所述酶親和介質(zhì)的清洗條件為pH值7. 0，電導率5 10 ms/cm ;最后用O. lmol/L NaOH洗脫緩沖液洗脫所述親和介質(zhì)上吸附的酶，洗脫條件為PH值3. 5，得到純酶。詳細結(jié)果見表I表I
權(quán)利要求
1.一種提取純化小麥胚芽脂肪酶的方法，其特征在于包括以下步驟 (O高效提取粗酶將小麥胚芽機械粉碎至100目，然后用含有表面活性劑、pH=7. O的磷酸鈉緩沖液混合，小麥胚芽緩沖液質(zhì)量比O. 3-1 1，混合振蕩30min，控制與混合液質(zhì)量比1:1加入正己烷溶解除油，12000rpm室溫離心IOmin后取上清，得粗酶液； (2)硫酸銨沉淀和濃縮將提取的粗酶液邊攪拌邊加入固體硫酸銨，使其中硫酸銨濃度為10% — 15%，搖勻后靜置，然后在轉(zhuǎn)速4000rpm下離心lOmin，棄去上清，將蛋白質(zhì)沉淀用蒸餾水溶解得到鹽析液，回收率大于90% ;選用過濾分子量為10000 - 15000Da的超濾膜對脂肪酶鹽析液進行濃縮，獲得超濾液； (3)離子交換層析采用離子交換柱層析純化步驟(2)所得超濾液中的脂肪酶，裝柱后，用pH 8的O. 05 mol/L磷酸鈉緩沖液平衡；將超濾液上樣，上樣量為柱體積的2 — 3倍，以含有l(wèi)mol/L的NaCl的pH 8的O. 05 mol/L磷酸鈉緩沖液線性或梯度洗脫，流速為1_5mL/min,出現(xiàn)兩個洗脫峰，收集活性峰，用透析袋濃縮； (4)合成親和介質(zhì)小麥胚芽脂肪酶親和配體為脂肪酶抑制劑嘧啶的結(jié)構(gòu)類似物，層析介質(zhì)是Sepharose、殼聚糖、娃膠或陶瓷顆粒中的一種；小麥胚芽脂肪酶親和配體和由環(huán)氧氯丙烷活化后的層析介質(zhì)通過和乙二胺、1，3-丙二胺、2-羥基-1，3丙二胺、1，4- 丁二胺、1，6-己二胺中的一種作為間隔臂進行連接，合成親和介質(zhì)； (5)吸附和洗脫將經(jīng)過離子交換后步驟(3)收集的酶液用步驟(4)合成的親和介質(zhì)進行親和吸附，親和吸附的條件為PH 6. 5 8.0，電導率為5-10 ms/cm ;然后采用清洗液沖洗吸附脂肪酶的親和介質(zhì)，清洗液沖洗條件為PH 6. 5 7. 5，電導率5 10 ms/cm ;最后用洗脫緩沖液洗脫親和介質(zhì)上吸附的酶，洗脫條件為PH 3. 0-4. 5，得到純酶，立即用0.1M Tris溶液中和至中性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中步驟(I)所述的表面活性劑為TritonX-100,吐溫-20，吐溫-80或SDS中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取純化小麥胚芽脂肪酶的方法，其特征在于，在步驟(3)中，所述離子交換柱選用DEAE-sepharose, DEAE-纖維素，Q-sepharose或superQ-sepharose 中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述提取純化小麥胚芽脂肪酶的方法，其特征在于，步驟(4)所述的親和配體，嘧啶的結(jié)構(gòu)類似物是苯甲嘧啶、胞嘧啶或精氨酸中的一種。
全文摘要
一種提取純化小麥胚芽脂肪酶的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明包括以下步驟(1)高效提取粗酶確定從麥胚中提取粗酶的最佳方法；(2)硫酸銨沉淀和濃縮將提取的粗酶液通過硫酸胺沉淀，并選用超濾膜對酶的鹽析液進行濃縮，獲得超濾液；(3)離子交換層析采用離子交換層析純化超濾液中的脂肪酶，得到較純的小麥胚芽脂肪酶；(4)制備小麥胚芽脂肪酶的親和介質(zhì)；(5)吸附和洗脫得到純酶，純度達到95%。本發(fā)明所提供的小麥胚芽脂肪酶高效提取方法，回收率高，純度高。
文檔編號C12N9/20GK103013951SQ20121057780
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月27日
發(fā)明者夏小樂, 辛瑜, 陳金花, 張玲, 王武 申請人:江南大學