專利名稱：編碼豬β干擾素的基因片段及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼豬β干擾素的基因片段及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來(lái)豬病毒性傳染病日益泛濫，已嚴(yán)重地威脅著我國(guó)畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展。免疫抑制病及病毒抗原快迅變異，常導(dǎo)致疫苗免疫失??；加之不斷出現(xiàn)新的病毒病，目前還尚無(wú) 成功的疫苗接種預(yù)防。另ー方面，疫苗對(duì)疾病只有預(yù)防作用，治療還有賴于抗生素的使用。而ー些抗藥性菌株的出現(xiàn)，給人類食品和健康帶來(lái)極大的威脅，ー些國(guó)家已明令禁止在養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)用某些抗生素和抗菌劑。因此，生產(chǎn)中迫切需要ー種既有效又有利于環(huán)保的新方法來(lái)防控畜禽疾病。實(shí)踐證明，干擾素作為ー種廣譜的抗病毒劑，在病毒性傳染病的防控方面具有廣闊的應(yīng)用前景。傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法由中草藥等誘生劑誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素，因純化工藝復(fù)雜，產(chǎn)量少、作用緩和等諸多因素影響而極大限制了在臨床和科研的應(yīng)用。隨著豬干擾素基因的克隆成功，對(duì)其重組產(chǎn)物的臨床應(yīng)用及作用機(jī)理的研究也隨之展開(kāi)。1990年，Lefevre和LaBonnar等人在大腸桿菌中表達(dá)了 PoIFN-α I基因，得到了ー個(gè)含189個(gè)氨基酸的前體蛋白，去除其N端的含23個(gè)氨基酸的信號(hào)肽后，得到了具有完全天然PoIFN-α I生物學(xué)活性的產(chǎn)物，并且其在豬源性細(xì)胞上的抗病毒活性至少是病毒刺激豬白細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素的6倍。Pol JM等(1991)研究發(fā)現(xiàn)rPoIFN-a I能夠抑制偽狂犬病毒(PRV)強(qiáng)毒和中等毒力病毒在豬鼻腔黏膜組織stroma細(xì)胞層的増殖，PRV接種干擾素處理的豬成纖維細(xì)胞和豬腎細(xì)胞，病毒滴度明顯下降。Horisberger MA (1992)比較了重組PoIFN-α (rPoIFN-a )和重組PoIFN-Y (rPoIFN-Y )在豬的細(xì)胞中抗病毒活性的區(qū)別，發(fā)現(xiàn)rPoIFN- a可大大降低豬水泡性ロ炎病毒(VSV)在豬PK-15上引起的病變，井能削弱豬水泡性口炎病毒(VSV)和流感病毒在豬腎細(xì)胞中的復(fù)制，但rPoIFN-a和rPoIFN-γ對(duì)門戈病毒(一種腦心肌炎病毒)都有抗病毒作用。Jordan LT等(1994)發(fā)現(xiàn)rPoIFN-α對(duì)傳染性胃腸炎病毒(TGEV)有很好的預(yù)防作用。Tonomura N等(1996)研究發(fā)現(xiàn)HuIFN-α處理Vero后PRV的增殖受到抑制，PRV的立即早期基因的mRNA在干擾素處理的Vero中降低，瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)表明PRV IE啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄被選擇性抑制。BuddaertW (1998)對(duì)rPoIFN-α在體內(nèi)、外對(duì)豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒(PRRSV)的抗病毒活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)PRRSV在體內(nèi)、外對(duì)rPoIFN-α都很敏感，rPoIFN-α可明顯抑制PRRSV的產(chǎn)量和感染細(xì)胞的數(shù)量。chinsangaram J.等(2001)人用大腸桿菌表達(dá)rPoIFN-α或rPolFN-β并分別進(jìn)行了抗ロ蹄疫病毒(FMDV)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)rPoIFN-α和rPoIFN-β抑制FMDV復(fù)制是在蛋白質(zhì)翻譯水平上的，主要是激活雙鏈RNA依賴性蛋白激酶(PKR)作用的結(jié)果在細(xì)胞中加入PKR抑制劑2_氨基嘌呤后,病毒的產(chǎn)量就會(huì)上升；而RNase L和PKR基因缺失的細(xì)胞在干擾素的作用下仍能感染FMDV，這充分說(shuō)明了 PKR在抑制病毒復(fù)制中起作用。我國(guó)學(xué)者也對(duì)豬α干擾素進(jìn)行了多項(xiàng)研究。曹瑞兵等(2004)克隆了一種新的豬IFN-α基因并在大腸桿菌中進(jìn)行了其成熟蛋白的單純表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有較高的抗病毒活性。杜以軍等利用豬IFN-α的成熟蛋白基因構(gòu)建了重組腺病毒質(zhì)粒pAd-PoIFN-a轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞，滴度為107TCID5(l/mL。RT-PCR證明目的基因在mRNA水平上可有效表達(dá)；在PK-15細(xì)胞上可以檢測(cè)到較強(qiáng)的抗豬口蹄疫病毒活性，從而為研究豬口蹄疫免疫防治新技術(shù)奠定了重要基礎(chǔ)。謝海燕等(2004)克隆了豬IFN-a基因，構(gòu)建了原核表達(dá)載體，初步對(duì)其進(jìn)行了原核表達(dá)研究；我國(guó)學(xué)者夏春等(2005)報(bào)道了用pQE30表達(dá)載體在大腸桿菌原核表達(dá)的rPoIFN-α在豬源細(xì)胞和非豬源細(xì)胞系上可顯著抑制CSFV、PRRSV和VSV的增殖，證 明了原核表達(dá)PoIFN-a的可行性及將基因工程原核表達(dá)的PoIFN-α真正用于生產(chǎn)實(shí)踐中作為抗病毒制劑可行性。曹瑞兵等對(duì)豬IFN-a I基因進(jìn)行了改造，在保留編碼蛋白序列的同時(shí)，使用了大腸埃希菌的偏愛(ài)密碼子，將合成的豬IFN-a I成熟蛋白編碼基因插入原核單純表達(dá)載體PRLC中，實(shí)現(xiàn)了豬IFN-a I在大腸埃希菌中的高效表達(dá)，且重組豬IFN-a I具有較高的抗病毒活性，約為6.4X106U/mg。此外，葛麗等(2005)克隆了豬IFN-α基因，構(gòu)建了真核表達(dá)載體，初步對(duì)其做了畢赤酵母分泌表達(dá)研究。劉占通等對(duì)丹系長(zhǎng)白和法系長(zhǎng)白、英系大白和法系大白豬IFN-a基因進(jìn)行克隆，得到了上述4個(gè)品系的豬IFN-a基因，證明核苷酸同源性均在97. 2%以上，氨基酸同源性均在92. 8%以上。在豬β干擾素基因研究方面，2000年夏春等首次對(duì)豬干擾素β基因進(jìn)行分子克隆與測(cè)序，克隆片段長(zhǎng)668個(gè)核苷酸，編碼186個(gè)氨基酸。其中，76 636位含有I個(gè)0RF，蛋白分子量為21.8KU。除此之外，溫納相(2005)和彭貴青(2005)也對(duì)豬干擾素β的基因進(jìn)行了分子克隆與測(cè)序，并檢測(cè)其生物活性。在表達(dá)方面，曹瑞兵(2004)和吳陽(yáng)(2006)分別對(duì)豬β干擾素的基因進(jìn)行了原核表達(dá)，表達(dá)量分別為17. 3%和18%，表達(dá)產(chǎn)物均為融合蛋白。其中曹瑞兵用重組豬β干擾素處理豬腎傳代細(xì)胞ΡΚ-15后，細(xì)胞病變抑制法(CPE5tl)測(cè)定結(jié)果表明，重組豬β干擾素可顯著抑制豬流行性腹 寫病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)的感染。而后，為了研制高活性的重組豬β干擾素，曹瑞兵(2006)對(duì)豬干擾素β進(jìn)行畢赤酵母偏嗜性改造并構(gòu)建了酵母表達(dá)質(zhì)粒PPICZ α A-PIB, pPICZ a A-PIB電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入畢赤酵母菌株Χ_33后經(jīng)甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵高產(chǎn)量分泌表達(dá)豬IFN-β，其中BI株酵母的IFN-β產(chǎn)量最高，約為2. 5X IO5U/mL,其表達(dá)量約為60 μ g/mL,比活為4. 17 X 106U/mg。將發(fā)酵上清液用PEG20000濃縮后進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blot檢測(cè)，結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物是分子量約為28Ku和25Ku蛋白的混合物，兩者均可與豬IFN-β陽(yáng)性抗血清發(fā)生特異反應(yīng)。表達(dá)產(chǎn)物比豬IFN-β理論推導(dǎo)分子量(約20.8KU)大，推測(cè)可能是表達(dá)產(chǎn)物發(fā)生了不同程度的糖基化。重組豬IFN-β對(duì)偽狂犬病毒在細(xì)胞中増殖可呈現(xiàn)抑制作用，并且豬IFN-β對(duì)偽狂犬病毒在牛腎細(xì)胞(MadenDarbyBovine Kidney cells, MDBK)上早期增埴的抑制效果最為明顯。在豬Y干擾素基因研究方面，IFN-Y雖然只有ー種基因，但其結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，如編碼人和鼠IFN-Y的基因長(zhǎng)約6Kb，各包含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。IFN-Y與I型干擾素(IFN-α與IFN-β)田在基因和蛋白質(zhì)水平上沒(méi)有明顯的相關(guān)性(DeGrado，etal，1991)。雖然IFN-Y具有其它干擾素大多數(shù)的生物學(xué)活性，但在特異性抗病毒活性方面比IFN-α和IFN-β要低10-100倍，而在免疫調(diào)節(jié)活性方面要高100-10000倍(Pace, etal, 1985)。豬IFN- Y全基因編碼166個(gè)氨基酸殘基，其中包括20aa的信號(hào)肽(Di jkmans，etal，1990)。信號(hào)肽切除后，產(chǎn)生146個(gè)氨基酸的IFN-γ単體，分子量為17. 3ku，天然活性狀態(tài)的IFN-Y是由兩個(gè)IFN-Y單體經(jīng)非共價(jià)交聯(lián)形成的同源ニ聚體糖蛋白((Boehm, etal, 1997)。豬 IFN- Y 與人、小鼠、貓和犬的 IFN- Y 分別具有 60%，41%, 72%和 72%的同源性，而與IFN-β及IFN-α家族沒(méi)有明顯的同源性(Farrar and Schreiber, 1993)。國(guó)外最早于1990年由Roger等從基因水平開(kāi)展了對(duì)豬Y干擾素的研究，他們以人Y干擾素的cDNA為探針，克隆了豬Y干擾素基因，發(fā)現(xiàn)與人Y干擾素在DNA和氨基酸的水平上分別有75%和59%的同源性(Di jkmans et al.，1990)。隨后,Vandenbroeck等利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了豬Y干擾素(Vandenbroeck et al.，1991)。在我國(guó)，郭錸軍等于2001年首次克隆報(bào)道了豬Y干擾素基因序列(郭稼軍等，2001)。迄今為止，夏春，曹瑞兵(吳文學(xué)等，2002;曹瑞兵等，2003;曹瑞兵等，2004)等人以原核系統(tǒng)表達(dá)的干擾素具有較好的生物學(xué)活性。曹瑞兵等從經(jīng)刀豆蛋白A (ConcanavalinA，ConA)誘導(dǎo)培養(yǎng)的豬外周血白細(xì)胞中擴(kuò)增出豬IFN-Y基因，經(jīng)改造后插入原核表達(dá)載體pRLC，并實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的高效表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在，經(jīng)變性、復(fù)性、脫鹽、凝膠層析純化處理，重組豬IFN-Y具有較高的干擾素活性。趙英杰等成功構(gòu)建了表達(dá)重組豬IFN-Y的大腸埃希氏菌基因工程菌株，亞細(xì)胞定位分析表明，目的蛋白經(jīng)原核表達(dá)后主要以不溶性包涵體形式存在，其他少量可溶性目的蛋白存在于細(xì)胞漿中。其對(duì)長(zhǎng)白豬Y-干擾素基因的原核表達(dá)與分析，說(shuō)明幾種我國(guó)地方豬IFN-Y在基因的核苷酸以及蛋白的氨基酸水平上不存在差異和突變，同時(shí)也證實(shí)了長(zhǎng)白豬干擾素-Y基因的正確、完整克隆。為了研究和應(yīng)用豬重組干擾素-Y預(yù)防和治療病毒性疫病，夏春將大白豬IFN-Y基因插入到酵母整合載體PHIL-S1，構(gòu)建了重組GSl 15工程菌。經(jīng)過(guò)SDS-PAGE、Western_blot分析和抗水泡性口炎病毒(VSV)活性測(cè)定，證實(shí)豬IFN-Y分子量為18Ku，在GS115中的表達(dá)量為18%，具有抗VSV的活性。用豬IFN- Y處理豬肺巨噬細(xì)胞系Marc-145后，經(jīng)細(xì)胞病變抑制法測(cè)定，豬IFN-γ可以抵抗豬藍(lán)耳病病毒(PorcineReproductive and RespiratorySyndrome Virus, PRRSV)感染。但以上技術(shù)均具有原基因密碼子的表達(dá)量低、抗病毒活性低的缺陷。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是依據(jù)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)密碼子的偏嗜性，選擇高表達(dá)密碼子對(duì)豬α、β和Y干擾素成熟肽核苷酸序列進(jìn)行基因修飾和改造，并構(gòu)建出重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZ a C-IFN-a、pPICZa C-IFN-β 和 pPICZ a C-IFN-γ，其可以在畢赤酵母中對(duì)豬 α、β和Y干擾素正確且高效表達(dá)。密碼子改造后所分泌的蛋白干擾素具有更好的抗病毒活性。干擾素具有很高的生物活性，Img即具有I億個(gè)活性単位?；蛑亟M豬a、β干擾素都屬于I型干擾素，具有廣譜抗病毒活性；基因重組豬Y干擾素屬于II型干擾素，具有很好的免疫調(diào)節(jié)作用。通過(guò)基因工程方法，根據(jù)密碼子的偏嗜性，重新合成豬α、β、Y三種干擾素基因核苷酸序列，在優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件的基礎(chǔ)上，提高干擾素蛋白在畢赤酵母菌中的表達(dá)量，為大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。因此，在本發(fā)明基礎(chǔ)上，豬a、β、Υ三種干擾素推廣應(yīng)用前景廣闊。本發(fā)明提供了一種編碼豬α干擾素的基因片段，其具有如SEQ IDN0. I所示的核苷酸序列。用于擴(kuò)增其序列的上游引物Pa1具有如SEQID NO. 2所示的核苷酸序列；下游引物Pa2具有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。所述的基因片段可用于構(gòu)建可表達(dá)豬α干擾素的重組畢赤酵母。本發(fā)明還提供了一種編碼豬β干擾素的基因片段，其具有如SEQID NO. 4所示的核苷酸序列。用于擴(kuò)增其序列的上游引物PP1具有如SEQ ID Ν0.5所示的核苷酸序列；下游引物Ρβ2具有如SEQ ID Ν0.6所示的核苷酸序列。所述的基因片段可用于構(gòu)建可表達(dá)豬β干擾素的重組畢赤酵母。本發(fā)明還提供一種編碼豬Y干擾素的基因片段，其具有如SEQ IDN0.7所示的核苷酸序列。用于擴(kuò)增其序列的上游引物P Y1具有如SEQID NO. 8所示的核苷酸序列；下游引物PY2具有如SEQ ID Ν0.9所示的核苷酸序列。所述的基因片段可用于構(gòu)建可表達(dá)豬Y干擾素的重組畢赤酵母。構(gòu)建重組酵母時(shí)，采用的表達(dá)載體優(yōu)選是pPICZ α C，重組質(zhì)粒優(yōu)選是 pMD-IFN- α、pMD-IFN- β 和 pMD-IFN- y。與傳統(tǒng)方法的表達(dá)的干擾素相比，本發(fā)明通過(guò)研究，達(dá)到了表達(dá)量高，成本較低，效價(jià)較高，質(zhì)量穩(wěn)定，因此為產(chǎn)品轉(zhuǎn)化創(chuàng)造了先決條件，具有很好的市場(chǎng)潛カ和較強(qiáng)的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，更易在規(guī)?；i場(chǎng)中廣泛推廣應(yīng)用?；蛑亟M的豬α干擾素具有很好的抗病毒作用，可以單獨(dú)使用治療多種豬病毒性疾??；將表達(dá)的豬Y干擾素作為疫苗佐劑，與不同的疫苗聯(lián)合，可以研制出免疫效果更好的新型疫苗，將對(duì)豬病毒性疾病防治產(chǎn)生積極的影響。因此，本發(fā)明在市場(chǎng)上具有良好的應(yīng)用前景。在預(yù)防和治療豬病毒性疾病方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明通過(guò)精心設(shè)計(jì)，對(duì)豬三種干擾素進(jìn)行了基因修飾和改造，經(jīng)顯示系統(tǒng)表明，密碼子改造后所分泌蛋白豬三種干擾素具有更好的抗病毒活性。
圖I是本發(fā)明實(shí)施例的PoIFN-α改造前后的氨基酸序列關(guān)聯(lián)性； 圖2是本發(fā)明實(shí)施例的PoIFN- α改造前后的堿基序列關(guān)聯(lián)性；圖3是本發(fā)明實(shí)施例的PoIFN-β改造前后的氨基酸序列關(guān)聯(lián)性；圖4是本發(fā)明實(shí)施例的PoIFN- β改造前后的堿基序列關(guān)聯(lián)性；圖5是本發(fā)明實(shí)施例的PoIFN- Y改造前后的氨基酸序列關(guān)聯(lián)性；圖6是本發(fā)明實(shí)施例的PoIFN- Y改造前后的堿基序列關(guān)聯(lián)性。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)ー步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。(一)基因改造應(yīng)用DNASTAR (Version 5. O)基因分析軟件，參照NCBI GenBank上登載的豬干擾素α基因成熟肽核苷酸序列(ΑΥ331298)、豬干擾素β基因成熟肽核苷酸序列(S41178)和豬干擾素Y基因成熟肽序列(EU249804)，參照趙翔等畢赤酵母菌的密碼子用法分析以及TaKaRa公司的Pichia酵母密碼子表等，按照該序列氨基酸順序不變，因此表達(dá)的蛋白質(zhì)不發(fā)生變化，同時(shí)根據(jù)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)密碼子的偏嗜性，選擇高表達(dá)密碼子重新設(shè)計(jì)新序列，送由大連寶生物工程有限公司重新合成序列。I、豬α干擾素新序列，如SEQ ID NO. I所示，共501bp ;編碼166個(gè)氨基酸，如SEQID NO. 10 所示。引物Pa1 (SEQ ID N02) CG GAATTCCTGTGACTTGCCACAAACCCACT(標(biāo)有下劃線處為EcoRI限制性內(nèi)切酶)Pa2 (SEQ ID NO. 3) GG GGTACC TTACTCCTTCTTTCTCAATCTG(標(biāo)有下劃線處為KpnI限制性內(nèi)切酶)上、下游引物的理論跨幅為518bp，退火溫度58°C2、豬β干擾素新序列，如SEQ ID NO. 4所示，共498bp ;編碼165個(gè)氨基酸，如SEQID NO. 11 所示。P^1 (SEQ ID NO. 5) CG GAATTC CATGTCCTACGACGTCT(標(biāo)有下劃線處為EcoRI限制性內(nèi)切酶)Ρβ2 (SEQ ID NO. 6) GG GGTACC TTAGTTTCTCAAGTAGTCG(標(biāo)有下劃線處為KpnI限制性內(nèi)切酶)上、下游引物的理論跨幅為513bp，退火溫度52°C3、豬Y干擾素新序列，如SEQ ID NO. 7所示，共432bp ;編碼143個(gè)氨基酸，如SEQID NO. 12 所示。Py1 (SEQ ID NO. 8) CG GAATTC CCAG GCT CCA TTT TTC AA(標(biāo)有下劃線處為EcoRI限制性內(nèi)切酶)Py2 (SEQ ID NO. 9) GGGGTACC TTA CTT GGA GGC TCT CTG AC(標(biāo)有下劃線處為KpnI限制性內(nèi)切酶)上、下游引物的理論跨幅為449bp，退火溫度50. 7V(ニ)重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建(以 pPICZ a C-IFN- α 為例，pPICZ a C-IFN- β、pPICZ a C-IFN- y 與此相同)I、重組質(zhì)粒與表達(dá)載體的雙酶切對(duì)重組質(zhì)粒pMD-IFN-α進(jìn)行EcoR I和Kpn I雙酶切，雙酶切反應(yīng)體系如下
權(quán)利要求
1.一種編碼豬β干擾素的基因片段，其特征在于，具有如SEQ IDN0.4所示的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求I所述的基因片段，其特征在于，用于擴(kuò)增其序列的上游引物Ρβi具有如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列；下游引物P β2具有如SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的基因片段，其特征在于，用于擴(kuò)增其序列的PCR方法的退火溫度為 52。。。
4.權(quán)利要求f3所述的基因片段在構(gòu)建可表達(dá)豬β干擾素的重組畢赤酵母中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，采用的表達(dá)載體是pPICZα C，重組質(zhì)粒是pMD-IFN-β 。
6.一種豬β干擾素，其特征在于，其具有如SEQ ID NO. 11所示的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求6所述的豬β干擾素在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗病毒藥物為抗豬病毒性疾病的藥物。
9.一種抗病毒藥物，其特征在于，含有權(quán)利要求6所述的豬β干擾素。
全文摘要
本發(fā)明依據(jù)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)密碼子的偏嗜性，選擇高表達(dá)密碼子重新設(shè)計(jì)合成新的豬β干擾素成熟肽核苷酸序列。成功地構(gòu)建了重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZαC-IFN-β，不僅在畢赤酵母中對(duì)豬β干擾素實(shí)現(xiàn)了正確表達(dá)，而且使豬β干擾素在畢赤酵母菌中表達(dá)更容易，表達(dá)量更高，為基因工程大規(guī)模生產(chǎn)發(fā)酵奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/22GK102978213SQ20121052975
公開(kāi)日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2010年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日
發(fā)明者羅滿林, 陳瑞愛(ài), 劉健, 張欣, 唐明森 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué), 廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司