一種可提高基因轉(zhuǎn)染效率的納米粒子和基于該粒子的基因轉(zhuǎn)染試劑的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，通過使用一種通過細(xì)胞釋放的納米粒子NONPs來提高基因轉(zhuǎn)染效率。該種納米粒子廣泛存在于生物體系以及細(xì)胞外的循環(huán)系統(tǒng)中，例如支氣管肺泡灌洗液、體液、血液、唾液、牛奶或者尿液中。本發(fā)明將上述納米粒子摻入非病毒基因轉(zhuǎn)染載體，可以顯著增加基因轉(zhuǎn)染載體的DNA負(fù)載能力，同時(shí)又不會(huì)增加細(xì)胞毒性。經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從牛奶中提取的NONPs，摻入PEI基因轉(zhuǎn)染載體，可在幾乎不增加細(xì)胞毒性的情況下，顯著提高基因轉(zhuǎn)染效率。本發(fā)明的主要用途為基因轉(zhuǎn)染試劑，可用于細(xì)胞生物學(xué)研究、生產(chǎn)基因轉(zhuǎn)染制劑以及基因療法等。
【專利說明】—種可提高基因轉(zhuǎn)染效率的納米粒子和基于該粒子的基因轉(zhuǎn)染試劑的制備
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及一種生物體自然產(chǎn)生的納米粒子(NONPs)，通過摻雜的方式制備高效率的基因轉(zhuǎn)染試劑。
【背景技術(shù)】:
[0002]基因轉(zhuǎn)染是真核細(xì)胞由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳標(biāo)志的過程，可用于生產(chǎn)基因制品如蛋白質(zhì)，RNA，抗體等；或?qū)⒖刂苹蛞爰?xì)胞用以調(diào)節(jié)內(nèi)在基因/酶的功能用于細(xì)胞生物學(xué)研究；或修復(fù)丟失/損壞的基因用于基因療法。基因轉(zhuǎn)染技術(shù)不僅是研究轉(zhuǎn)基因和基因表達(dá)的重要工具，而且是目前基因治療的關(guān)鍵步驟。理想的基因轉(zhuǎn)染試劑應(yīng)該具有如下特點(diǎn):高效轉(zhuǎn)染；安全；低細(xì)胞毒性；方法簡(jiǎn)單；省時(shí)、經(jīng)濟(jì)。
[0003]目前，主要的基因轉(zhuǎn)染試劑為病毒型轉(zhuǎn)染試劑與人工合成型轉(zhuǎn)染試劑。病毒型轉(zhuǎn)染試劑雖具有整合效率高、可使外源基因在宿主細(xì)胞中長(zhǎng)期表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，但是由于其基因攜帶能力有限，缺乏祀向性，易產(chǎn)生免疫源性，且操作危險(xiǎn)(Putnam, D.Nat Mater 5,439-451,2006)，因此人們更傾向于使用人工合成型的基因轉(zhuǎn)染試劑。目前人工合成型基因轉(zhuǎn)染試劑主要是陽(yáng)離子脂質(zhì)體類、陽(yáng)離子肽類和陽(yáng)離子聚合物類，或者是上述幾種的復(fù)合物。然而，當(dāng)前的人工合成型基因轉(zhuǎn)染試劑同病毒型試劑相比，仍然具有較低的轉(zhuǎn)染效率，并且毒性高。這在很大程度上限制了它的應(yīng)用(Mastrobattista,E., et.al.Nat Rev DrugDiscov 5，115-121，2006)。但這同時(shí)也說明，人工合成轉(zhuǎn)染制劑在基因轉(zhuǎn)染表現(xiàn)上還有很大的可提升空間。高效率、低毒性的基因轉(zhuǎn)染試劑的研發(fā)目前是國(guó)際上的熱門課題。
[0004]自然產(chǎn)生的納米粒子(NONPs)在生物體系以及細(xì)胞體外循環(huán)系統(tǒng)中廣泛存在。目前已經(jīng)有多種NONPs被發(fā)現(xiàn)并命名，比如外來體(膜性囊泡)、脫落囊泡、宏粒子、多泡體等等。近期，這些納米粒子在藥`物傳遞和基因治療上開始引發(fā)科學(xué)家和研究者的濃厚興趣。雖然這些粒子的性質(zhì)和功能還未被研究透徹，但是他們?cè)诩?xì)胞通訊方面起著重要作用已經(jīng)得到廣泛認(rèn)同。
【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有人工合成轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染率低的不足，提供一種可提高基因轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染率的納米粒子(NONPs)，以及使用該粒子制備新型基因轉(zhuǎn)染試劑的方法。
[0006]可提高轉(zhuǎn)染效率的納米粒子(NONPs)可以從牛奶但不僅限于從牛奶中純化得到。該NONPs有以下特性:小于200nm的尺寸，如圖1 ;表面帶有負(fù)電荷。由于其表面負(fù)電荷，因此不會(huì)使DNA發(fā)生綁定或者凝結(jié)，如圖2。通過添加NONPs得到的基因轉(zhuǎn)染試劑具有高效率、低毒性的特點(diǎn)。
[0007]根據(jù)文獻(xiàn)，制備NONP溶液的簡(jiǎn)化步驟如下:
[0008]1.經(jīng)過篩選之后，采用低速離心過濾發(fā)去除大粒子，如細(xì)胞、大的細(xì)胞碎片等；
[0009]2.高速離心過濾法去除生物分子，如蛋白質(zhì)、核苷酸等；同時(shí)制成球狀NONPs ；[0010]3.將純化的NONPs溶解水、或鹽水溶液、或細(xì)胞培養(yǎng)液、或磷酸鹽緩沖液(PBS)、或二甲基亞砜(DMSO)、或二甲基甲酰胺(DMF)、或甘油，或以上以一種或幾種的混合液中。采用上述方法，Iml的NONP溶液可通過處理250ml牛奶得到。
[0011]基于上述NONPs的基因轉(zhuǎn)染試劑的制備方法，是將該NONPs以及目前常用的基因轉(zhuǎn)染試劑分散于溶劑中，該溶劑含有水、磷酸鹽、或細(xì)胞培養(yǎng)液等。步驟如下:
[0012]pEGFP DNA 質(zhì)粒 0.5 μ g、定量 PEI (0.1%,2μ I)以及 NONPs 4 μ L 混合后溶解入磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)制作成100 μ L溶液。室溫下培養(yǎng)30分鐘，即可用于細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0013]圖1.自然產(chǎn)生的納米粒子NONPs的原子力分析圖，標(biāo)尺為500nm。
[0014]圖2.1-4列為PEI/DNA帶移分析圖，5_7列為PEI/N0NP/DNA帶移分析圖。對(duì)應(yīng)列
(I)N/P = O ； (2) N/P = 8 ； (3) N/P = 16 ； (4) N/P = O ； (5) N/P = O ； (6) N/P = 8 ； (7) N/P =16。樣品分別為NONP:4μ L, DNA:100ng，對(duì)應(yīng)實(shí)施例1和實(shí)施例2。
[0015]圖3.(a)為PE1-DNA復(fù)合物原子力顯微鏡結(jié)構(gòu)圖，標(biāo)尺為500nm ； (b)為ΡΕΙ/Ν0ΝΡ/DNA復(fù)合物的原子力顯微鏡結(jié)構(gòu)圖,標(biāo)尺為500nm。
[0016]圖4.(a)為H293T細(xì)胞在PEI/N0NP/DNA體系中轉(zhuǎn)染48后(N/P = 32)的熒光粉顯微鏡圖；(b)為H293T細(xì)胞在PEI/DNA體系中轉(zhuǎn)染48后(N/P = 32)的熒光粉顯微鏡圖。
[0017]圖5.(a)為H293T細(xì)胞在不同N/P值下的轉(zhuǎn)染效率對(duì)比圖；(b)為H293T細(xì)胞在不同N/P值下的細(xì)胞存活率對(duì)比圖。圖中分別給出了相同N/P值下，添加NONPs前后，體系的轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞存活率。(c)為H293T細(xì)胞在不同NONPs用量時(shí)的轉(zhuǎn)染效率；(d)為H293T細(xì)胞在不同NONPs用量時(shí)的細(xì)胞存活率。
[0018]圖6.(e)為Hela細(xì)胞在不同N/P值下的轉(zhuǎn)染效率對(duì)比圖；(f)為Hela細(xì)胞在不同N/P值下的細(xì)胞存活率對(duì)比圖。圖中分別給出了相同N/P值下，添加NONPs前后，體系的轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞存活率。(g)為Hela細(xì)胞在不同NONPs用量時(shí)的轉(zhuǎn)染效率；(h)為Hela細(xì)胞在不同NONPs用量時(shí)的細(xì)胞存活率。
【具體實(shí)施方式】:
[0019]可提高轉(zhuǎn)染效率的納米粒子(NONPs)可以從牛奶但不僅限于從牛奶中純化得到(C.Admyre, S.M.Johansson, K.R.Qazi, J.J.Filen, R.Lahesmaa, M.Norman, E.P.A.Neve,A.Scheynius, S.Gabrielsson, J.Tmmunol.2007,179,1969-1978)。NONPs 尺寸小，不大于200nm，如圖1 ;表面帶有負(fù)電荷。由于其表面負(fù)電荷，因此不會(huì)使DNA發(fā)生綁定或者凝結(jié)，如圖2。通過添加NONPs得到的基因轉(zhuǎn)染試劑在不增加試劑毒性的情況下，具備了更高的轉(zhuǎn)染效率。
[0020]實(shí)施例1.基于聚乙烯亞胺(PEI)混合NONPs的基因轉(zhuǎn)染試劑對(duì)H293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
[0021](I)制備聚乙烯亞胺(PEI)混合NONPs的基因載體及基因轉(zhuǎn)染試劑
[0022]選取pEGFP為報(bào)告基因(DNA)，聚乙烯亞胺(PEI)為基因轉(zhuǎn)染載體。原子力結(jié)果顯示PE1-DNA復(fù)合物的構(gòu)造非常緊湊，大小為幾十到幾百個(gè)納米如圖3 (a);而PEI/N0NP/DNA復(fù)合物相對(duì)松散，原子力顯微鏡中可以看到獨(dú)立的DNA線絮如圖3(b)。圖示表明，NONPs可能會(huì)對(duì)PE1-DNA的復(fù)合產(chǎn)生輕微干擾。
[0023]將pEGFP DNA質(zhì)粒0.5 μ g、PEI以及NONPs 4 μ L混合后溶解入磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)制作成100 μ L溶液。室溫下培養(yǎng)30分鐘。添加I %瓊脂搪膠的TAE緩沖液(包含40ml三羥甲基氨基甲烷，Iml乙二胺四乙酸)。在Sub-Cell實(shí)驗(yàn)條件下(伯樂實(shí)驗(yàn)室、80V)培養(yǎng)60分鐘。在5% C02，濕度95%，溫度37°C的條件下培養(yǎng)H293T細(xì)胞，輔以10%牛血清(FCS)，每ml包含5000單元的青霉素、5000 μ g鏈霉素混合物(可使用0.85%生理鹽水溶解青霉素G、鏈霉素硫化鹽的方式獲得)。
[0024](2)基因轉(zhuǎn)染效率評(píng)價(jià)
[0025]將培養(yǎng)的H293T細(xì)胞在24孔板以I X 105/孔的細(xì)胞密度鋪滿；轉(zhuǎn)染前放置12小時(shí)，使其在轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞約有80%的聚集度。再將步驟I中得到的DNA、PE1、N0NPs復(fù)合物溶液輔以細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)(10% FCS，青霉素/鏈霉素混合物)，孵育48小時(shí)，孵育條件:5%C02，濕度95%，溫度37°C。孵育48h后，將細(xì)胞分離，使用熒光顯微鏡可以看到細(xì)胞被轉(zhuǎn)染，圖
4。使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光檢測(cè)H293T的轉(zhuǎn)染效率，在氮磷比(N/P)為32的時(shí)候，轉(zhuǎn)染效率為40%。而同樣條件下，未摻雜NONPs的PEI系統(tǒng)，轉(zhuǎn)染效率僅為30%。可以證明，使用NONPs的轉(zhuǎn)染試劑，使H293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率有了大約30%的提升。
[0026](3)基因轉(zhuǎn)染試劑細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)
[0027]細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)采用臺(tái)盼藍(lán)染料排斥法。去步驟(2)中分離出的10 I細(xì)胞與10 I臺(tái)盼藍(lán)染料混合，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)，獲得細(xì)胞存活率。測(cè)得細(xì)胞存活率為90%。而同樣條件下，未摻雜NONPs的PEI系統(tǒng)，細(xì)胞存活率同樣約為90%?？梢宰C明，使用NONPs的轉(zhuǎn)染試劑在氮磷比為32的情況下，并未對(duì)細(xì)胞活性造成明顯影響。
[0028](4)采用不同的氮`磷比(N/P)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
[0029]在不同的N/P值情況下，對(duì)比評(píng)價(jià)添加定量NONPs (4 μ L)前后的基因轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性，如圖5 (a).可以證明:N/P值低于16時(shí)，添加NONPs對(duì)轉(zhuǎn)染效率沒有大的提升，轉(zhuǎn)染效率都在10%左右；N/P值為32時(shí)，添加NONPs的PEI體系轉(zhuǎn)染效率大幅提升了約33%，由30%提升至約40% ；N/P值為80時(shí)，添加NONPs的PEI體系轉(zhuǎn)染效率提升了約16%，由43%提升至50%;N/P值為160時(shí)，添加NONPs的PEI體系轉(zhuǎn)染效率提升了 34%，由33%提升至50%。
[0030]同時(shí)，如圖5(b)在N/P值低于80時(shí)，細(xì)胞存活率均為90%左右；N/P值達(dá)到160時(shí)，細(xì)胞存活率小幅下降至約80%，顯示NONPs的細(xì)胞毒性開始顯現(xiàn)。相對(duì)于其對(duì)轉(zhuǎn)染效率的顯著提升，NONPs的細(xì)胞毒性已屬非常輕微。
[0031](5)在一定N/P值情況下，采用不同NONPs添加量的基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
[0032]N/P值為32時(shí)，逐步增加NONPs用量，對(duì)基因轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5(c)顯示，通過逐步增加NONPs至50 μ L，轉(zhuǎn)染效率也有未添加時(shí)的30%逐步增長(zhǎng)至43% ;與此同時(shí)，圖5(d)顯示細(xì)胞存活率幾乎沒有下降，顯示了添加NONPs的基因轉(zhuǎn)染試劑具有高轉(zhuǎn)染率、低毒性的優(yōu)越性能。
[0033]實(shí)施例2.基于聚乙烯亞胺(PEI)混合NONPs的基因轉(zhuǎn)染試劑對(duì)Hela細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
[0034](I)制備聚乙烯亞胺(PEI)混合NONPs的基因載體及基因轉(zhuǎn)染試劑
[0035]除培養(yǎng)的細(xì)胞為Hela細(xì)胞之外，其他采用原料以及實(shí)驗(yàn)步驟同實(shí)施例1。[0036](2)基因轉(zhuǎn)染效率評(píng)價(jià)
[0037]實(shí)驗(yàn)步驟同實(shí)施例1。孵育48小時(shí)后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Hela細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，在氮磷比(N/P)為32的時(shí)候，轉(zhuǎn)染效率超過50%。而同樣條件下，未摻雜NONPs的PEI系統(tǒng)，轉(zhuǎn)染效率僅為40%?？梢宰C明，使用NONPs的轉(zhuǎn)染試劑，使Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率有了大于25%的提升。
[0038](3)基因轉(zhuǎn)染試劑細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)
[0039]采用實(shí)施例1的方法，測(cè)得Hela細(xì)胞存活率為90%。而同樣條件下，未摻雜NONPs的PEI系統(tǒng)，細(xì)胞存活率同樣約為90%。可以證明，使用NONPs的轉(zhuǎn)染試劑在氮磷比為32的情況下，并未對(duì)細(xì)胞活性造成明顯影響。
[0040](4)采用不同的氮磷比(N/P)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
[0041]在不同的N/P值情況下，對(duì)比評(píng)價(jià)添加定量NONPs (4 μ L)前后的基因轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性，如圖6(e) (f)。實(shí)驗(yàn)顯示:N/P值低于16時(shí)，添加NONPs對(duì)轉(zhuǎn)染效率沒有大的提升，轉(zhuǎn)染效率都在10%左右；N/P值為32時(shí)，添加NONPs的PEI體系轉(zhuǎn)染效率大幅提升了約25%，由40%提升至約50% ；N/P值為80時(shí)，添加NONPs的PEI體系轉(zhuǎn)染效率提升了約10%，由55%提升至約60% ；N/P值為160時(shí)，添加NONPs的PEI體系轉(zhuǎn)染效率大幅提升了37%，由40%提升至55%。
[0042]同時(shí)，如圖6(f)在N/P值低于80時(shí)，Hela細(xì)胞存活率均為90%左右；N/P值達(dá)到160時(shí)，細(xì)胞存活率小幅下降至約80%，顯示NONPs的細(xì)胞毒性開始顯現(xiàn)。相對(duì)于其對(duì)轉(zhuǎn)染效率的顯著提升，NONPs的細(xì)胞毒性已屬非常輕微。
[0043](5)在一定N/P值情況下，采用不同NONPs添加量的基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
`[0044]N/P值為32時(shí)，逐步增加NONPs用量，對(duì)Hela細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6(g)顯示，通過逐步增加NONPs至50 μ L，轉(zhuǎn)染效率也有未添加時(shí)的15%逐步增長(zhǎng)至50% ;與此同時(shí)，圖6(h)顯示細(xì)胞存活率幾乎沒有下降，顯示了添加NONPs的基因轉(zhuǎn)染試劑具有高轉(zhuǎn)染率、低毒性的優(yōu)越性能。
【權(quán)利要求】
1.一種摻雜自然產(chǎn)生的納米粒子NONPs的非病毒性基因轉(zhuǎn)染載體，它包含自然產(chǎn)生的納米粒子NONPs和常規(guī)非病毒基因轉(zhuǎn)染載體，其特點(diǎn)是高轉(zhuǎn)染效率、低細(xì)胞毒性。
2.一種基于權(quán)利項(xiàng)I所述的摻雜NONPs的非病毒性基因轉(zhuǎn)染載體制備的基因轉(zhuǎn)染試劑，是將基因載體分散于水、或鹽水溶液、或細(xì)胞培養(yǎng)液、或磷酸鹽緩沖液(PBS)、或二甲基亞砜(DMSO)、或二甲基甲酰胺(DMF)、或甘油，或以上以一種或幾種的混合液中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自然產(chǎn)生的納米粒子NONPs，包括但不僅限于外來體、膜性囊泡、脫落囊泡、宏粒子、多泡體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自然產(chǎn)生的納米粒子NONPs，其特性在于尺寸小，小于200nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自然產(chǎn)生的納米粒子NONPs，其特性在于表面攜帶負(fù)電荷，不會(huì)使DNA發(fā)生帶移或者凝結(jié)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自然產(chǎn)生的納米粒子NONPs，其特性在于在自然界中廣泛存在，可以從支氣管肺泡灌洗液、體液、血液、唾液、牛奶或者尿液中但不僅限于上述物質(zhì)中純化得到。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因轉(zhuǎn)染試劑的制備，其特性包含以下步驟(1)和步驟(2): (1)篩選權(quán)利要求6所述物質(zhì)，首先采用低速離心過濾發(fā)去除大粒子，如細(xì)胞、大的細(xì)胞碎片等；再高速離心過濾法去除生物分子，如蛋白質(zhì)、核苷酸等，同時(shí)將NONPs制作成球狀；將純化的NONPs溶解在權(quán)利要求2所述溶劑中。 (2)權(quán)利要求1中所述常規(guī)非病毒基因轉(zhuǎn)染載體以及NONPs混合后溶解入磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或權(quán)利要求2所述溶劑中，即制成轉(zhuǎn)染試劑。加入基因質(zhì)粒，室溫下培養(yǎng)30分鐘，即可用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。`
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK103865942SQ201210571278
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月18日
【發(fā)明者】劉遵峰, 賈鳳美 申請(qǐng)人:常州碳宇納米科技有限公司