專利名稱：用于檢測弗氏枸櫞酸桿菌的靶基因及檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及用于檢測弗氏枸櫞酸桿菌的靶基因以及檢測該基因的引物和探針，本發(fā)明還涉及利用該引物和探針進行弗氏枸櫞酸桿菌檢測的試劑盒。
背景技術(shù)：
弗氏枸櫞酸桿菌(Citrobacter freundii)屬于枸櫞酸桿菌屬,腸桿菌科。革蘭氏陰性桿菌，兼性厭氧，周身鞭毛，菌毛，無芽胞，無莢膜。弗氏枸櫞酸桿菌廣泛存在自然界，是人類和動物腸道的寄生菌。已有文獻報道它可引起原發(fā)和繼發(fā)的感染。弗氏枸櫞酸桿菌可以在正常人和動物的糞便以及環(huán)境中分離到。然而，研究者逐漸認(rèn)識到弗氏枸櫞酸桿菌可以引起腹瀉和其他感染如尿道感染、腦膜炎、膿毒癥以及醫(yī)院獲得性感染。 與其他腸道病原菌如大腸桿菌、沙門氏菌、痢疾桿菌等相比，弗氏枸櫞酸桿菌很少被報道引起腹瀉等腸胃炎。這可能與臨床樣本篩查中，很少將弗氏枸櫞酸桿菌作為常規(guī)篩查的菌株。但是，弗氏枸櫞酸桿菌也能引起一些偶發(fā)和爆發(fā)的病例。弗氏枸櫞酸桿菌也引起類似大腸桿菌引起的重癥腸胃炎。Tschape等報道弗氏枸櫞酸桿菌在德國的一家托兒所和幼兒園引起的暴發(fā)，造成腸胃炎152例，其中8例發(fā)展為HUS。Ibenyassine等對食品進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)食品中發(fā)現(xiàn)弗氏枸櫞酸桿菌的檢出率可達18. 7%，我國的多個研究中也表明食品中弗氏枸櫞酸桿菌也有較高的分離率。在我國，一些食物中毒或腹瀉病人的糞便標(biāo)本中，不能分離到常見的致病菌，卻能分離到弗氏枸櫞酸桿菌。弗氏枸櫞酸桿菌也可能是院內(nèi)感染最重要的致病菌之一，2002年在日本名古屋的一所醫(yī)院外科發(fā)生了耐三代頭孢的弗氏枸櫞酸桿菌感染的小型暴發(fā)。研究提示弗氏枸櫞酸桿菌可能是一種尚未被人們充分認(rèn)識的腸道病原菌。在感染性腹瀉病原菌檢測過程中，往往忽略對弗氏枸櫞酸桿菌的檢測，且目前沒有特異的弗氏枸櫞酸桿菌的篩選培養(yǎng)基。弗氏枸櫞酸桿菌很難和其他腸道菌區(qū)別，目前只能通過生化鑒定來進行分開。然而生物鑒定費時費力，不利于臨床對病原菌快速檢測的要求。近年來,實時突光TaqMan PCR技術(shù)(real time TaqMan PCR, TaqMan是羅氏公司的注冊商標(biāo))廣泛應(yīng)用于多種病原微生物的檢測，與普通PCR方法相比較，實時熒光TaqManPCR技術(shù)在普通PCR的基礎(chǔ)上加入一條特異的熒光探針，并且該技術(shù)對引物與模板的同源性要求也高于普通PCR。實時熒光TaqMan PCR中的探針序列必須與目標(biāo)序列完全匹配，熒光基團連接在探針的5’末端，而淬滅劑則在3’末端。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，但在PCR擴增時，隨著引物的延伸Tag酶的5’到3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光檢測系統(tǒng)可接受到熒光信號。即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。因此實時熒光定量PCR方法比普通PCR法具有更高的特異性。但是在熒光TaqMan PCR技術(shù)的應(yīng)用中，探針的選擇是一個重要因素，因為其涉及到與引物的匹配，以及最關(guān)鍵的檢測特異性的問題。目前，在國內(nèi)外研究中，沒有對弗氏枸櫞酸桿菌進行熒光定量PCR檢測方法的報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于提供用于檢測弗氏枸櫞酸桿菌的靶基因。本發(fā)明的第二個目的在于提供針對上述靶基因的特異性引物和探針；本發(fā)明的第三個目的在于提供檢測弗氏枸櫞酸桿菌的試劑盒?；谝陨夏康模景l(fā)明對弗氏枸櫞酸桿菌的TTRP基因與NCBI上公布的其他細(xì)菌 的核苷酸序列進行反復(fù)比對和篩選，發(fā)現(xiàn)弗氏枸櫞酸桿菌的TTRP基因僅與沙門氏菌同源性較高，同源性達到84%，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。而且該基因在100bp_650bp之間特異性很高，具有高度的保守性，可以很好的區(qū)分弗氏枸櫞酸桿菌與其相近的沙門氏菌和枸櫞酸桿菌屬的其他種。本發(fā)明針對弗氏枸櫞酸桿菌的一個三羧酸循環(huán)調(diào)控基因(簡稱TTRP)特有序列設(shè)計引物和TaqMan探針，并將獲得的特異性引物和探針在NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，以排除引物-探針與其他物種序列可能存在的非特異性匹配，最終獲得優(yōu)化后的引物、探針序列。進一步，本發(fā)明提供用于特異性擴增上述靶基因序列或其特異片段的引物，以及與所述引物配合使用的熒光探針。其中探針的5’標(biāo)記熒光基團FAM，3’標(biāo)記淬滅基團BHQ1。上游引物選自于TTRP基因的第211到229位核苷酸。下游引物選自TTRP基因的第104到126位核苷酸。本發(fā)明提供的優(yōu)選的弓I物序列為上游引物GCAGGACAGGAAGCGTCTG，下游引物CAGCCGACCATCTTTTACATAGC。探針序列序列為FAM-AGCCGCTGAACGACTTCCAGACCA-BHQ1本發(fā)明提供一種弗氏枸櫞酸桿菌的實時熒光定量PCR檢測方法，包括以樣品總DNA為模板，利用本發(fā)明提供的引物和探針進行實時熒光定量PCR，同時設(shè)立無模板對照和陽性對照，根據(jù)擴增曲線判定結(jié)果。本發(fā)明提供了一種用于檢測弗氏枸櫞酸桿菌的試劑盒，其包括上述能特異地擴增出如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或其特異性片段的特異性引物以及配合引物使用的Taqman 探針。本發(fā)明試劑盒的引物序列為上游引物GCAGGACAGGAAGCGTCTG，下游引物CAGCCGACCATCTTTTACATAGC。探針序列序列為FAM-AGCCGCTGAACGACTTCCAGACCA-BHQI本發(fā)明提供的試劑盒，還可進一步包括DNA裂解液，熒光定量反應(yīng)液，陰性模板和陽性模板，所述陰性模板為雙蒸水，所述陽性模板為弗氏枸櫞酸桿菌基因組DNA。本發(fā)明的試劑盒，其20 μ L總工作體系為
權(quán)利要求
1.一種用于檢測弗氏枸櫞酸桿菌(Citrobacter freundii)的祀基因,其特征在于,其為三羧酸循環(huán)調(diào)控基因TTRP，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一種用于檢測弗氏枸櫞酸桿菌的特異性引物，其特征在于，其擴增產(chǎn)物為權(quán)利要求1所述靶基因或其特異性片段。
3.如權(quán)利要求2所述的特異性引物，其特征在于，其核苷酸序列為 上游引物GCAGGACAGGAAGCGTCTG， 下游引物CAGCCGACCATCTTTTACATAGC。
4.與權(quán)利要求2或3所述特異性引物配合使用的熒光探針。
5.如權(quán)利要求4所述的熒光探針，其核苷酸序列為 FAM-AGCCGCTGAACGACTTCCAGACCA-BHQI。
6.含有權(quán)利要求2或3所述引物和/或權(quán)利要求4或5所述探針的試劑盒。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還包括DNA裂解液、熒光定量反應(yīng)液、陰性模板、陽性模板，所述陰性模板為雙蒸水，所述陽性模板為弗氏枸櫞酸桿菌基因組DNA。
8.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，其20μ L總工作體系為 試劑體積pL濃度 2χ Premix, Ex, Taq10,0Ix 上游引物0.4ΙΟμΜ 下游引物0.4ΙΟμΜ 探針0.4ΙΟμΜ DNA模極1.0去核酸水7.8e
9.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，其工作程序為95°C預(yù)變性30sec，l個循環(huán)；95°C變性5sec，60°C退火30sec，40個循環(huán)。
10.含有權(quán)利要求2或3所述引物和/或權(quán)利要求4或5所述探針的診斷試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于檢測弗氏枸櫞酸桿菌的靶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明還提供了實時熒光定量PCR引物和探針，引物和探針的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4。本發(fā)明還提供了檢測弗氏枸櫞酸桿菌的試劑盒。本發(fā)明的檢測方法及其試劑盒具有檢測準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性強，簡便快速的優(yōu)點，具有良好的臨床標(biāo)本檢測能力。
文檔編號C12N15/31GK103014024SQ20121051968
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月6日
發(fā)明者劉麗云, 金東 , 王藝婷, 徐建國, 葉長蕓 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所