半固體培養(yǎng)基及其制備方法和雜交瘤細(xì)胞篩選方法

半固體培養(yǎng)基及其制備方法和雜交瘤細(xì)胞篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種半固體培養(yǎng)基，其包括甲基纖維素溶液、2×1640培養(yǎng)基、L-谷氨酰胺溶液、β-巰基乙醇溶液、胎牛血清、青霉素與鏈霉素混合溶液、HAT溶液及抗原包被的納米金顆粒溶液。該半固體培養(yǎng)基可直接用于雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)和篩選，不僅能減少培養(yǎng)過(guò)程總亞克隆的次數(shù)，在很大程度上降低勞動(dòng)強(qiáng)度，而且可以使單個(gè)細(xì)胞株之間生長(zhǎng)空間相對(duì)獨(dú)立，減少克隆株與克隆株之間的接觸抑制備用，同時(shí)通過(guò)引入包被有抗原的納米金顆粒，使得能一步篩選到分泌目的抗體的單抗隆細(xì)胞株，進(jìn)一步節(jié)省了單克隆篩選的時(shí)間。此外，本發(fā)明還涉及一種半固體培養(yǎng)基的制備方法以及使用該半固體培養(yǎng)基的雜交瘤細(xì)胞篩選方法。
【專利說(shuō)明】半固體培養(yǎng)基及其制備方法和雜交瘤細(xì)胞篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞工程領(lǐng)域，尤其是涉及一種半固體培養(yǎng)基及其制備方法和雜交瘤細(xì)胞篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]抗體主要是由B淋巴細(xì)胞合成，每個(gè)B淋巴細(xì)胞均含有合成一種抗體的遺傳基因。當(dāng)機(jī)體受刺激時(shí)，抗原分子上的許多抗原決定簇分別激活各個(gè)具有不同基因的B淋巴細(xì)胞。將激活的單一 B淋巴細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，得到由單細(xì)胞經(jīng)分裂增殖而形成細(xì)胞群，稱為單克隆。單克隆細(xì)胞合成針對(duì)一種抗原決定簇的抗體，即單克隆抗體(簡(jiǎn)稱單抗)。
[0003]1975年德國(guó)學(xué)者Kohler和英國(guó)學(xué)者M(jìn)ilstein將小鼠骨髓瘤細(xì)胞核經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞在體外進(jìn)行兩種細(xì)胞的融合，形成雜交瘤(hybridoma)細(xì)胞，這種細(xì)胞繼承兩種親代細(xì)胞的特性，既具有骨髓瘤細(xì)胞無(wú)限繁殖的特性，又具有合成和分泌抗體的能力。用這種來(lái)源于單個(gè)融合細(xì)胞增殖的細(xì)胞群，可制備針對(duì)一種抗原決定簇的特異性單克隆抗體。時(shí)至今日單克隆抗體技術(shù)被不斷日臻完善，但有一個(gè)問(wèn)題一直困擾著單抗制備的研究人員和制約著單抗的通量化和規(guī)?；a(chǎn)，即如何減少單抗制備過(guò)程中的人力成本，縮短單抗制備所需要的時(shí)間，從而降低單個(gè)單抗制備的成本。
[0004]雜交瘤細(xì)胞所分泌的抗體-單克隆抗體是目前認(rèn)為的最為成熟與可靠的分子識(shí)別工具，被廣 泛應(yīng)用于生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。然而由于雜交瘤細(xì)胞株的制備周期長(zhǎng)，所需的勞動(dòng)強(qiáng)度高，已經(jīng)成為制約雜交瘤細(xì)胞制備的重要瓶頸之一。單抗制備過(guò)程中最重要也是最為需要人力資源的一步是分泌特異性抗體的篩選工作，好的篩選方案是單克隆抗體制備成功與否的關(guān)鍵，傳統(tǒng)通用的篩選方法是通過(guò)固相酶聯(lián)免疫(ELISA)法進(jìn)行篩選，從成千上萬(wàn)個(gè)融合后的雜交瘤細(xì)胞中篩選分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，隨著制備過(guò)程的進(jìn)行，有些不穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞失去了分泌特異性抗體的功能，在制備的末期甚至?xí)ト康姆置谔禺愋钥贵w的雜交瘤，導(dǎo)致單抗制備的失敗。幾十年來(lái)在篩選的方法上也存在眾多的改進(jìn)，如通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)雜交瘤細(xì)胞所分泌的抗體進(jìn)行篩選，可以篩選出親和力較高的抗細(xì)菌膜抗原的單抗，近年來(lái)，蛋白芯片技術(shù)的不斷成熟也為單抗的篩選提供了一些新的方法，Sawyer利用蛋白芯片結(jié)合多蛋白的復(fù)合免疫，進(jìn)行單抗制備，取得了較好的結(jié)果。但所有這些改進(jìn)，對(duì)于篩選中工作量的降低都不明顯。
[0005]單抗制備過(guò)程中的另外一個(gè)需要工作量較大的部分是克隆化培養(yǎng)，常用的方法是有限稀釋法，由于雜交瘤細(xì)胞的基因組的不穩(wěn)定性，使得其在后續(xù)的培養(yǎng)中，會(huì)發(fā)生染色體丟失現(xiàn)象，即使雜交瘤細(xì)胞在建株后，仍可能會(huì)丟失編碼抗體的染色體，使雜交瘤細(xì)胞失去分泌特異性抗體的能力。因此，在單抗制備初期，人們總是盡可能多的將所有陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，以期最大限度的保留分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，從而造成了巨大工作量。有限稀釋法不僅勞動(dòng)強(qiáng)度大，周期長(zhǎng)，而且也需要很豐富的克隆篩選經(jīng)驗(yàn)，嚴(yán)格把握好亞克隆的時(shí)間，操作繁瑣。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]基于此，有必要提供一種使雜交瘤細(xì)胞篩選培養(yǎng)周期較短、操作簡(jiǎn)便的半固體培養(yǎng)基及其制備方法。
[0007]—種半固體培養(yǎng)基，包括如下體積份數(shù)的各組分:
[0008]濃度為0.4g/ml的甲基纖維素溶液10 ；
[0009]pH 7.0~7.4 的 2 X 1640 培養(yǎng)基18 ；
[0010]濃度為lmol/1的L-谷氨酰胺溶液0.16 ；
[0011]濃度為lmmol/1的β -巰基乙醇溶液0.5 ；
[0012]胎牛血清10 ；
[0013]10000單位/ml的青霉素與10000 μ g/ml鏈霉素混合溶液 0.4 ；[0014]50 X HAT 溶液0.8 ;及
[0015]抗原包被的納米金顆粒溶液0.1 ；
[0016]其中，每毫升所述抗原包被的納米金顆粒溶液是通過(guò)將Iyg的抗原-PeG6-CONHNH2、Iml的納米金顆粒溶液及Immol的mPEG_SH分別室溫震蕩孵育后20min后，2500Xg 4°C離心30min，用I XPBS緩沖液稀釋至990 μ 1，再加入10 μ I的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的PEG溶液制備得到；其中，所述納米金顆粒溶液是向沸騰的50ml 0.254mM的氯金酸溶液逐滴加入0.94ml 38.8mM的檸檬酸三鈉溶液繼續(xù)煮沸5min后冷卻而成。
[0017]。
[0018]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述甲基纖維素為4000cp的甲基纖維素。
[0019]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述納米金顆粒的粒徑在l(Tl8nm之間。
[0020]一種半固體培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟:
[0021]分別制備濃度為0.4g/ml的甲基纖維素溶液、pH 7.0-7.4的2X 1640培養(yǎng)基、濃度為lmol/1的L-谷氨酰胺溶液及濃度為lmmol/1的β -巰基乙醇溶液；
[0022]向氯金酸溶液中加入檸檬酸三鈉溶液進(jìn)行加熱還原反應(yīng)，制備濃度為0.25mmol/l的納米金顆粒溶液；
[0023]向抗原溶液中加入Na2HPO4溶液，得到抗原混合液，再向所述抗原混合液中加入NaIO4溶液，室溫下黑暗環(huán)境中孵育30分鐘后加入PBS緩沖液終止反應(yīng)，然后加入PeG6-CONHNH2溶液，孵育I小時(shí)后向得到的混合液中加入HEPES溶液，混勻后用10MWC0的超濾管以2000 X g的轉(zhuǎn)速在4°C下離心處理至所述超濾管中余留25%溶液，用HEPES重懸超濾管中余留的溶液，制備濃度為100 μ g/ml的抗原-PeG6-CONHNH2溶液；
[0024]按照體積比為1:10的比例將所述抗原-PeG6-CONHNH2溶液加入至所述納米金顆粒溶液中，室溫下震蕩孵育20分鐘后加入與所述抗原-PeG6-CONHNH2溶液等體積的濃度為10mol/l的mPEG-SH溶液，室溫下震蕩20分鐘后轉(zhuǎn)入離心管中以2500rpm的轉(zhuǎn)速在4°C下離心處理，棄上清，用9.9倍于所述抗原-PeG6-CONHNH2溶液體積的IXPBS緩沖液重懸沉淀，再補(bǔ)加入0.1倍于所述抗原-PeG6-CONHNH2溶液的質(zhì)量濃度為20%的PEG溶液，得到抗原包被的納米金顆粒溶液；
[0025]向所述甲基纖維素溶液中依次加入所述2X 1640培養(yǎng)基、所述L-谷氨酰胺溶液、所述β -巰基乙醇溶液、胎牛血清、10000單位/ml的青霉素與10000 μ g/ml鏈霉素混合溶液、50XHAT溶液及所述抗原包被的納米金顆粒溶液，4°C下攪拌均勻得到所述半固體培養(yǎng)基，其中，所述甲基纖維素溶液、所述2X 1640培養(yǎng)基、所述L-谷氨酰胺溶液、所述胎牛血清、所述10000單位/ml的青霉素與10000 μ g/ml鏈霉素混合溶液、所述50 XHAT溶液及所述抗原包被的納米金顆粒溶液的體積比為10:18:0.16:0.5:10:0.4:0.8:0.10
[0026]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述甲基纖維素為4000cp的甲基纖維素。
[0027]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述納米金顆粒的粒徑在l(Tl8nm之間。
[0028]此外，還有必要提供一種周期較短、操作簡(jiǎn)便的雜交瘤細(xì)胞篩選方法。
[0029]一種雜交瘤細(xì)胞的篩選方法，包括如下步驟:
[0030]按照上述半固體培養(yǎng)基的制備方法制備所述半固體培養(yǎng)基；
[0031]將融合后的雜交瘤細(xì)胞與37°C下預(yù)培養(yǎng)16~24小時(shí)后轉(zhuǎn)入所述半固體培養(yǎng)基中，混勻后，加入堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子5ng/ml和雜交瘤細(xì)胞融合克隆因子15ul/ml，混勻，分裝在37°C、5%體積的CO2條件下培養(yǎng)；
[0032]培養(yǎng)疒14天后，待長(zhǎng)出肉眼可見的單克隆菌落時(shí)，在體式顯微鏡下用微量移液器將具有顏色反應(yīng)的克隆株從該培養(yǎng)皿中移至多微孔板中用液體培養(yǎng)的方法放大培養(yǎng)，每孔移入I個(gè)克隆進(jìn)行細(xì)胞凍存培養(yǎng)。
[0033]上述半固體培養(yǎng)基可直接用于雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)和篩選，不僅能減少培養(yǎng)過(guò)程總亞克隆的次數(shù)，在很大程度上降低勞動(dòng)強(qiáng)度，而且可以使單個(gè)細(xì)胞株之間生長(zhǎng)空間相對(duì)獨(dú)立，減少克隆株與克隆株 之間的接觸抑制備用，同時(shí)通過(guò)引入包被有抗原的納米金顆粒，使得能一步篩選到分泌目的抗體的單抗隆細(xì)胞株，進(jìn)一步節(jié)省了單克隆篩選的時(shí)間。甲基纖維素介質(zhì)能克服瓊脂糖熔點(diǎn)高的缺點(diǎn)，在室溫下即可操作，不用擔(dān)心凝固問(wèn)題。納米金顆粒的制備簡(jiǎn)單，顆粒大小可調(diào)。結(jié)合納米金包被的抗原進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的篩選，能更大程度的縮短篩選周期，降低勞動(dòng)強(qiáng)度。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0034]圖1為一實(shí)施方式半固體培養(yǎng)基的制備流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0035]下面主要結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)半固體培養(yǎng)基及其制備方法和雜交瘤細(xì)胞的篩選方法作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0036]一實(shí)施方式的半固體培養(yǎng)基，包括如下體積份數(shù)的各組分:
[0037]濃度為0.4g/ml的甲基纖維素溶液10 ；
[0038]pH 7.0~7.4 的 2 X 1640 培養(yǎng)基18 ；
[0039]濃度為lmol/1的L-谷氨酰胺溶液0.16 ；
[0040]濃度為lmmol/1的β -巰基乙醇溶液0.5 ；
[0041]胎牛血清10 ；
[0042]10000單位/ml的青霉素與10000 μ g/ml鏈霉素混合溶液0.4 ；
[0043]50XHAT 溶液0.8 ;及
[0044]抗原包被的納米金顆粒溶液0.1 ；
[0045]其中，每毫升所述抗原包被的納米金顆粒溶液是通過(guò)將Iyg的抗原-PeG6-CONHNH2、Iml的納米金顆粒溶液及Immol的mPEG-SH分別室溫震蕩孵育后20min后，2500Xg 4°C離心30min，用I XPBS緩沖液稀釋至990 μ 1，再加入10 μ I的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的PEG溶液制備得到；其中，所述納米金顆粒溶液是向沸騰的50ml 0.254mM的氯金酸溶液逐滴加入0.94ml 38.8mM的檸檬酸三鈉溶液繼續(xù)煮沸5min后冷卻而成。
[0046]在本實(shí)施方式中，甲基纖維素優(yōu)選為4000cp的甲基纖維素，可以理解，在其他實(shí)施方式中還可以選用其他粘度的甲基纖維素，如3000cp的甲基纖維素等。優(yōu)選的納米金顆粒的粒徑在l(Tl8nm之間,在其他實(shí)施方式中，納米金顆粒的粒徑只要不大于50nm即可。
[0047]如圖1所示，一實(shí)施方式的半固體培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟:
[0048] 步驟SI 10，分別制備濃度為0.4g/ml的甲基纖維素溶液、pH 7.0~7.4的2 X 1640培養(yǎng)基、濃度為Im ol/l的L-谷氨酰胺溶液及濃度為Im mol/1的β-巰基乙醇溶液。
[0049]步驟S120，制備納米金顆粒溶液:向氯金酸溶液中加入檸檬酸三鈉溶液進(jìn)行加熱還原反應(yīng)，制備濃度為0.25mmol/l的納米金顆粒溶液。
[0050]納米金顆粒的粒徑可控,在本實(shí)施方式中，納米金顆粒的粒徑不大于50nm。
[0051 ]步驟 S130，制備抗原-PeG6-CONHNH2 溶液:
[0052]向抗原溶液中加入Na2HPO4溶液，得到抗原混合液，再向抗原混合液中加入NaIO4溶液，室溫下黑暗環(huán)境中孵育30分鐘后加入PBS緩沖液終止反應(yīng)，然后加入PeG6-CONHNH2溶液，孵育I小時(shí)后向得到的混合液中加入HEPES溶液，混勻后用10MWC0的超濾管以2000 X g的轉(zhuǎn)速在4°C下離心處理至超濾管中余留25%溶液，用HEPES重懸超濾管中余留的溶液，制備濃度為100 μ g/ml的抗原-Peg6-CONHNH2溶液。
[0053]PeG6-CONHNH2作為連接劑與抗原連接用于后續(xù)包被納米金顆粒。
[0054]步驟S140，制備抗原包被的納米金顆粒溶液:
[0055]按照體積比為1:10的比例將抗原-PeG6-CONHNH2溶液加入至納米金顆粒溶液中，室溫下震蕩孵育20分鐘后加入與抗原-PeG6-CONHNH2溶液等體積的濃度為lOmol/Ι的mPEG-SH溶液，室溫下震蕩20分鐘后轉(zhuǎn)入離心管中以2500rpm的轉(zhuǎn)速在4°C下離心處理，棄上清，用9.9倍于抗原-PeG6-CONHNH2溶液體積的I XPBS緩沖液重懸沉淀，再補(bǔ)加入0.1倍于抗原-PeG6-CONHNH2溶液的質(zhì)量濃度為20%的PEG溶液，得到抗原包被的納米金顆粒溶液。
[0056]步驟S150，制備半固體培養(yǎng)基:
[0057]向甲基纖維素溶液中依次加入2X1640培養(yǎng)基、L-谷氨酰胺溶液、β-巰基乙醇溶液、胎牛血清、10000單位/ml的青霉素與10000 μ g/ml鏈霉素混合溶液、50XHAT溶液及抗原包被的納米金顆粒溶液，4°C下攪拌均勻得到半固體培養(yǎng)基，其中，甲基纖維素溶液、2X1640培養(yǎng)基、L-谷氨酰胺溶液、胎牛血清、10000單位/ml的青霉素與10000 μ g/ml鏈霉素混合溶液、50XHAT溶液及抗原包被的納米金顆粒溶液的體積比為10:18:0.16:0.5:10:0.4:0.8:0.1。
[0058]上述溶液均指水溶液。
[0059]此外，本實(shí)施方式還提供了一種雜交瘤細(xì)胞的篩選方法，包括如下步驟:
[0060]按照上述半固體培養(yǎng)基的制備方法制備半固體培養(yǎng)基。
[0061]將融合后的雜交瘤細(xì)胞與37°C下預(yù)培養(yǎng)16~24小時(shí)后轉(zhuǎn)入半固體培養(yǎng)基中，混勻后，加入堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子5ng/ml和雜交瘤細(xì)胞融合克隆因子15ul/ml，混勻，分裝在37°C、5%體積的CO2條件下培養(yǎng)。[0062]培養(yǎng)疒14天后，待長(zhǎng)出肉眼可見的單克隆菌落時(shí)，在體式顯微鏡下用微量移液器將具有顏色反應(yīng)的克隆株從該培養(yǎng)皿中移至多微孔板中用液體培養(yǎng)的方法放大培養(yǎng)，每孔移入I個(gè)克隆進(jìn)行細(xì)胞凍存培養(yǎng)。
[0063]上述半固體培養(yǎng)基可直接用于雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)和篩選，不僅能減少培養(yǎng)過(guò)程總亞克隆的次數(shù)，在很大程度上降低勞動(dòng)強(qiáng)度，而且可以使單個(gè)細(xì)胞株之間生長(zhǎng)空間相對(duì)獨(dú)立，減少克隆株與克隆株之間的接觸抑制備用，同時(shí)通過(guò)引入包被有抗原的納米金顆粒，使得能一步篩選到分泌目的抗體的單抗隆細(xì)胞株，進(jìn)一步節(jié)省了單克隆篩選的時(shí)間。甲基纖維素介質(zhì)能克服瓊脂糖熔點(diǎn)高的缺點(diǎn)，在室溫下即可操作，不用擔(dān)心凝固問(wèn)題。納米金顆粒的制備簡(jiǎn)單，顆粒大小可調(diào)。結(jié)合納米金包被的抗原進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的篩選，能更大程度的縮短篩選周期，降低勞動(dòng)強(qiáng)度。
[0064]以下為具體實(shí)施例部分:
[0065]U2X1640培養(yǎng)基的配制:取10.4g包裝的1640培養(yǎng)基干粉一袋，加入2g/LNaHCO3,0.1 lg/L丙酮酸鈉充分?jǐn)嚢枞芙?，制備? X 1640培養(yǎng)基500ml，pH用0.5mol/L鹽酸和0.5M氫氧化鈉調(diào)節(jié)至7.0-7.4，用0.22 μ m的濾膜過(guò)濾除菌，制得2X1640培養(yǎng)基。
[0066]2、制備L-谷氨酰胺母液:稱取L-谷氨酰胺2.8g，加純水IOml并加熱至完全溶解，除菌過(guò)濾，制備得IM L-谷氨酰胺母液，按每管Iml分裝，冷凍保存。
[0067]3、制備β -巰基乙醇母液:取70 μ I β -巰基乙醇，加入100mL純水中，過(guò)濾除菌，得到lmmol/Li3 -巰基乙醇母液，_20°C保存。
[0068]4、甲基纖維素水溶液配制:取4000cp甲基纖維素0.4g于121~126°C滅菌30min，無(wú)菌條件下取IOml無(wú)菌超純水輕輕加入到甲基纖維素中，4°C低溫條件下磁力攪拌24h。
[0069]5、納米金包被抗原的制備:
[0070]I)納米金顆粒的制備
[0071]①在磁力攪拌器上向裝有沸騰中的49ml雙蒸水的100mL三角瓶中加入1ml 12.7mM
的氯金酸溶液；
[0072]②待充分混勻后逐滴加入0.94ml 38.8mM的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱反應(yīng)5min后冷卻至室溫,此時(shí)即可產(chǎn)生l(Tl8nm球狀分散的納米金顆粒。2)抗原與連接劑(Linker)連接
[0073]①將抗原稀釋至終濃度lmg/ml，并加入十分之一體積的IM Na2HPO4溶液，使終體積為100 μ I ；
[0074]②加入10 μ I IOOmM NaIO4溶液至100 μ I lmg/ml抗原混合液中，室溫黑暗孵育30min，加入500μ I IXPBS停止反應(yīng);
[0075]③加入2 μ I 46.5mM PEG6_C0NHNH2 (Linker)溶液，室溫孵育 Ih ；
[0076]④加入lml40mM HEPES溶液，混勻后用10MWC0的超濾管2000Xg 4°C過(guò)濾離心IOmin,此時(shí)超濾管中還余約25%的溶液；
[0077]⑤用40mM HEPES重懸余下溶液至終體積1ml，保證抗體濃度為100 μ g/ml，可得到抗原-PeG6-CONHNH2 溶液 100 μ g/ml。
[0078]3)抗原與納米金顆粒連接反應(yīng)
[0079]①取100 μ I 100 μ g/ml的抗原PEG6_C0NHNH2溶液加至Iml納米金顆粒溶液中，室溫震蕩孵育20min ；[0080]②加100 μ I IOM mPEG-SH 室溫震蕩孵育 20min，2500rpm 4°C離心 30min ；
[0081]③棄上清，用I XPBS溶液重懸沉淀至990 μ 1，再加入10 μ I 20%PEG溶液，最終得到具有祀向功能的抗原包被的納米金顆粒溶液。
[0082]6、半固體培養(yǎng)基配制:向步驟4的最終溶液中加入步驟I制備的2X 1640培養(yǎng)基液18ml，加入步驟2配制的L-谷氨酰胺母液0.16ml，加入步驟3制備的β-巰基乙醇母液
0.5ml，胎牛血清10ml，10000單位/ml青霉素加10000 μ g/ml鏈霉素混合水溶液0.4ml，市售50 XHAT溶液0.8ml，加入0.1ml包被有抗原的納米金，4°C磁力攪拌4h，即得到具有抗原包被的納米金顆粒的半固體培養(yǎng)基，也即能特異性篩選分泌抗原特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞單克隆化HAT半固體培養(yǎng)基。
[0083]7、將融合后的細(xì)胞放置于37°C中預(yù)培養(yǎng)16~24h，然后收集細(xì)胞并用步驟6制備的半固體培養(yǎng)基混勻，加入堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子5ng/ml和雜交瘤細(xì)胞融合克隆因子15ul/ml，混合均勻，分裝至35mm平皿或者6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中37°C 5%C02條件下培養(yǎng)。
[0084]8、培養(yǎng)疒14天，待培養(yǎng)皿中已長(zhǎng)出肉眼可見的針尖大小的單克隆菌落時(shí)，在體式顯微鏡下用微量移液器將具有顏色反應(yīng)的克隆株從該培養(yǎng)皿中移至96孔板中用液體培養(yǎng)的方法放大培養(yǎng)，每孔移入一個(gè)克隆進(jìn)行細(xì)胞凍存，代細(xì)胞長(zhǎng)滿孔底1/2~2/3時(shí)，吸取培養(yǎng)進(jìn)行抗體特性鑒定或腹水生產(chǎn)。
[0085]以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.一種半固體培養(yǎng)基，其特征在于，包括如下體積份數(shù)的各組分: 濃度為0.4g/ml的甲基纖維素溶液10 ； pH 7.0~7.4 的 2 X 1640 培養(yǎng)基18 ； 濃度為lmol/1的L-谷氨酰胺溶液0.16 ； 濃度為lmmol/1的β -巰基乙醇溶液0.5 ；胎牛血清10 ； 10000單位/ml的青霉素與10000 μ g/ml鏈霉素混合溶液0.4 ； 50 X HAT 溶液0.8;及 抗原包被的納米金顆粒溶液0.1 ； 其中，每毫升所述抗原包被的納米金顆粒溶液是通過(guò)將I μ g的抗原-Peg6-Conhnh2、Iml的納米金顆粒溶液及Immol的mPEG_SH分別室溫震蕩孵育后20min后，2500 X g 4°C離心30min，用I X PBS緩沖液稀釋至990 μ I，再加入10 μ I的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的PEG溶液制備得到；其中，所述納米金顆粒溶液是向沸騰的50ml 0.254mM的氯金酸溶液逐滴加入0.94ml38.8mM的檸檬酸三鈉溶液繼續(xù)煮沸5min后冷卻而成。
2.如權(quán)利要求1所述的半固體培養(yǎng)基，其特征在于，所述甲基纖維素為4000cp的甲基纖維素。
3.如權(quán)利要求1所述的半固體培養(yǎng)基，其特征在于，所述納米金顆粒的粒徑在10~18nm之間。
4.一種半固體培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 分別制備濃度為0.4g/ml的甲基纖維素溶液、pH 7.0-7.4的2X 1640培養(yǎng)基、濃度為lmol/1的L-谷氨酰胺溶液及濃度為lmmol/1的β -巰基乙醇溶液； 向氯金酸溶液中加入檸檬酸三鈉溶液進(jìn)行加熱還原反應(yīng)，制備濃度為0.25mmol/l的納米金顆粒溶液； 向抗原溶液中加入Na2HPO4溶液，得到抗原混合液，再向所述抗原混合液中加入NaIO4溶液，室溫下黑暗環(huán)境中孵育30分鐘后加入PBS緩沖液終止反應(yīng)，然后加入PeG6-CONHNH2溶液，孵育1小時(shí)后向得到的混合液中加入HEPES溶液，混勻后用10MWC0的超濾管以.2000 X g的轉(zhuǎn)速在4°C下離心處理至所述超濾管中余留25%溶液，用HEPES重懸超濾管中余留的溶液，制備濃度為100 μ g/ml的抗原-Peg6-CONHNH2溶液； 按照體積比為1:10的比例將所述抗原-PeG6-CONHNH2溶液加入至所述納米金顆粒溶液中，室溫下震蕩孵育20分鐘后加入與所述抗原-PeG6-CONHNH2溶液等體積的濃度為IOmol/I的mPEG-SH溶液，室溫下震蕩20分鐘后轉(zhuǎn)入離心管中以2500rpm的轉(zhuǎn)速在4°C下離心處理，棄上清，用9.9倍于所述抗原-PeG6-CONHNH2溶液體積的I XPBS緩沖液重懸沉淀，再補(bǔ)加入0.1倍于所述抗原-PeG6-CONHNH2溶液的質(zhì)量濃度為20%的PEG溶液，得到抗原包被的納米金顆粒溶液； 向所述甲基纖維素溶液中依次加入所述2X 1640培養(yǎng)基、所述L-谷氨酰胺溶液、所述β -巰基乙醇溶液、胎牛血清、10000單位/ml的青霉素與10000 μ g/ml鏈霉素混合溶液、50XHAT溶液及所述抗原包被的納米金顆粒溶液，4°C下攪拌均勻得到所述半固體培養(yǎng)基，其中，所述甲基纖維素溶液、所述2X1640培養(yǎng)基、所述L-谷氨酰胺溶液、所述胎牛血清、所述10000單位/ml的青霉素與10000 μ g/ml鏈霉素混合溶液、所述50 XHAT溶液及所述抗原包被的納米金顆粒溶液的體積比為10:18:0.16:0.5:10:0.4:0.8:0.10
5.如權(quán)利要求4所述的半固體培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，所述甲基纖維素為4000cp的甲基纖維素。
6.如權(quán)利要求4所述的半固 體培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，所述納米金顆粒的粒徑在10~18]11]1之間。
7.一種雜交瘤細(xì)胞的篩選方法，其特征在于，包括如下步驟: 按照權(quán)利要求4所述的半固體培養(yǎng)基的制備方法制備所述半固體培養(yǎng)基； 將融合后的雜交瘤細(xì)胞于37°C下預(yù)培養(yǎng)16~24小時(shí)后轉(zhuǎn)入所述半固體培養(yǎng)基中，混勻后，加入堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子5ng/ml和雜交瘤細(xì)胞融合克隆因子15ul/ml，混勻，分裝在37°C、5%體積的CO2條件下培養(yǎng)； 培養(yǎng)7~14天后，待長(zhǎng)出可見的單克隆菌落時(shí)，在體式顯微鏡下用微量移液器將具有顏色反應(yīng)的克隆株移至多微孔板中用液體培養(yǎng)的方法放大培養(yǎng)，每孔移入I個(gè)克隆進(jìn)行細(xì)胞凍存培養(yǎng)，即可篩選出所述雜交瘤細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N5/20GK103898061SQ201210575548
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月26日
【發(fā)明者】萬(wàn)曉春, 劉婕, 金言, 蔡林濤 申請(qǐng)人:深圳先進(jìn)技術(shù)研究院