專利名稱：在田間施用芥子酶制劑提高菜粕抑菌防病藥效的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在田間施用芥子酶制劑提高菜柏抑菌防病藥效的方法。屬于農(nóng)業(yè)廢棄物綜合利用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
油菜是世界第三大油料作物，菜籽產(chǎn)量僅次于大豆和棉籽，是最重要的油料作物之一。自1978年以來，我國油菜種植面積和產(chǎn)量己穩(wěn)居世界第一位，達到700萬公頃，占世界油菜播種面積的26%，可產(chǎn)生約1000萬噸的菜柏。菜柏中蛋白質(zhì)含量高達40-45%，是一種優(yōu)良的蛋白原料，有作為飼用蛋白開發(fā)的應(yīng)用潛力，但其添加比例一般不能高于15-20%， 因為菜柏中含有的植物次生代謝產(chǎn)物硫代葡萄糖甙(GSLs)在芥子酶的作用下可分解產(chǎn)生氰、噁唑烷硫酮(OZT)、異硫氰酸酯(ITCs)等有毒物質(zhì)以及其它抗?fàn)I養(yǎng)因子，影響動物的生長發(fā)育，極大影響了菜籽柏的飼用價值。菜柏經(jīng)過脫毒后可以飼用，但脫毒工藝復(fù)雜，成本較高，有“三廢”污染，技術(shù)推廣仍然面臨很大困難。因此，目前飼用菜柏還不到總量的三分之一 O
菜柏除了含有高質(zhì)量的氮素，磷、鉀和硫的含量也均分別達到I. 2-1. 5%,是一種優(yōu)質(zhì)的有機肥。菜柏作為有機肥料使用有悠久的歷史。大量的資料表明，在新開墾的土地施用菜柏能提高土壤有機質(zhì)含量和土壤肥力，快速培肥土壤，提高產(chǎn)量；而在土壤質(zhì)量惡化的耕地使用菜柏類有機肥可以顯著改良土壤的物理、化學(xué)和生物學(xué)性狀，起到修復(fù)土壤和克服土壤障礙因子的作用，同時減少化學(xué)肥料和農(nóng)藥的用量，改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)。
雖然菜柏作為肥料的施用效果被普遍認可，然而菜柏所具有的另外一種功能一 “藥效”卻鮮為人知，在土壤中所起的作用也遠未發(fā)揮出來。在菜柏作為飼料應(yīng)用時，菜柏中含有的硫代葡萄糖甙的主要分解產(chǎn)物異硫氰酸酯對動物具有毒害作用，是限制其飼用的不利因子；然而，菜柏施用于土壤中，硫代葡萄糖甙分解所產(chǎn)生的異硫氰酸酯卻具有廣譜殺菌活性，對土壤中的線蟲、細菌、真菌等有害生物具有很強的殺生作用，可用于農(nóng)作物土傳病蟲害的防治，因此菜柏是一種優(yōu)良的“藥肥雙效”生物資源。但要使得菜柏施入土壤后硫代葡萄糖甙分解產(chǎn)生異硫氰酸酯而對病原生物起到殺傷作用，必須具備一定的施用技術(shù)，滿足相應(yīng)的土壤管理條件。
菜柏是油菜柏和芥菜柏的統(tǒng)稱。雖然我國在大力研究和推廣雙低油菜，但至目前為止，由于雙低油菜抗病蟲害、低溫、干旱等逆境的性能較差，目前也僅在長江中下游部分地區(qū)推廣，在我國的西部和中部地區(qū)仍然以常規(guī)油菜種植為主；同時，世界范圍內(nèi)生物質(zhì)能源產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展使得以制造生物材油為目的芥菜種植廣泛興起，大量的芥菜柏將隨之產(chǎn)生，而芥菜柏中硫代葡萄糖甙的含量遠高于油菜柏，飼用適合度更小，其處置利用將面臨更大的難題。因此，大部分的菜柏在將來很長一段時間內(nèi)仍然面臨著合理、高效利用的困境。 另一方面，我國可耕地面積不斷縮小，而社會的快速發(fā)展和人民生活水平的不斷提高使得人們對農(nóng)產(chǎn)品數(shù)量和品種的需求日趨增加，高效農(nóng)業(yè)的強勢推進使得設(shè)施種植業(yè)在全國范圍內(nèi)高速發(fā)展，設(shè)施栽培的大肥大水和高復(fù)種指數(shù)使得土壤長年處于高負荷運轉(zhuǎn)狀態(tài)，土壤的物理、化學(xué)和生物學(xué)性狀急劇惡化，土壤質(zhì)量顯著下降，土傳病蟲害發(fā)生面積和程度不斷增加，已經(jīng)嚴重制約了設(shè)施種植業(yè)的大力發(fā)展，迫切需求新的、環(huán)境友好的土壤改良及修復(fù)產(chǎn)品及技術(shù)。因此，既具有很好的肥料效果又能對多種土傳病菌有殺滅或抑制效果、可有效防除土傳病害的十字花科蕓薹屬植物及其餅柏再次成為相關(guān)領(lǐng)域關(guān)注和研究的熱點。歐美等國家已經(jīng)將芥菜綠肥及芥菜柏開發(fā)為商業(yè)化的藥肥產(chǎn)品，在蔬菜、花卉、果樹等作物的根結(jié)線蟲、疫病及枯黃萎病等土傳病害防治中取得良好效果，顯示巨大的應(yīng)用潛力。
有關(guān)以菜柏或者菜柏與其他成份配合作為肥料使用防治病蟲害的專利報道有申請(專利)號93115650. 5，由辣椒樹脂、氯化稀土、菜籽餅或棉籽餅、硫酸鋅、鹽酸按一定配比制成。本發(fā)明同時具有殺蟲、殺菌和促進植物生產(chǎn)的功能。申請(專利)號 200610128495. I :本發(fā)明公開了一種防治蔬菜根結(jié)線蟲病的復(fù)合有機改良劑及其制作方法，具體是將以上所述菜籽餅、松鋸末、蓖麻葉三種成分中其中的菜籽餅、松鋸末充分腐熟后，晾干粉碎備用；申請(專利)號201010130961. 6，一種復(fù)合微生物肥料及其制備方法。 其特征是它由油菜菜籽餅、作物秸桿、真菌菌體、細菌菌體和水按照一定比例制備而成，本發(fā)明通過2次固體發(fā)酵法，將真菌和細菌進行混合。還有其他以菜柏為主要原料或者為配料與其他肥料復(fù)配生產(chǎn)有機肥的專利。
綜合以上材料可以看出，所有的公開專利都是菜柏與化學(xué)肥料、有機肥料或其他營養(yǎng)成分復(fù)配獲得具有促生長、防病蟲作用的肥料。雖然也有研究報道施用菜柏或者其復(fù)配肥料可以減輕多種作物病蟲害的發(fā)生，但最后都歸結(jié)為菜柏的肥效促進了作物生長而提高作物本身的抗病性，而均未涉及到利用菜柏中含有的硫代葡萄糖甙分解所產(chǎn)生的異硫氰酸酯而起到對病害的防控作用。
最近研究發(fā)現(xiàn)，菜柏中硫代葡萄糖甙(GSLs)的水解率低是造成土壤中異硫氰酸酯(ITCs)濃度低、影響殺菌效果的主要原因。影響GSLs水解的因子有菜柏破碎程度、芥子酶活性、土壤溫度、水分含量等。Morra在實驗室條件下加大材料破碎程度和增加土壤水分含量，使得GSLs的水解率由15%提高到30%，而田間狀態(tài)下，GSLs水解率仍然低于15%。 Gimsing等在田間狀態(tài)下，采用高、低GSLs含量的兩種材料，優(yōu)化材料破碎度和土壤水分含量，檢測土壤中GSLs和ITCs的濃度，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過12天，兩種材料GSLs的水解率仍然只有 26%和56%，大部分的GSLs仍然未被水解，但研究發(fā)現(xiàn)GSLs的水解率和土壤中芥子酶的活性呈正相關(guān)。含有GSLs的植物組織(包括菜柏)同時含有芥子酶，在完整的植物細胞中，二者分布在細胞的不同部位，而當(dāng)植物受到昆蟲攻擊、機械損傷或病原菌侵染時，芥子酶就會被釋放出來，催化GSLs水解產(chǎn)生殺生化合物。而大量的研究發(fā)現(xiàn)菜柏本身含有的芥子酶由于受其含量、活性等因素的影響不能夠滿足GSLs在短時間內(nèi)大量水解的需求，通過外源添加芥子酶能顯著促進GSLs在短時間內(nèi)大量水解、釋放ITCs而增強生物熏蒸效果。Omirou 等在室內(nèi)培養(yǎng)條件下，在Ikg 土壤中(含有I. 5g菜柏)添加活性單位為3U的植物源芥子酶制劑，使得菜柏中的GSLs在3天內(nèi)水解率達100%，土壤中ITCs的濃度是對照的5_6倍，而對照GSLs在8天后水解率仍為40%。可見，通過外源添加芥子酶能顯著提高GSLs的降解率而增強殺菌效果。以上實驗使用的芥子酶均為植物源芥子酶，且實驗過程僅限于實驗室內(nèi)，均未解決田間應(yīng)用的實際問題。
目前市售的芥子酶均從十字花科蕓薹屬植物中提取獲得，提取步驟復(fù)雜，成本較高，致使芥子酶價格昂貴。首先，植物原料來源困難，在耕地面積緊張、集約化程度高的國家和地區(qū)，花費2-3個月時間種植作物用來提取芥子酶難度很大；其次，植物生長地域、季節(jié)和氣候等因素直接影響其體內(nèi)酶的生成量，使得酶提取的產(chǎn)量和質(zhì)量都不穩(wěn)定；另外，復(fù)雜的提取工藝及提取芥子酶后產(chǎn)生的下腳料處置困難也是限制該方法的重要瓶頸。而利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)芥子酶可滿足任何規(guī)模、任何時間的需求，產(chǎn)率高、質(zhì)量穩(wěn)定，具有巨大優(yōu)勢。
關(guān)于微生物源芥子酶，國外開展了以下研究=Ohtsuru篩選獲得能產(chǎn)生胞內(nèi)芥子酶的黑曲霉菌株，并進行酶的分離純化、酶學(xué)特性及影響酶活性的因子研究，但沒有具體應(yīng)用；Tani對陰溝腸桿菌產(chǎn)生的芥子酶進行了分離純化和酶學(xué)特性研究。Palop報道敏捷乳酸菌通過產(chǎn)生芥子酶促進GSL分解生成甲基ITC。Rakariyatham先后篩選獲得多株產(chǎn)芥子酶的曲霉屬和尖孢鐮刀菌屬的真菌， 通過紫外誘變獲得芥子酶產(chǎn)量提高3. 5倍的高產(chǎn)菌株。Ishimoto分離到一株鐮刀菌菌株 Ls-F-in-4-1 (.Fusarium spp),該菌株產(chǎn)生的芥子酶將GSLs分解產(chǎn)生苯甲基ITCs,從而有效防控由終極腐霉Wii皿》)引起的豌豆土傳病害的發(fā)生。國內(nèi)僅有吳宏偉等研究從米曲霉培養(yǎng)物中分離到芥子酶，但沒有進一步的研究報道。申請人于2012年3月15 日向國家知識產(chǎn)權(quán)局提交了名稱為產(chǎn)芥子酶的深綠木霉菌株及其應(yīng)用的發(fā)明專利申請，申請?zhí)枮?01210068201. 6，首次提及通過深綠木霉菌株提取芥子酶，目前，國內(nèi)外還沒有利用深綠木霉生產(chǎn)的芥子酶應(yīng)用于田間提高菜柏類有機肥抑菌防病功能的報道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于一方面，在每年數(shù)百萬噸的菜柏中，僅有約1/3的菜柏經(jīng)處理后以較低的比例添加到飼料中，大量的菜柏尤其是硫代葡萄糖苷含量高的菜柏至今沒有技術(shù)可操作、經(jīng)濟可行的利用途徑，大部分菜柏仍作為普通有機肥粗放施入到土壤中，遠遠沒有發(fā)揮其應(yīng)有的功效。另一方面，菜柏在田間狀態(tài)下，GSLs水解率仍然低下，沒有充分發(fā)揮其對土壤中有害生物的殺生效果等一系列問題，提出了一種在田間通過芥子酶制劑提高菜柏抑菌防病藥效的方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種在田間通過芥子酶制劑提高菜柏抑菌防病藥效的方法，是通過芥子酶制劑促進菜柏中硫代葡萄糖苷快速降解，釋放異硫氰酸酯進而發(fā)揮抑菌防病的藥效，其特征在于土壤溫度在15°C以上，將田塊中前茬作物產(chǎn)生的殘體清除干凈，土壤施完底肥后旋耕20-25厘米，菜柏均勻灑入田間，菜柏用量為200-400公斤/畝， 再將芥子酶制劑均勻灑入田間，芥子酶制劑用量為1-1. 5公斤/畝，再將土壤旋耕、澆水， 使得土壤水分含量為田間最大持水量的60-70%，并覆蓋塑料薄膜，土溫高于25°C時，覆膜持續(xù)時間為15-20天，土溫低于25°C時，覆膜持續(xù)時間為20-30天，然后揭膜通氣2_3天， 即可提高菜柏抑菌防病藥效。
在本發(fā)明中，所用菜柏的硫代葡萄糖苷含量至少為40Mfflol/g，芥子酶制劑中芥子酶活性為100-200U/g。
在本發(fā)明中，所述的芥子酶制劑由深綠木霉液體純培養(yǎng)獲得，具體方法為對深綠木霉進行純培養(yǎng)，獲得液體純培養(yǎng)物，將液體純培養(yǎng)物過四層紗布，收集紗布上的菌絲，將菌絲經(jīng)超聲波破碎后靜置、離心，收集上清液即獲得芥子酶液，將芥子酶液用載體吸附后， 自然晾干或30°C烘干后即為芥子酶制劑。
在本發(fā)明中，將對深綠木霉進行純培養(yǎng)，獲得液體純培養(yǎng)物是指將深綠木霉接種到試管斜面培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)，再將斜面培養(yǎng)好的菌株接種到對應(yīng)的容量為250ml且裝有80ml液體種子培養(yǎng)基的三角瓶中，將三角瓶置于轉(zhuǎn)速160-180r/min、溫度為28±2°C 的搖床上培養(yǎng)24-36小時，然后再以體積比5-10%的接種量分別接入到容量為2000ml且裝有800ml液體生產(chǎn)培養(yǎng)基的大三角瓶中，將大三角瓶置于轉(zhuǎn)速180r/min、溫度為28±2°C的搖床上培養(yǎng)72-96小時，當(dāng)液體培養(yǎng)物剛開始出現(xiàn)黃顏色時結(jié)束培養(yǎng)，獲得深綠木霉液體純培養(yǎng)物；所述的試管斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，配制方法為馬鈴薯200克，葡萄糖或蔗糖20 克，瓊脂15-20克，水1000毫升，pH自然。馬鈴薯去皮，切成塊煮沸半小時，然后用2層紗布過濾，再加糖及瓊脂，溶化后補足水至1000毫升，121°C高壓滅菌20min ；所述的液體種子培養(yǎng)基和液體生產(chǎn)培養(yǎng)基為燕麥20 g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 O. OOlg, MnCl2 · 4H20 O. OOlg, ZnSO4 · 7H20 O. OOlg，溶解在 1000 毫升水中，121 °C高壓滅菌 25min。
在本發(fā)明中，將菌絲經(jīng)超聲波破碎后靜置、離心，收集上清液即獲得芥子酶液是指將從紗布上收集的菌絲與PH7. O的磷酸緩沖液以重量比I :5均勻混合，在功率為200W 超聲波破碎儀中破碎10分鐘，然后將破碎好的菌絲液置于4°C冰箱中放置I小時，然后在 4°C,4000 r/min離心15 min，取離心后上清液即為芥子酶液；PH7. O的磷酸緩沖液是指氯化鈉Sg，氯化鉀O. 2g，磷酸二氫鉀O. 24g，磷酸氫二鈉 3. 58g溶解在1000毫升水中；在本發(fā)明中，將芥子酶液用載體吸附所用的載體為過60目篩的草炭粉，該草炭粉經(jīng) 121°C，滅菌40分鐘后使用，芥子酶液與草炭粉的混合比例為體積比I :8-1 10，混合后的混合物自然風(fēng)干或30°C烘干后過40目篩，即獲得芥子酶制劑。
本發(fā)明的優(yōu)點在于首先，本發(fā)明以常見、容易獲得的菜柏為使用的主體原料，通過外源添加芥子酶并采用簡單的方法調(diào)控土壤條件，創(chuàng)造促進菜柏中硫代葡萄糖苷快速降解釋放殺生氣體的環(huán)境條件，達到殺滅或抑制土壤中有害生物的目的；另外，該方法不但提高了菜柏的殺菌、防病功效，充分發(fā)揮了菜柏的“藥效”，而且經(jīng)過土壤覆蓋和適宜的保濕過程，也加快了菜柏中有機大分子物質(zhì)的礦化過程、促進菜柏的降解和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化，提高其肥料有效性，增強土壤的肥力并同時增加了土壤中微生物的數(shù)量、活性和生物多樣性，也間接起到了抑制病原菌生長的作用。整個施用過程簡單，易于操作；施用后能顯著改良土壤質(zhì)量、 平衡土壤養(yǎng)分及豐富土壤微生物的種群結(jié)構(gòu)，發(fā)揮對作物促生、防病的效果，從而減少化肥、農(nóng)藥的使用量，為資源循環(huán)利用、環(huán)境保護及農(nóng)產(chǎn)品的安全生產(chǎn)開辟新的思路。
我們對來自江蘇、山東、安徽、江西、湖北、四川、陜西、甘肅等十多個省的菜柏，開展了對常見植物病原菌的生長抑制作用和對農(nóng)作物病害的防控效果研究，研究發(fā)現(xiàn)90%以上的菜柏對病原菌的菌絲和分生孢子或者菌核有30-100%的生長抑制作用，對辣椒、番茄等土傳病害的防控效果可達60-100%，但要使其發(fā)揮防病功效，對菜柏施用時的菜柏顆粒大小、芥子酶含量、土壤疏松情況、土壤水分含量、土壤溫度及土壤覆蓋狀況等均有一定要求。
試驗表明，菜柏施入土壤后，外源添加芥子酶并調(diào)節(jié)土壤到合適的水分含量，然后覆蓋塑料薄膜維持土壤濕度，可以顯著提高菜柏對病原菌的生長抑制效果。不但為大量菜柏的高效利用開辟了新途徑，實現(xiàn)了農(nóng)業(yè)廢棄物的高端循環(huán)利用，而且對設(shè)施栽培土壤性狀改良、土傳病害防控及設(shè)施土壤的可持續(xù)利用和設(shè)施農(nóng)業(yè)的持續(xù)發(fā)展具有重大意義具體實施方式
實施例I本實施例中采用的深綠木霉是本案申請人在中國微生物菌種保藏中心登記保藏的深綠木霉，其保藏號為CGMCC NO. 5609，該深綠木霉已經(jīng)通過201210068201. 6的中國發(fā)明專利申請案為向公眾公開。
深綠木霉培養(yǎng)基的配制試管斜面培養(yǎng)基的配制馬鈴薯200克，葡萄糖或蔗糖20克，瓊脂15-20克，水1000 毫升，pH自然。馬鈴薯去皮，切成塊煮沸半小時，然后用2層紗布過濾，再加糖及瓊脂，加熱煮沸至瓊脂溶化，補足體積至1000毫升，適當(dāng)冷卻到60°C左右分裝到試管中，裝量為試管高度的1/5-1/6，用試管塞塞好試管口，121°C高壓滅菌25min，趁熱取出后擺斜面至冷卻備用，斜面高度不超過試管高度的1/3。
液體種子培養(yǎng)基和液體生產(chǎn)培養(yǎng)基的配制分別稱取燕麥20 g，F(xiàn)eSO4 ·7Η20 O. OOlg, MnCl2 · 4H20 O. OOlg, ZnSO4 · 7H20 O. OOlg，溶解在 1000 毫升水中，然后分裝，裝液量為80ml /250ml、800ml/2000ml三角瓶，用棉塞塞好瓶口，121°C高 壓滅菌25min，冷卻后備用。
實施例2 芥子酶制劑的制備將實施例I中深綠木霉保藏菌種接種到試管斜面培養(yǎng)基中進行試管斜面活化，然后， 用接種環(huán)將活化好的菌種接種到裝有80ml液體種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，將三角瓶置于搖床培養(yǎng)24小時，搖床的轉(zhuǎn)速160r/min，培養(yǎng)溫度為28±2°C ;結(jié)束后以5%接種量(V/ V)接入裝有800ml液體生產(chǎn)培養(yǎng)基的2000ml三角瓶中，將三角瓶置于搖床培養(yǎng)，搖床的轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng)溫度為28±2°C，培養(yǎng)3_4天當(dāng)液體培養(yǎng)物開始變黃時即可結(jié)束培養(yǎng)；將液體培養(yǎng)物經(jīng)四層紗布過濾，收集紗布上的菌絲，將菌絲與PH7的磷酸緩沖液一重量比I :5 均勻混合后經(jīng)200W功率超聲波破碎10分鐘，4°C放置I小時后再在4°C，4000 r/min離心 15分鐘，收集上清液即為芥子酶液，將芥子酶液與過60目篩且高溫滅過菌的草炭粉以體積比I :8-1 :10混合，混合后的混合物自然風(fēng)干或30°C烘干后過40目篩，即獲得芥子酶制劑， 制劑中芥子酶活力為100-200U/g。
實施例3菜柏對植物病原真菌菌絲和孢子或菌核的生長抑制作用所有參加試驗的病原真菌都可以從中科院微生物菌種保藏中心獲得。將所有參加試驗的病原真菌接種到PDA平板中，28-30°C培養(yǎng)5天后用打孔器打孔獲得直徑4毫米的菌絲塊備用。
菜柏中揮發(fā)性分解產(chǎn)物對植物病原真菌菌絲的生長抑制作用在培養(yǎng)皿(直徑8.5cm,高I. 3cm)中倒入PDA培養(yǎng)基，放至常溫時接種直徑為5 mm菌碟；往培養(yǎng)皿皿蓋中央加入0. 2g,0. 4g,0. 6g,0. 8g, I. Og, I. 2g過2mm篩的菜柏粉末，以菜柏/jC =1:5的比例加入滅菌水充分混合，對照僅加入滅菌水6mL，重復(fù)3次。然后將接種了微生物的那一半培養(yǎng)皿倒扣在培養(yǎng)皿蓋子上，用封口膜密封，28°C恒溫培養(yǎng)。分別在12h后測量瓜果腐霉的菌落直徑，24h后測量立枯絲核菌菌落直徑，72h后測量其余四種病原真菌的菌落直徑，每處理重復(fù)3次。計算各化合物對菌絲生長的抑制率，抑制率(％ )=[(對照菌落增長直徑-處理菌落增長直徑)/ (對照菌落增長直徑)]X 100%。
菜柏中非揮發(fā)性分解產(chǎn)物對植物病原真菌菌絲的生長抑制作用稱取菜柏粉末放入250mL三角瓶中，加入IOOmL無菌水。分別加入2g, 6g, 10g, 14g菜柏。對照的試管中只加無菌水。45°C振蕩12h，12000r/min離心20min，取上清液于超凈工作臺上用孔徑為O. 22 μ m微孔濾膜過濾。取ImL濾液添加到5mL40°C熔融的PDA培養(yǎng)基中混勻，平鋪于直徑 5cm的培養(yǎng)皿中，至常溫時接種直徑為5_的菌塊，用封口膜密封，28°C倒置培養(yǎng)。測量菌斑直徑，計算抑制率，方法同上，實驗結(jié)果見表I。
表I菜柏分解產(chǎn)物對植物病原真菌的菌絲生長的抑制作用
權(quán)利要求
1.一種在田間施用芥子酶制劑提高菜柏抑菌防病藥效的方法，是通過芥子酶制劑促進菜柏中硫代葡萄糖苷快速降解，釋放異硫氰酸酯進而發(fā)揮抑菌防病的藥效，其特征在于土壤溫度在15°C以上，將田塊中前茬作物產(chǎn)生的殘體清除干凈，土壤施完底肥后旋耕20-25厘米，菜柏均勻灑入田間，菜柏用量為200-400公斤/畝，再將芥子酶制劑均勻灑入田間，芥子酶制劑用量為1-1. 5公斤/畝，再將土壤旋耕、澆水，使得土壤水分含量為田間最大持水量的60-70%，并覆蓋塑料薄膜，土溫高于25°C時，覆膜，時間為15-20天，土溫低于25°C時，覆膜時間為20-30天，然后揭膜通氣2-3天，即可提高菜柏抑菌防病藥效。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的在田間施用芥子酶制劑提高菜柏抑菌防病藥效的方法，其特征在于所用菜柏的硫代葡萄糖苷含量至少為40Mfflol/g，芥子酶制劑中芥子酶活性為100-200U/g。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的在田間施用芥子酶制劑提高菜柏抑菌防病藥效的方法，其特征在于所述的芥子酶制劑由深綠木霉液體純培養(yǎng)獲得，具體方法為對深綠木霉進行純培養(yǎng)，獲得液體純培養(yǎng)物，將液體純培養(yǎng)物過四層紗布，收集紗布上的菌絲，將菌絲經(jīng)超聲波破碎后靜置、離心，收集上清液即獲得芥子酶液，將芥子酶液用載體吸附后，自然晾干或30°C烘干后即為芥子酶制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的在田間施用芥子酶制劑提高菜柏抑菌防病藥效的方法，其特征在于將對深綠木霉進行純培養(yǎng)，獲得液體純培養(yǎng)物是指將深綠木霉接種到試管斜面培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)，再將斜面培養(yǎng)好的菌株接種到對應(yīng)的容量為250ml且裝有80ml液體種子培養(yǎng)基的三角瓶中，將三角瓶置于轉(zhuǎn)速160-180r/min、溫度為28±2°C的搖床上培養(yǎng)24-36小時，然后再以體積比5-10%的接種量分別接入到容量為2000ml且裝有800ml液體生產(chǎn)培養(yǎng)基的大三角瓶中，將大三角瓶置于轉(zhuǎn)速180r/min、溫度為28±2°C的搖床上培養(yǎng)72-96小時，當(dāng)液體培養(yǎng)物剛開始出現(xiàn)黃顏色時結(jié)束培養(yǎng)，獲得深綠木霉液體純培養(yǎng)物； 所述的試管斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，配制方法為馬鈴薯200克，葡萄糖或蔗糖20克，瓊脂15-20克，水1000毫升，pH自然，馬鈴薯去皮，切成塊煮沸半小時，然后用2層紗布過濾，再加糖及瓊脂，溶化后補足水至1000毫升，121°C高壓滅菌20min ； 所述的液體種子培養(yǎng)基和液體生產(chǎn)培養(yǎng)基為燕麥20 g，F(xiàn)eSO4 7H20 0. OOlg,MnCl2 4H20 0. OOlg, ZnSO4 7H20 0. OOlg，溶解在 1000 毫升水中，121 °C高壓滅菌 25min。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的在田間施用芥子酶制劑提高菜柏抑菌防病藥效的方法，其特征在于將菌絲經(jīng)超聲波破碎后靜置、離心，收集上清液即獲得芥子酶液是指將從紗布上收集的菌絲與PH7. 0的磷酸緩沖液以重量比I :5均勻混合，在功率為200W超聲波破碎儀中破碎10分鐘，然后將破碎好的菌絲液置于4°C冰箱中放置I小時，然后在4°C，4000 r/min離心15 min,取離心后的上清液即為芥子酶液；PH7. 0的磷酸緩沖液是指氯化鈉Sg，氯化鉀0. 2g，磷酸二氫鉀0. 24g，磷酸氫二鈉3.58g溶解在1000毫升水中。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的在田間施用芥子酶制劑提高菜柏抑菌防病藥效的方法，其特征在于將芥子酶液用載體吸附所用的載體為過60目篩的草炭粉，該草炭粉經(jīng)121°C，滅菌40分鐘后使用，芥子酶液與草炭粉的混合比例為體積比I :8-1 10，混合后的混合物自然風(fēng)干或30°C烘干后過40目篩，即獲得芥子酶制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在田間施用芥子酶制劑提高菜粕抑菌防病藥效的方法，是通過芥子酶制劑促進菜粕中硫代葡萄糖苷快速降解，釋放異硫氰酸酯進而發(fā)揮抑菌防病的藥效，其特征在于土壤溫度在15℃以上，將田塊中前茬作物產(chǎn)生的殘體清除干凈，土壤施完底肥后旋耕20-25厘米，菜粕均勻灑入田間，菜粕用量為200-400公斤/畝，再將芥子酶制劑均勻灑入田間，芥子酶制劑用量為1-1.5公斤/畝，再將土壤旋耕、澆水，使得土壤水分含量為田間最大持水量的60-70%，并覆蓋塑料薄膜，土溫高于25℃時，覆膜，時間為15-20天，土溫低于25℃時，覆膜時間為20-30天，然后揭膜通氣2-3天，即可提高菜粕抑菌防病藥效。
文檔編號C12N9/24GK102972192SQ20121053083
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月11日
發(fā)明者馬艷, 常志州, 楊豪, 張建英, 徐躍定 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院