Hpv18型l2ne7e6融合蛋白基因、表達(dá)載體、方法、菌株和用途
【專利摘要】本發(fā)明提供一種在大腸桿菌中高效表達(dá)的人乳頭瘤病毒(HPV)18型L2NE7E6融合蛋白的基因、表達(dá)載體、方法、菌株和用途。本發(fā)明將HPV18型L2蛋白第11-200位氨基酸的L2N蛋白、E7蛋白、E6蛋白氨基酸序列融合，設(shè)計(jì)出適于大腸桿菌表達(dá)的密碼子優(yōu)化基因，將其插入原核表達(dá)載體pET9a，獲得pET9a-HPV18L2NE7E6表達(dá)載體及其轉(zhuǎn)化菌株，表達(dá)水平占全菌的50％，純化的融合蛋白免疫小鼠，產(chǎn)生的抗體能夠中和HPV18型假病毒，能夠產(chǎn)生特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答，并能明顯推遲小鼠成瘤時(shí)間，有20％的小鼠腫瘤生長受到完全抑制。本發(fā)明可用于預(yù)防和治療HPV18型感染及相關(guān)疾病的疫苗研發(fā)。
【專利說明】HPV18型L2NE7E6融合蛋白基因、表達(dá)載體、方法、菌株和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物【技術(shù)領(lǐng)域】。具體地，本發(fā)明涉及一種人乳頭瘤病毒(HPV)IS型L2NE7E6融合蛋白、其編碼基因、質(zhì)粒載體、制備方法及其免疫預(yù)防和治療用途。
【背景技術(shù)】
[0002]宮頸癌在世界范圍內(nèi)占女性惡性腫瘤的第二位，嚴(yán)重威脅著女性身體健康。生殖道的高危人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)感染與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān),大于90%的宮頸癌病人的宮頸樣本中可以檢測到HPV-DNA，其中HPV16的檢出率最高，其它高危型別在不同地區(qū)檢出率不同，在我國位于第二位的主要為HPV18。感染HPV18主要引起宮頸腺癌，其病變組織多位于子宮頸內(nèi)口，在進(jìn)行宮頸刮片篩查時(shí)不容易被檢測到，所以發(fā)現(xiàn)時(shí)腫瘤可能已長得較大，病情進(jìn)展較快且容易轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。因此，研制HPV18型別的疫苗對預(yù)防HPV18感染及相關(guān)腫瘤的治療具有重要意義。
[0003]目前預(yù)防性疫苗已獲得了巨大的成功，其免疫策略主要集中在基于LI衣殼蛋白形成的VLP疫苗可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)而持久的高滴度中和抗體來預(yù)防感染，由Merk公司用酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的HPV6、11、16、18型的VLP組成的四價(jià)疫苗Gardasi I和GSK公司用桿狀病毒與昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的HPV16U8型VLP蛋白組成的雙價(jià)疫苗Cervarix都已上市，兩者都具有很高的免疫原性，能夠保護(hù)90%的人群免受疫苗相應(yīng)型別HPV的感染。然而這種預(yù)防性疫苗目前只能用于沒有感染過HPV的健康人群，所以在較長時(shí)間內(nèi)仍存在大量感染HPV或?qū)m頸癌患者，而且這種VLP疫苗價(jià)格昂貴，限制了其在全球特別是在發(fā)展中國家的廣泛使用。與VLP相比 ，單獨(dú)次要衣殼L2蛋白雖然所誘發(fā)的特異性中和抗體滴度比較低，但是不同型別L2蛋白的N端氨基酸序列高度保守，使其具備誘發(fā)產(chǎn)生交叉中和抗體的能力，因此L2蛋白作為HPV廣譜預(yù)防性疫苗的候選疫苗具有研發(fā)的潛力。
[0004]治療性疫苗的目標(biāo)在于誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，將已感染HPV的細(xì)胞或已整合HPV DNA的細(xì)胞殺傷，從而控制或消除感染HPV的良性和惡性病灶，可作為HPV重度感染或相關(guān)腫瘤手術(shù)后的輔助治療。由于HPV E6、E7蛋白持續(xù)在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，是形成腫瘤并維持惡性特征所必需的癌蛋白，因此其成為了治療性疫苗研究的靶抗原。目前用于治療HPV16型感染的疫苗研究比較多，細(xì)胞免疫反應(yīng)在清除病毒感染中起重要作用，各種以E6、E7蛋白為靶抗原的治療性疫苗在免疫小鼠或人后，均可產(chǎn)生相應(yīng)的特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)。然而針對HPV18型的治療性疫苗研究相對較少，僅查到用DNA作為載體的HPVl8E6蛋白能夠誘發(fā)小鼠產(chǎn)生的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，用痘苗病毒作為載體表達(dá)的HPV18E6E7融合蛋白能夠誘發(fā)免疫后的人體產(chǎn)生不同程度的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。因此，有必要對HPV18型疫苗進(jìn)行研究和開發(fā)。
[0005]本研究選擇將HPV18型L2N(L2蛋白的第11-200位氨基酸)、E7、E6三個(gè)蛋白融合并按大腸桿菌的優(yōu)勢密碼子進(jìn)行密碼優(yōu)化，然后進(jìn)行原核表達(dá)，純化后的融合蛋白能誘發(fā)強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)，產(chǎn)生的抗體可以中和HPV18型假病毒，同時(shí)可誘發(fā)小鼠產(chǎn)生針對E6的特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)，并能明顯推遲小鼠成瘤時(shí)間，有20%的小鼠腫瘤生長受到完全抑制，預(yù)期在未來用于人體臨床試驗(yàn)中亦能表現(xiàn)出強(qiáng)的免疫原性。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]下面詳細(xì)討論本發(fā)明各種技術(shù)方案的制備和使用，但應(yīng)該理解，本發(fā)明提供了許多適用的發(fā)明構(gòu)思，其可以體現(xiàn)在各種各樣的具體方面上。
[0007]為有助于理解本發(fā)明，下面定義了一些術(shù)語。本文定義的術(shù)語具有本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義。術(shù)語可用于說明的具體實(shí)例的一般類別，但它們的使用不限制本發(fā)明，權(quán)利要求中所概括的除外。
[0008]除非另外指出，本文所述的“HPV”是指人乳頭瘤病毒(Humanpapillomavirus)；
[0009]除非另外指出，本文所述的“bp”是指堿基對(base pair)；
[0010]除非另外指出，本文所述的“ELISP0T”是指酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(Enzyme-linkedimmunospot)；
[0011 ] 除非另外指出，本文所述的“ IPTG”是指異丙基硫代-β -D半乳糖苷(Isopropylthio-β -D-galactoside)；
[0012]除非另外指出，本文所述的“SDS-PAGE”是指十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)；
[0013]除非另外指出，本文所述的“HRP”是指辣根過氧化物酶(Horseradishperoxidase)；
[0014]除非另外指出，本文所述的“ IFN-Y ”是指Y-干擾素(Interferon gamma)；
[0015]除非另外指出，本文所述的“PBS”是指磷酸鹽緩沖液(Phosphatebufferedsaline)；
[0016]本發(fā)明旨在提供一種能簡單、經(jīng)濟(jì)、有效的制備人乳頭瘤病毒HPV18L2NE7E6融合蛋白的基因核苷酸序列，該基因能在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，表達(dá)蛋白能用于HPV18型感染和相關(guān)疾病(如宮頸癌)的預(yù)防和治療。
[0017]具體而言，本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種人乳頭瘤病毒(HPV) 18型L2NE7E6融合蛋白。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供一種用于編碼前述的人乳頭瘤病毒(HPV)IS型L2NE7E6融合蛋白的DNA序列。本發(fā)明的再一個(gè)目的在于，提供一種大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒載體。本發(fā)明的又一個(gè)目的在于，提供一種用于生產(chǎn)前述的人乳頭瘤病毒(HPV)18型L2NE7E6融合蛋白的大腸桿菌菌株。本發(fā)明的還一個(gè)目的在于，提供一種制備前述的人乳頭瘤病毒(HPV) 18型L2NE7E6融合蛋白的方法。
[0018]針對上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:
[0019]一方面，本發(fā)明提供一種人乳頭瘤病毒(HPV)18型L2N蛋白與E7蛋白、E6蛋白融合在一起的融合蛋白，其氨基酸序列為SEQ.1D.N0.1所示的序列。本申請中，以“HPV18L2NE7E6”或“L2NE7E6”表示該融合蛋白。
[0020]另一方面，本發(fā)明提供一種用于前述的人乳頭瘤病毒(HPV) 18型L2NE7E6融合蛋白的DNA序列，所述DNA序列的核苷酸序列為SEQ.1D.N0.2所示的序列。
[0021]再一方面，本發(fā)明提供一種用于表達(dá)前述融合蛋白的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含前述的DNA序列；優(yōu)選地，所述表達(dá)載體為原核或真核表達(dá)載體；更優(yōu)選地，所述表達(dá)載體為大腸桿菌質(zhì)粒載體。
[0022]優(yōu)選地，所述大腸桿菌質(zhì)粒載體是由前述HPV18型的L2NE7E6融合蛋白基因DNA序列插入至質(zhì)粒pET9a的Nde I和BamH I位點(diǎn)間來構(gòu)建的。
[0023]優(yōu)選地，前述大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒載體中，所述的大腸桿菌是BL21 (DE3)。
[0024]又一方面，本發(fā)明提供一種用于生產(chǎn)前述的人乳頭瘤病毒(HPV) 18型的L2NE7E6融合蛋白的大腸桿菌菌株，所述大腸桿菌菌株含有前述的表達(dá)載體；優(yōu)選地，所述菌株為大腸桿菌；更優(yōu)選地，所述大腸桿菌選自BL21(DE3)等適宜表達(dá)pET9a的菌株。
[0025]還一方面，本發(fā)明提供一種制備前述的人乳頭瘤病毒(HPV) 18型L2NE7E6融合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟:
[0026]I)將前述的HPV18L2NE7E6融合蛋白基因DNA序列插入大腸桿菌表達(dá)載體pET9a的Nde I和BamH I位點(diǎn)，構(gòu)建出重組表達(dá)載體pET9a_HPV18L2NE7E6 ；
[0027]2)用步驟I)所構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得含有該重組表達(dá)載體的菌株，接種培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；
[0028]3)將步驟2)所得到的大腸桿菌離心裂解后，收獲包涵體，用8M尿素懸起，離心，取上清用鎳離子親和層析柱純化表達(dá)蛋白。
[0029]優(yōu)選地，在本發(fā)明制備前述的人乳頭瘤病毒HPV18L2NE7E6融合蛋白的方法中，所述的大腸桿菌選自BL21 (DE3)等適宜表達(dá)pET9a的菌株。 [0030]另一方面，本發(fā)明提供一種制備用于治療及預(yù)防人乳頭瘤病毒18型感染及其相關(guān)疾病(如宮頸癌)藥物的方法。
[0031]此外，本發(fā)明還提供了前述的人乳頭瘤病毒HPV18L2NE7E6融合蛋白、前述的人乳頭瘤病毒HPV18L2NE7E6融合蛋白的DNA序列、前述的原核表達(dá)載體或前述的大腸桿菌菌株在制備用于預(yù)防和治療人乳頭瘤病毒18型感染及其相關(guān)疾病(如宮頸癌)藥物中的應(yīng)用；優(yōu)選地，所述的藥物為疫苗。
[0032]本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防和治療HPV18型感染及相關(guān)疾病(如宮頸癌)的疫苗，所述疫苗包括前述的人乳頭瘤病毒HPV18L2NE7E6融合蛋白、前述的人乳頭瘤病毒HPV18L2NE7E6融合蛋白的DNA序列、前述的原核表達(dá)載體或前述的大腸桿菌菌株。
[0033]下面根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，結(jié)合說明書附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)說明:
[0034]本實(shí)驗(yàn)采用基因工程技術(shù)，根據(jù)從宮頸癌患者分離測序獲得的HPV18次要衣殼蛋白L2N蛋白核苷酸序列和與早期蛋白E7、E6核苷酸序列，設(shè)計(jì)出融合蛋白HPV18L2NE7E6的氨基酸序列，然后根據(jù)大腸桿菌優(yōu)勢密碼子及mRNA的二級結(jié)構(gòu)綜合分析，設(shè)計(jì)出編碼HPV18L2NE7E6融合蛋白的核苷酸序列，經(jīng)公司合成并克隆至原核表達(dá)載體pET9a，改造基因獲得高效表達(dá)，表達(dá)水平占全菌的50%，表達(dá)蛋白經(jīng)純化后免疫小鼠，用動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)評價(jià)合成基因表達(dá)蛋白的免疫原性。
[0035]本發(fā)明根據(jù)優(yōu)化密碼子的基因序列來生產(chǎn)乳頭瘤病毒18型L2NE7E6融合蛋白的方法包括以下步驟:
[0036]將設(shè)計(jì)的密碼子優(yōu)化HPV18L2NE7E6基因片段插入大腸桿菌表達(dá)載體pET9a的NdeI和BamH I位點(diǎn)，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得含有pET9a_HPV18L2NE7E6的菌株，接種培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；[0037]表達(dá)菌體經(jīng)離心裂解后,收獲包涵體,用8M尿素懸起,離心,取上清用鎳離子親和層析柱純化表達(dá)蛋白。
[0038]優(yōu)選地，在本發(fā)明生產(chǎn)HPV18L2NE7E6融合蛋白的方法中，所述的大腸桿菌是BL21(DE3) (BL2KDE3)是常用的大腸桿菌表達(dá)菌株，一般配合以強(qiáng)表達(dá)載體來進(jìn)行目的基因的強(qiáng)表達(dá))。
[0039]本發(fā)明的含有重組質(zhì)粒pET9a_HPV18L2NE7E6的大腸桿菌菌株能用于研制治療人乳頭瘤病毒18型感染和與此感染相關(guān)的疾病(如宮頸癌)藥物。
[0040]眾所周知，同一種氨基酸有幾組密碼子，生物學(xué)上將幾組密碼子代表一種氨基酸的現(xiàn)象稱為密碼子的簡并性，而簡并性主要是由于密碼子的第三個(gè)堿基發(fā)生擺動(dòng)現(xiàn)象形成的，也就是說密碼子的專一性主要由前兩個(gè)堿基決定，即使第三個(gè)堿基發(fā)生突變也能翻譯出正確的氨基酸，這對于保證物種的穩(wěn)定性有一定意義；例如:G⑶，GCC, GCA, GCG均代表丙氨酸。除色氨酸和甲硫氨酸外，其他氨基酸的密碼子均多于I個(gè)(2~6個(gè))。簡并性并不意味著密碼不完善，每個(gè)密碼子只對應(yīng)I種氨基酸。簡并性可使突變的有害影響減到最小。大部分密碼子具有簡并性，即兩個(gè)或者多個(gè)密碼子編碼同一氨基酸。簡并的密碼子通常只有第三位堿基不同，例如，GAA和GAG都編碼谷氨酰胺。如果不管密碼子的第三位為哪種核苷酸，都編碼同一種氨基酸，則稱之為四重簡并；如果第三位有四種可能的核苷酸之中的兩種，而且編碼同一種氨基酸，則稱之為二重簡并，一般第三位上兩種等價(jià)的核苷酸同為嘌呤(A/G)或者嘧啶(C/T)。只有兩種氨基酸僅由一個(gè)密碼子編碼，一個(gè)是甲硫氨酸，由AUG編碼，同時(shí)也是起始密碼子；另一個(gè)是色氨酸，由UGG編碼。遺傳密碼的這些性質(zhì)可使基因更加耐受點(diǎn)突變。例如，四重簡并密碼子可以容忍密碼子第三位的任何變異；二重簡并密碼子使三分之一可能的第三位的變異不影響蛋白質(zhì)序列。由于轉(zhuǎn)換變異(嘌呤變?yōu)猷堰驶蛘哙奏ぷ優(yōu)猷奏?比顛換變異(嘌呤變?yōu)猷奏せ蛘哙奏ぷ優(yōu)猷堰?的可能性更大，因此二重簡并密碼子也具有很強(qiáng)的對抗突變的能力。遺傳學(xué)上將基因的這種不影響氨基酸序列的突變稱為沉默突變。然而，在特定的表達(dá)菌株中`，在不改變蛋白的氨基酸序列的前提下，使用不同的密碼子對編碼蛋白的產(chǎn)量有著非常顯著的影響。因此，從多種密碼子中選擇特定的密碼子以獲得較高蛋白產(chǎn)量稱為“密碼子優(yōu)化”。對于分子量較大，即組成的氨基酸數(shù)目較多的蛋白而言，尋找及確定密碼子優(yōu)化的核苷酸序列是具有相當(dāng)難度的。
[0041]本發(fā)明人從增強(qiáng)疫苗的免疫原性、并能在大腸桿菌中高效表達(dá)兩方面考慮:L2的主要目的是誘導(dǎo)體液免疫即中和抗體，同時(shí)作為前導(dǎo)蛋白提高E7E6蛋白的表達(dá)，因此將L2蛋白截短僅保留含有中和抗體表位的第11-200位氨基酸的L2N蛋白，進(jìn)行設(shè)計(jì)研制HPV18L2NE7E6融合蛋白疫苗，以使L2N、E7、E6三個(gè)靶抗原融合后能得以高效表達(dá)(一般分子量太大，表達(dá)水平會(huì)低)，并根據(jù)大腸桿菌優(yōu)勢密碼子，設(shè)計(jì)出編碼HPV18L2NE7E6融合蛋白的核苷酸序列，然后根據(jù)設(shè)計(jì)序列合成后，將其插入原核表達(dá)載體pET9a，實(shí)驗(yàn)證實(shí)改造基因獲得高效表達(dá)，表達(dá)水平占全菌的約50%，并進(jìn)行了該蛋白的純化，免疫C57BL/6小鼠后，經(jīng)ELISA抗體檢測表明該蛋白在小鼠體內(nèi)誘發(fā)了強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)，所產(chǎn)生的抗體能夠中和HPV18型假病毒，ELISP0T檢測免疫后的小鼠可產(chǎn)生針對HPV18型E667_75多肽較高水平的特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)，小鼠腫瘤模型實(shí)驗(yàn)表明免疫后的小鼠能明顯推遲腫瘤形成的時(shí)間，有20%的小鼠腫瘤生長受到完全抑制。本發(fā)明可用于研發(fā)預(yù)防和治療性HPV18型感染和相關(guān)疾病(如宮頸癌)的疫苗。[0042]本發(fā)明具有如下的明顯優(yōu)點(diǎn):
[0043]本發(fā)明中含有可產(chǎn)生中和抗體的HPV18型L2N蛋白，且同時(shí)含有能夠引起細(xì)胞免疫反應(yīng)的E7和E6蛋白，使用本發(fā)明的優(yōu)化基因能夠獲得高效表達(dá)，表達(dá)水平占全菌的50%，表達(dá)蛋白經(jīng)純化免疫小鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該蛋白具有很好的免疫原性，產(chǎn)生的抗體能夠中和HPV18型假病毒，能夠產(chǎn)生針對E667_75多肽特異性的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，并能明顯推遲小鼠腫瘤形成時(shí)間，有20%的小鼠腫瘤生長受到完全抑制。該優(yōu)化基因建立的HPV18L2NE7E6融合蛋白原核高效表達(dá)系統(tǒng)能用于HPV18感染和相關(guān)疾病(如宮頸癌)的預(yù)防和治療性疫苗的中試生產(chǎn)及新藥研發(fā)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0044]以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中:
[0045]圖1為本發(fā)明實(shí)施例3中所使用的PMD18-T質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)圖譜；
[0046]圖2為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例3的方法構(gòu)建的重組原核克隆質(zhì)粒pMD18-HPV18L2NE7E6的結(jié)構(gòu)簡圖；
[0047]圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中所使用的pET9a質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)圖譜；
[0048]圖4為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例3的方法構(gòu)建的重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET9a_HPV18L2NE7E6的結(jié)構(gòu)簡圖；
[0049]圖5為HPV18L2NE7E6融合蛋白原核表達(dá)SDS-PAGE，電泳結(jié)果具體為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例4進(jìn)行的在大腸桿菌中表達(dá)的SDS-PAGE凝膠分析的結(jié)果；其中，M為低分子量蛋白質(zhì)Marker, I為空載體對照，2為誘導(dǎo)后基因表達(dá)產(chǎn)物；
[0050]圖6為HPV18L2N`E7E6融合蛋白的Western blot鑒定結(jié)果，具體為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例5進(jìn)行的在大腸桿菌中表達(dá)蛋白的Western-blot鑒定結(jié)果；其中，M為低分子量蛋白質(zhì)Marker, I為空載體對照,2為誘導(dǎo)后基因表達(dá)產(chǎn)物；
[0051]圖7為純化后的HPV18L2NE7E6融合蛋白SDS-PAGE純度分析，具體為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例6進(jìn)行的在原核系統(tǒng)表達(dá)經(jīng)鎳離子親和層析純化后的SDS-PAGE凝膠分析的結(jié)果，其中，M為低分子量蛋白質(zhì)Marker，I為純化后的HPV18L2NE7E6蛋白；
[0052]圖8為HPV18L2NE7E6融合蛋白在C57BL/6小鼠體內(nèi)誘發(fā)的體液免疫反應(yīng)，具體為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例7進(jìn)行的表達(dá)蛋白經(jīng)純化，免疫小鼠后的總抗體滴度檢測的結(jié)果；
[0053]圖9為HPV18L2NE7E6融合蛋白在C57BL/6小鼠體內(nèi)誘發(fā)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，具體為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例7進(jìn)行的表達(dá)蛋白經(jīng)純化，免疫小鼠后的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISP0T)檢測結(jié)果。
[0054]圖10為HPV18L2NE7E6融合蛋白在C57BL/6小鼠體內(nèi)誘發(fā)的抗腫瘤免疫反應(yīng)，具體為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例7進(jìn)行的表達(dá)蛋白經(jīng)純化，免疫移植腫瘤細(xì)胞的小鼠后觀察腫瘤生長情況。
【具體實(shí)施方式】
[0055]以下參照具體的實(shí)施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0056]下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。
[0057]實(shí)施例1:設(shè)計(jì)人乳頭瘤病毒18型L2NE7E6融合蛋白大腸桿菌表達(dá)的優(yōu)化密碼子基因序列
[0058]首先將從宮頸癌患者分離測序獲得的HPV18序列與Genebank中序列比對，其與AY262282 —致，然后將次要衣殼蛋白L2N蛋白的核苷酸序列與早期蛋白E7、E6核苷酸序列融合，并去掉E7、E6蛋白的起始密碼子和E7的終止密碼子，同時(shí)考慮到E7、E6蛋白為HPV18型的癌蛋白，出于對疫苗的安全性考慮，將其與致癌位點(diǎn)相關(guān)的氨基酸進(jìn)行突變，分別是將E7蛋白第27位的Cys和第29位的Glu突變?yōu)镚ly，E6第65位氨基酸由Cys突變?yōu)镚ly，設(shè)計(jì)出編碼HPV18L2NE7E6融合蛋白的氨基酸序列，得到具體如SEQ ID NO:1所示的融合蛋白(融合蛋白從N — C端依次為L2N、E7、E6，共451個(gè)氨基酸)。
[0059]利用基因簡并性，在其編碼的產(chǎn)物蛋白氨基酸序列保持不變的前提下設(shè)計(jì)出優(yōu)化密碼子核苷酸序列，發(fā)明人將該序列命名為HPV18L2NE7E6，經(jīng)實(shí)驗(yàn)檢測證明，此序列適于在大腸桿菌中表達(dá)HPV18L2NE7E6融合蛋白，其序列具體如SEQ ID NO:2所示。
[0060]實(shí)施例2:合成密碼子優(yōu)化的基因序列，并構(gòu)建含18L2NE7E6目的基因片段的克隆質(zhì)粒
[0061]由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成質(zhì)粒pGH-18-33，該質(zhì)粒含有根據(jù)大腸桿菌優(yōu)勢密碼子設(shè)計(jì)的HPV18L2蛋白的第1-600位核苷酸基因片段，先用PCR方法增出L2N蛋白的基因片段，其中上游引物Pl:L2F中含有6個(gè)組氨酸并同時(shí)含有Nde I酶切位點(diǎn)，下游引物P2:L2R中含有BamH I酶切位點(diǎn)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(引物具體序列如表1所示)。然后將擴(kuò)增的PCR片段插入克隆載體pMDlS-Τ中構(gòu)建出PMD18-HPV18L2N,經(jīng)測序證實(shí)HPV18L2N基因序列與設(shè)計(jì)序列相符。HPV18L2N具體序列如下: [0062]
【權(quán)利要求】
1.一種人乳頭瘤病毒(HPV)18L2NE7E6融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列為SEQ.1D.N0.1所示的序列。
2.一種用于編碼權(quán)利要求1所述的人乳頭瘤病毒(HPV) 18L2NE7E6融合蛋白的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列的核苷酸序列為SEQ ID N0.2所示的序列。
3.一種用于表達(dá)權(quán)利要求1所述融合蛋白的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體含有權(quán)利要求2所述的DNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于表達(dá)權(quán)利要求1所述融合蛋白的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體為原核或真核表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于表達(dá)權(quán)利要求1所述融合蛋白的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體為大腸桿菌質(zhì)粒載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述大腸桿菌質(zhì)粒載體是由權(quán)利要求2所述的DNA序列插入至質(zhì)粒pET9a的NdeI和BamH I位點(diǎn)間來構(gòu)建的。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述大腸桿菌BL21(DE3)。
8.一種用于生產(chǎn)權(quán)利要求1所述融合蛋白的菌株，其特征在于，所述菌株含有權(quán)利要求3至7中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于生產(chǎn)權(quán)利要求1所述融合蛋白的菌株，其特征在于所述菌株為大腸桿菌BL21(DE3)。
10.一種制備權(quán)利要求1所述融合蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: 1)將權(quán)利要求2所述的DNA`序列插入至質(zhì)粒pET9a的NdeI和BamHI，構(gòu)建出重組表達(dá)質(zhì)粒 pET9a-HPV18L2NE7E6 ； 2)用步驟I)所構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得含有該重組表達(dá)質(zhì)粒的菌株，接種培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)； 3)將步驟2)所得到的大腸桿菌離心裂解后，收獲包涵體，用SM尿素懸起，離心，取上清用鎳離子親和層析柱純化表達(dá)蛋白。
11.一種制備用于預(yù)防和治療人乳頭瘤病毒18型感染及其相關(guān)疾病(如宮頸癌)藥物的方法，其特征在于，該方法包括將權(quán)利要求2所述的DNA序列、權(quán)利要求3至7中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體、權(quán)利要求8至9所述的菌株用于表達(dá)權(quán)利要求1所述的人乳頭瘤病毒(HPV) 18型L2NE7E6融合蛋白。
12.權(quán)利要求1所述的人乳頭瘤病毒(HPV)18型L2NE7E6融合蛋白、權(quán)利要求2所述的人乳頭瘤病毒(HPV) 18型L2NE7E6融合蛋白的DNA序列、權(quán)利要求3至7任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體、或權(quán)利要求8-9任一項(xiàng)所述的菌株在制備用于預(yù)防和治療人乳頭瘤病毒18型感染及其相關(guān)疾病(如宮頸癌)的藥物中的應(yīng)用； 優(yōu)選地，所述藥物為疫苗。
13.一種用于預(yù)防和治療宮頸癌的疫苗，其特征在于，所述疫苗包括權(quán)利要求1所述的融合蛋白、權(quán)利要求2所述的DNA序列、3至7任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體、或權(quán)利要求8-9任一項(xiàng)所述的菌株。
【文檔編號】C12N1/21GK103864936SQ201210528408
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月11日
【發(fā)明者】田厚文, 趙莉, 任皎, 馮靖, 龐正, 阮力, 譚文杰 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所