两个人的电影免费视频_国产精品久久久久久久久成人_97视频在线观看播放_久久这里只有精品777_亚洲熟女少妇二三区_4438x8成人网亚洲av_内谢国产内射夫妻免费视频_人妻精品久久久久中国字幕

一種紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法

文檔序號(hào):535094閱讀:581來(lái)源:國(guó)知局
專(zhuān)利名稱(chēng):一種紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明專(zhuān)利涉及一種細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,特別是指一種紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,屬于種子培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)
紫杉醇(Taxol)是最早從紅豆杉植物樹(shù)皮中分離提取出來(lái)的一種二萜類(lèi)生物堿,作為治療晚期卵巢癌、乳腺癌的首選抗癌藥,從1992年上市后,因資源缺乏,價(jià)格昂貴。目前紫杉醇原料藥來(lái)源主要有三種途徑一種是從紅豆杉種植枝葉中提取后得到紫杉醇,但因紅豆杉生長(zhǎng)緩慢,生產(chǎn)周期長(zhǎng)達(dá)3飛年,枝葉中紫杉醇含量低,導(dǎo)致紫杉醇的提取成本高。二是通過(guò)Baccatin III和1(TDAB等前體半合成紫杉醇,但所需要的半合成前 體也來(lái)源于種植枝葉,同樣受到提取原料來(lái)源的限制,仍然不能滿(mǎn)足臨床和試驗(yàn)對(duì)紫杉醇的大量需求。三是各國(guó)科學(xué)家采用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來(lái)解決紫杉醇藥源緊缺的問(wèn)題,通過(guò)紅豆杉植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紫杉醇被認(rèn)為是目前替代種植和半合成紫杉醇原料藥來(lái)源的最重要的途經(jīng)之一,其特點(diǎn)是1、細(xì)胞生產(chǎn)培養(yǎng)周期短、紫杉醇含量高(通過(guò)對(duì)紫杉醇高產(chǎn)細(xì)胞優(yōu)株篩選和條件優(yōu)化后,可比原植物提高幾十倍)、產(chǎn)量大,成本低;2、細(xì)胞培養(yǎng)得到的產(chǎn)物分布簡(jiǎn)單,雜質(zhì)含量少,便于后續(xù)分離;3、用于提取紫杉醇的原料來(lái)源穩(wěn)定可控,可在人為控制條件下按市場(chǎng)需求在反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行無(wú)限、連續(xù)、均勻地大規(guī)模生產(chǎn);4、沒(méi)有化肥、農(nóng)藥或重金屬帶來(lái)的污染,也沒(méi)有栽培植物所受到的病蟲(chóng)害和細(xì)菌的侵害,是真正無(wú)菌、無(wú)毒的綠色產(chǎn)品;5、不需大量砍伐、采挖植物,保護(hù)土地資源,保護(hù)了生態(tài)平衡;6、除提供紫杉醇外,還可生產(chǎn)各種紫杉烷類(lèi)前體及其他有抗癌活性的新化合物。中國(guó)、美國(guó)、加拿大、韓國(guó)、日本等國(guó)對(duì)應(yīng)用紅豆杉植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紫杉醇進(jìn)行了大量研究,但是科學(xué)家的研究熱點(diǎn)主要集中在紫杉醇高產(chǎn)上面,至今沒(méi)有提出一套紅豆杉細(xì)胞種子長(zhǎng)期穩(wěn)定繼代培養(yǎng)的技術(shù)方案,因種子質(zhì)量和生長(zhǎng)狀態(tài)差異太大,生長(zhǎng)緩慢,生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)不斷產(chǎn)生紅色或褐色類(lèi)物質(zhì),種子繼代培養(yǎng)時(shí)經(jīng)常出現(xiàn)過(guò)敏變紅或衰老死亡變褐而失敗的技術(shù)難題,導(dǎo)致植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇時(shí)批次之間的紫杉醇含量穩(wěn)定性差,是紅豆杉植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)紫杉醇面臨的共性技術(shù)難題,所以盡管從1992年開(kāi)始進(jìn)行紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)紫杉醇的技術(shù)攻關(guān),至今很少研究團(tuán)隊(duì)能進(jìn)入中試和產(chǎn)業(yè)化階段,沒(méi)有辦法培養(yǎng)質(zhì)量和生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定的紅豆杉細(xì)胞種子是細(xì)胞培養(yǎng)失敗的主要原因之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種經(jīng)濟(jì)可行、工藝簡(jiǎn)單可控、成本低并能夠穩(wěn)定培養(yǎng)紅豆杉植物細(xì)胞種子的方法,得到質(zhì)量和生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定的種子。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的該紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,依次包括下述步驟(I)對(duì)繼代培養(yǎng)的種子進(jìn)行取樣,檢測(cè)種子終生物量(以干重計(jì),后面相同)、培養(yǎng)液終pH、培養(yǎng)液終電導(dǎo)率、培養(yǎng)液終糖度;(2)根據(jù)種子終生物量的大小,通過(guò)倒去培養(yǎng)液或加入水,將種子終生物量調(diào)整到5 10g/L ;(3)根據(jù)培養(yǎng)液終糖度大小,加入糖溶液將種子繼代培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)液初始糖度提高到 15 25g/L ;(4)根據(jù)培養(yǎng)液終電導(dǎo)率大小,加入B5培養(yǎng)基或濃縮B5培養(yǎng)基將種子繼代培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)液初始電導(dǎo)率提高到2. 5^3. 5mS/cm。(5)將初始生物量控制在2. 5^3. 5g/L,培養(yǎng)液初始pH控制在5. (Γ6. O,攪拌轉(zhuǎn)速控制在l(Tl30rpm,罐壓控制在O. 03、. 07Mpa,培養(yǎng)溫度控制在25° C,調(diào)節(jié)通氣量大小并通過(guò)溶氧電極控制培養(yǎng)液溶氧為20飛0%,在黑暗條件下進(jìn)行種子繼代培養(yǎng);(6)當(dāng)步驟(5)中的繼代培養(yǎng)的種子,同時(shí)滿(mǎn)足A、B、C三個(gè)條件時(shí)A、培養(yǎng)液終糖度大于8g/L ;B、培養(yǎng)液終電導(dǎo)率大于2. 0mS/cm;C、培養(yǎng)液終pH小于6.0 ;按步驟(I廣(5)啟動(dòng)下一次種子繼代培養(yǎng)。進(jìn)一步的,上述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,種子繼代培養(yǎng)時(shí)所述的種子初始生物量是3. Og/L,種子終生物量是7. 5g/L。進(jìn)一步的,上述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,種子繼代培養(yǎng)時(shí)所述的溶氧是20 60%ο進(jìn)一步的,上述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,種子繼代培養(yǎng)時(shí)所述的攪 拌轉(zhuǎn)速是30rpm,罐壓是O. 05Mpa。進(jìn)一步的,上述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,種子繼代培養(yǎng)時(shí)所述的培養(yǎng)液初始糖度是21g/L,種子培養(yǎng)液終糖度是大于8g/L。進(jìn)一步的,上述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,所述的糖是蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、可溶性淀粉的其中一種糖或兩種及兩種以上的糖組合。進(jìn)一步的,上述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,種子繼代培養(yǎng)時(shí)所述的培養(yǎng)液初始電導(dǎo)率是3. Oms/cm,種子培養(yǎng)液終電導(dǎo)率是大于2. Oms/cm。進(jìn)一步的,上述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,種子繼代培養(yǎng)時(shí)所述的培養(yǎng)液初始PH是5. (Γ6. O,培養(yǎng)液終pH是小于6. O。進(jìn)一步的,上述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,所述的種子繼代時(shí)更換B5培養(yǎng)基或濃縮B5培養(yǎng)基占總體積的比例是50飛0%。現(xiàn)有植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)基本處于三角瓶小試規(guī)模,工藝控制操作不穩(wěn)定,沒(méi)有對(duì)繼代培養(yǎng)時(shí)的種子初始生物量、培養(yǎng)液初始糖度、培養(yǎng)液初始電導(dǎo)率,培養(yǎng)液初始PH參數(shù)進(jìn)行明確定義及相對(duì)準(zhǔn)確的控制,也沒(méi)有對(duì)繼代培養(yǎng)結(jié)束后種子終生物量、培養(yǎng)液終糖度、培養(yǎng)液終電導(dǎo)率、培養(yǎng)液終PH參數(shù)進(jìn)行明確定義及進(jìn)行準(zhǔn)確的控制,同時(shí)也沒(méi)有控制種子繼代培養(yǎng)時(shí)間,導(dǎo)致每次種子繼代培養(yǎng)時(shí)條件變化太大,種子質(zhì)量和生長(zhǎng)狀態(tài)難于控制,不斷發(fā)生過(guò)敏變紅和衰老死亡現(xiàn)象而培養(yǎng)失?。槐景l(fā)明通過(guò)對(duì)繼代培養(yǎng)的種子質(zhì)量和種子繼代培養(yǎng)的條件進(jìn)行控制,確保每一次種子繼代培養(yǎng)后種子質(zhì)量和生長(zhǎng)狀態(tài)的穩(wěn)定?,F(xiàn)有技術(shù)為了預(yù)防種子繼代培養(yǎng)出現(xiàn)變紅變褐色的現(xiàn)象,添加了維生素C、活性碳等抗褐化劑和氨基酸類(lèi)營(yíng)養(yǎng),雖然可以減少變紅變褐現(xiàn)象的發(fā)生,但增加了操作難度并增加了污染機(jī)會(huì),本發(fā)明操作更簡(jiǎn)單,無(wú)須額外添加抗褐化劑和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),培養(yǎng)成功率高。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
,對(duì)本發(fā)明的權(quán)利要求作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明,但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制,任何人在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)所做的有限次的修改,仍在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)。
本發(fā)明方法的具體步驟如下I、對(duì)需要繼代培養(yǎng)的種子進(jìn)行取樣,檢測(cè)種子終生物量、培養(yǎng)液終pH、培養(yǎng)液終電導(dǎo)率、培養(yǎng)液終糖度;2、根據(jù)種子終生物量的大小,采用如表11所說(shuō)的種子繼代培養(yǎng)時(shí)初始生物量的控制方法,通過(guò)倒去培養(yǎng)液或加入水,將種子終生物量調(diào)整到5 10g/L ;3、采用如表9所說(shuō)的培養(yǎng)液初始糖度和培養(yǎng)液終糖度的調(diào)控方法,根據(jù)培養(yǎng)液終糖度大小,加入糖溶液將種子繼代培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)液初始糖度提高到15 25g/L ;4、采用如表8所說(shuō)的培養(yǎng)液初始電導(dǎo)率和培養(yǎng)液終電導(dǎo)率的調(diào)控方法,根據(jù)培養(yǎng)液終電導(dǎo)率大小,加入B5培養(yǎng)基或濃縮B5培養(yǎng)基將種子繼代培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)液初始電導(dǎo)率提高到 2. 5 3. 5ms/cm ;5、對(duì)種子進(jìn)行繼代培養(yǎng)將培養(yǎng)初始生物量控制在2. 5^3. 5g/L,培養(yǎng)液初始pH控制在5. (Γ6. O,攪拌轉(zhuǎn)速控制在l(Tl30rpm,罐壓調(diào)為O. 03、. 05Mpa, 25±2°C黑暗條件,靈活調(diào)節(jié)通氣量大小并通過(guò)溶氧電極控制溶氧為20飛0%,進(jìn)行種子繼代培養(yǎng);6、當(dāng)步驟(5)中的繼代培養(yǎng)的種子,當(dāng)同時(shí)滿(mǎn)足如下三個(gè)條件時(shí)A、培養(yǎng)液終糖度大于8g/L ;B、培養(yǎng)液終電導(dǎo)率大于2. Oms/cm ;C、培養(yǎng)液終pH小于6. O ;按步驟f 6方法啟動(dòng)下次種子繼代培養(yǎng)。實(shí)施例I紅豆杉植物細(xì)胞種子來(lái)源和種子繼代培養(yǎng)條件I、材料和培養(yǎng)條件供試材料為本公司篩選實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)篩選并繼代培養(yǎng)的中國(guó)紅豆杉細(xì)胞株,以B5為基本培養(yǎng)基,添加 lmg/L NAA、0.2mg/L 6 BA、30g/L 蔗糖、100mg/L Vc 和 292. 8mg/L L 谷氨酰胺作為繼代培養(yǎng)基,繼代時(shí)采用IOOOml的三角瓶?jī)?nèi)裝400ml培養(yǎng)體積,按2:3比例接入紅豆杉植物細(xì)胞種子和B5培養(yǎng)基,然后將三角瓶置于23 27°C恒溫室內(nèi)的搖床上,以120rpm搖床轉(zhuǎn)速進(jìn)行振蕩培養(yǎng),細(xì)胞繼代培養(yǎng)擴(kuò)14天后作為種子做正交優(yōu)化試驗(yàn)。2、細(xì)胞培養(yǎng)物樣品的檢測(cè)方法①細(xì)胞鮮重的測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)物用120目尼龍篩網(wǎng)濾過(guò),細(xì)胞用水沖洗三次后,再用干紗布吸干細(xì)胞表面水分,在電子天平上稱(chēng)其重量,用g/L表示。②細(xì)胞干重的測(cè)定,鮮細(xì)胞置于恒溫烘箱中,60°C烘干至恒重,用電子天平稱(chēng)其重量,用g/L表示。③糖度測(cè)定用糖度儀(北京萬(wàn)成北增精密儀器有限公司)測(cè)定,用g/L表示。④pH測(cè)定用pHS 25型pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)測(cè)定。⑤電導(dǎo)率測(cè)定用DDSllA型電導(dǎo)率儀(上海雷磁儀器有限公司)測(cè)定,用ms/cm表
/Jn ο
⑥溶氧測(cè)定采用梅特勒溶氧電極在線(xiàn)檢測(cè),用%表示。3、生長(zhǎng)條件優(yōu)化方法60ml B5培養(yǎng)基裝入250ml三角瓶?jī)?nèi),培養(yǎng)基根據(jù)選取的正交表配方配制,接入40ml中國(guó)紅豆杉種子培養(yǎng)基中,在23 27°C、120rpm搖床轉(zhuǎn)速及黑暗條件下進(jìn)行生長(zhǎng)試驗(yàn)。實(shí)施例2初始生物量、種子培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)液初始糖度對(duì)中國(guó)紅豆杉細(xì)胞生長(zhǎng)的影響60ml培養(yǎng)基裝入250ml三角瓶?jī)?nèi),以B5培養(yǎng)基為基礎(chǔ)配方,添加lmg/L NAA和 0.2mg/L的6 BA,根據(jù)表I和表2的4因素3水平L9 (34)正交試驗(yàn)表配制成25g/L、16g/L、10g/L蔗糖濃度的不同培養(yǎng)基配方,接入40ml的細(xì)胞種子后使培養(yǎng)物中的初始生物量分別為I. 87 g/L、2. 81 g/L和3. 74 g/L,然后將搖瓶均勻置于25±2°C的恒溫室內(nèi)的搖床上,以120 rpm搖床轉(zhuǎn)速進(jìn)行振蕩培養(yǎng),細(xì)胞種子繼代培養(yǎng)到第7、9、11天取樣,檢測(cè)培養(yǎng)物中的細(xì)胞終生物量和培養(yǎng)液終pH、培養(yǎng)液終電導(dǎo)率、培養(yǎng)液終糖度。從表I和表2正交試驗(yàn)可得到如下結(jié)論I、種子初始生物量在2. 81 g/L時(shí),每升培養(yǎng)物中每克細(xì)胞每天鮮重和干重的增加速度都最快,而種子初始生物量在I. 87 g/L和3. 74 g/L時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯要慢,特別是在I. 87 g/L較低初始生物量時(shí)生長(zhǎng)最慢,證明細(xì)胞生長(zhǎng)有一最低密度效應(yīng),和現(xiàn)有文獻(xiàn)研究結(jié)果相同,因此將合適的細(xì)胞種子初始生物量定在2. 5^3. 5g/L之間。2、種子培養(yǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響在細(xì)胞生長(zhǎng)的前期7、天,有利于鮮重的增力口,而后期擴(kuò)11天有利于干重的增加,綜合鮮干重?cái)?shù)據(jù),在第擴(kuò)11天進(jìn)行細(xì)胞種子繼代培養(yǎng)比較合適。3、培養(yǎng)液初始糖度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響培養(yǎng)液初始糖度10g/L時(shí),細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯要快,培養(yǎng)液初始糖度為16g/L和25g/L時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)要慢,過(guò)高的培養(yǎng)液初始糖度減慢了細(xì)胞的生長(zhǎng)速度,結(jié)合2的結(jié)論種子在第911天進(jìn)行繼代培養(yǎng)比較合適,按糖度平均消耗為O. 26g/L/d/g為依據(jù),為了確保種子生長(zhǎng)狀態(tài)和質(zhì)量能維持穩(wěn)定,將合適的培養(yǎng)液初始糖度定在15 25g/L。表I L9 (34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表
權(quán)利要求
1.一種紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,其特征在于,依次包括下述步驟 (1)對(duì)繼代的種子進(jìn)行取樣,檢測(cè)種子終生物量、培養(yǎng)液終pH、培養(yǎng)液終電導(dǎo)率、培養(yǎng)液終糖度; (2)根據(jù)種子終生物量的大小,通過(guò)倒去培養(yǎng)液或加入水,將種子終生物量調(diào)整到5 10g/L ; (3)根據(jù)種子培養(yǎng)液終糖度大小,加入糖溶液將種子繼代培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)液初始糖度提高到 15 25 g/L ; (4)根據(jù)種子培養(yǎng)液終電導(dǎo)率大小,加入B5培養(yǎng)基或濃縮B5培養(yǎng)基將種子繼代培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)液初始電導(dǎo)率提高到2. 5^3. 5 ms/cm ; (5)將培養(yǎng)初始生物量控制在2.5^3. 5g/L,種子繼代培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)液初始pH控制在5.0 6. O,攪拌轉(zhuǎn)速控制在l(Tl30rpm,罐壓控制在0. 03 0. 07Mpa,25±2°C黑暗條件,調(diào)節(jié)通氣量大小并通過(guò)溶氧電極控制溶氧為20飛0%,進(jìn)行種子繼代培養(yǎng); (6)當(dāng)步驟(5)中的繼代培養(yǎng)的種子,同時(shí)滿(mǎn)足A、B、C三個(gè)條件時(shí)A、培養(yǎng)液終糖度大于8g/L ;B、培養(yǎng)液終電導(dǎo)率大于2. Oms/cm ;C、培養(yǎng)液終pH小于6. 0 ;按步驟(1) (5)啟動(dòng)下一次種子繼代培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,其特征在于,種子繼代培養(yǎng)時(shí)所述的種子初始生物量控制在3. Og/L,種子終生物量控制在7. 5g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,其特征在于,種子繼代培養(yǎng)時(shí)所述的溶氧控制在30 50%。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,其特征在于,種子繼代培養(yǎng)時(shí)所述的攪拌轉(zhuǎn)速控制在30rpm,罐壓控制在0. 05Mpa,培養(yǎng)溫度控制在25° C,在黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,其特征在于,種子繼代培養(yǎng)時(shí)所述的培養(yǎng)液初始糖度是21g/L,種子培養(yǎng)液終糖度大于8g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,其特征在于,所述的糖是蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、可溶性淀粉的其中一種糖或兩種及兩種以上的糖組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,其特征在于,種子繼代培養(yǎng)時(shí)所述的培養(yǎng)液初始電導(dǎo)率是3. Oms/cm,種子培養(yǎng)液終電導(dǎo)率大于2. Oms/cm。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,其特征在于,種子繼代培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)液初始PH范圍是5. (T6. 0,培養(yǎng)液終pH小于6. O。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,所述的種子繼代培養(yǎng)時(shí)更換B5培養(yǎng)基或濃縮B5培養(yǎng)基體積占總體積的比例是5(T60%。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,旨在提供一種經(jīng)濟(jì)可行、工藝簡(jiǎn)單可控、成本低并能夠穩(wěn)定培養(yǎng)紅豆杉植物細(xì)胞種子的方法;該方法是1)對(duì)繼代種子取樣檢測(cè);2)種子終生物量調(diào)整到5~10 g/L;3)培養(yǎng)液初始糖度提高到15~25 g/L;4)培養(yǎng)液初始電導(dǎo)率提高到2.5~3.5ms/cm;5)培養(yǎng)初始生物量控制在2.5~3.5g/L,初始pH控制在5.0~6.0,攪拌進(jìn)行種子繼代培養(yǎng);6)當(dāng)步驟5)中的繼代培養(yǎng)的種子滿(mǎn)足A、培養(yǎng)液終糖度大于8g/L或B、培養(yǎng)液終電導(dǎo)率大于2.0ms/cm或C、培養(yǎng)液終pH小于6.0;按步驟1)~5)啟動(dòng)下一次種子繼代培養(yǎng);屬于種子培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N5/04GK102965329SQ20121050620
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月30日
發(fā)明者李干雄, 侯云屏, 古志淵, 駱雪蘭, 曾騰鋒, 吳永艷, 肖華 申請(qǐng)人:廣東科倫藥業(yè)有限公司
網(wǎng)友詢(xún)問(wèn)留言 已有0條留言
  • 還沒(méi)有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1
波多野结衣高清无吗| 欧美+日韩+精品| 狠狠狠狠99中文字幕| 精品人妻视频免费看| 三级经典国产精品| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲av免费高清在线观看| 天天躁日日操中文字幕| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲第一电影网av| 国产成人精品婷婷| 国产伦精品一区二区三区视频9| 蜜臀久久99精品久久宅男| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲在线观看片| 能在线免费观看的黄片| 亚洲国产精品成人综合色| www.av在线官网国产| 久久人妻av系列| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 日韩 亚洲 欧美在线| 春色校园在线视频观看| 97在线视频观看| 久久99蜜桃精品久久| 黄色日韩在线| 国产在视频线在精品| 国产精华一区二区三区| 青春草亚洲视频在线观看| 97超视频在线观看视频| 精品人妻偷拍中文字幕| 日本黄色视频三级网站网址| 青春草视频在线免费观看| 听说在线观看完整版免费高清| 免费电影在线观看免费观看| 美女大奶头视频| 身体一侧抽搐| 国产乱人偷精品视频| 热99re8久久精品国产| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 丰满人妻一区二区三区视频av| 久久热精品热| 亚洲色图av天堂| 久久久精品大字幕| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲国产精品成人久久小说 | 亚洲一区高清亚洲精品| 给我免费播放毛片高清在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 99热精品在线国产| 久久久久九九精品影院| 国产av不卡久久| 久久久午夜欧美精品| 亚洲,欧美,日韩| 最近最新中文字幕大全电影3| 韩国av在线不卡| 日本爱情动作片www.在线观看| 一个人免费在线观看电影| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产69精品久久久久777片| 久久九九热精品免费| 日本免费a在线| 亚洲18禁久久av| 哪个播放器可以免费观看大片| 日本-黄色视频高清免费观看| 特级一级黄色大片| 亚洲欧美成人精品一区二区| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 成熟少妇高潮喷水视频| 99热这里只有精品一区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲四区av| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产淫片久久久久久久久| 欧美色视频一区免费| 天美传媒精品一区二区| 我的女老师完整版在线观看| 深夜精品福利| 波多野结衣高清作品| av免费在线看不卡| 人体艺术视频欧美日本| 久久亚洲国产成人精品v| 免费av观看视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 在线观看午夜福利视频| 综合色丁香网| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 成年女人永久免费观看视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲第一区二区三区不卡| 全区人妻精品视频| 看十八女毛片水多多多| 日韩大尺度精品在线看网址| 丝袜喷水一区| 天堂影院成人在线观看| 国产美女午夜福利| 少妇人妻精品综合一区二区 | 一区二区三区免费毛片| 国产亚洲91精品色在线| 人人妻人人澡欧美一区二区| 欧美日韩在线观看h| 日韩人妻高清精品专区| 国产探花极品一区二区| 国产亚洲精品av在线| 欧美潮喷喷水| 欧美高清性xxxxhd video| 免费看日本二区| 国产单亲对白刺激| 又爽又黄无遮挡网站| 久久精品久久久久久久性| 99热全是精品| 韩国av在线不卡| 一级av片app| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产乱人偷精品视频| 男人狂女人下面高潮的视频| 亚洲人与动物交配视频| 插阴视频在线观看视频| 欧美激情在线99| 18禁在线播放成人免费| 精品午夜福利在线看| 色综合亚洲欧美另类图片| 在线观看一区二区三区| 免费观看a级毛片全部| 日本五十路高清| 欧美+亚洲+日韩+国产| 寂寞人妻少妇视频99o| 欧美日韩综合久久久久久| 国产精品国产高清国产av| 成人永久免费在线观看视频| 国产在线男女| 一级毛片aaaaaa免费看小| 真实男女啪啪啪动态图| 又爽又黄a免费视频| 直男gayav资源| 免费黄网站久久成人精品| 久久九九热精品免费| 搡老妇女老女人老熟妇| 日日摸夜夜添夜夜爱| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国产成人精品婷婷| av免费在线看不卡| 丰满乱子伦码专区| 欧美日韩乱码在线| 国产高清有码在线观看视频| 美女 人体艺术 gogo| 成人亚洲精品av一区二区| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 久久久久性生活片| 婷婷色av中文字幕| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲在线观看片| 久久人妻av系列| 国产成人a区在线观看| 免费av观看视频| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 精品久久久久久久久久免费视频| 午夜视频国产福利| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲三级黄色毛片| 免费av观看视频| 国内精品久久久久精免费| 搞女人的毛片| 国产一级毛片七仙女欲春2| 午夜福利在线在线| 26uuu在线亚洲综合色| 一区福利在线观看| 国产乱人视频| 99久久精品热视频| a级毛片免费高清观看在线播放| 免费大片18禁| 免费观看的影片在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产成人午夜福利电影在线观看| 成人美女网站在线观看视频| 一级av片app| 亚洲三级黄色毛片| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 在线观看66精品国产| 国产在线男女| 成人综合一区亚洲| 99久久精品一区二区三区| 男女那种视频在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 看黄色毛片网站| 日本熟妇午夜| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲精品自拍成人| 美女大奶头视频| 亚洲av免费在线观看| 激情 狠狠 欧美| 最近手机中文字幕大全| 亚洲国产色片| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 最近的中文字幕免费完整| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲欧美精品综合久久99| 日本在线视频免费播放| 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲欧美日韩高清在线视频| a级一级毛片免费在线观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产成人freesex在线| 欧美最新免费一区二区三区| 国产午夜福利久久久久久| 又粗又爽又猛毛片免费看| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产高清激情床上av| 波多野结衣高清作品| 听说在线观看完整版免费高清| 国内精品宾馆在线| 日本黄色片子视频| 亚洲在线观看片| 人人妻人人看人人澡| 黄色配什么色好看| 女同久久另类99精品国产91| av.在线天堂| 免费看a级黄色片| 亚洲av免费在线观看| 成人特级av手机在线观看| 国产成人a∨麻豆精品| 免费看av在线观看网站| 波多野结衣巨乳人妻| 永久网站在线| 黄片wwwwww| 亚洲av.av天堂| 国产黄a三级三级三级人| av视频在线观看入口| 51国产日韩欧美| 国产色爽女视频免费观看| 欧美日本视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 人人妻人人澡欧美一区二区| 丰满的人妻完整版| 国产黄a三级三级三级人| 一个人观看的视频www高清免费观看| 99在线视频只有这里精品首页| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲在久久综合| 午夜福利高清视频| 婷婷色av中文字幕| 少妇熟女欧美另类| 亚洲欧美精品综合久久99| 久久久欧美国产精品| 亚洲第一区二区三区不卡| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久久久久大精品| av女优亚洲男人天堂| 直男gayav资源| 国产成人一区二区在线| 久久欧美精品欧美久久欧美| 三级经典国产精品| 亚洲乱码一区二区免费版| www.色视频.com| 青青草视频在线视频观看| 日韩高清综合在线| 中文字幕制服av| 岛国毛片在线播放| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲精品日韩av片在线观看| 有码 亚洲区| 一个人观看的视频www高清免费观看| 亚洲国产精品成人久久小说 | 国产精品国产高清国产av| 91久久精品电影网| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 国产一区二区亚洲精品在线观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产视频内射| 国产av麻豆久久久久久久| 国产免费一级a男人的天堂| 欧美bdsm另类| 色哟哟·www| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 精品人妻熟女av久视频| 国产精品永久免费网站| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 久久精品91蜜桃| 哪个播放器可以免费观看大片| 嫩草影院精品99| 在现免费观看毛片| 又爽又黄a免费视频| 婷婷亚洲欧美| 美女脱内裤让男人舔精品视频 | 99久久中文字幕三级久久日本| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产亚洲精品av在线| 91久久精品电影网| 欧美精品国产亚洲| 午夜老司机福利剧场| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲在久久综合| 亚洲精品日韩av片在线观看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 免费观看的影片在线观看| 老司机福利观看| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产成人精品久久久久久| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产真实乱freesex| 午夜视频国产福利| 国产三级在线视频| 欧美一区二区亚洲| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产白丝娇喘喷水9色精品| av在线观看视频网站免费| 男女边吃奶边做爰视频| 日韩av在线大香蕉| 桃色一区二区三区在线观看| 久久久久久久久久成人| 婷婷色综合大香蕉| 国模一区二区三区四区视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 久久久久国产网址| 国产一区二区在线观看日韩| 69av精品久久久久久| 晚上一个人看的免费电影| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 日韩中字成人| 亚洲精品久久国产高清桃花| 久久久a久久爽久久v久久| 22中文网久久字幕| 国产精品女同一区二区软件| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 黄色欧美视频在线观看| 国产午夜精品论理片| 插逼视频在线观看| 亚洲国产欧美在线一区| 最近2019中文字幕mv第一页| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 日本五十路高清| 又粗又硬又长又爽又黄的视频 | 嫩草影院入口| 精品日产1卡2卡| 日本熟妇午夜| 久久国产乱子免费精品| 欧美性感艳星| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲欧美成人精品一区二区| 欧美又色又爽又黄视频| 国产精品爽爽va在线观看网站| 51国产日韩欧美| 国产午夜精品一二区理论片| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产精品人妻久久久影院| 老司机影院成人| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲精品成人久久久久久| 免费观看人在逋| 欧美丝袜亚洲另类| 天堂影院成人在线观看| 欧美最新免费一区二区三区| 婷婷六月久久综合丁香| av卡一久久| 免费黄网站久久成人精品| 看十八女毛片水多多多| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 午夜激情福利司机影院| 国产免费男女视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 男女边吃奶边做爰视频| 麻豆国产97在线/欧美| 欧美丝袜亚洲另类| 九草在线视频观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频 | 国产伦精品一区二区三区视频9| 我要搜黄色片| 久久久a久久爽久久v久久| 在线观看av片永久免费下载| 又粗又硬又长又爽又黄的视频 | 秋霞在线观看毛片| 日韩在线高清观看一区二区三区| 哪个播放器可以免费观看大片| 精品久久久久久久末码| 亚洲三级黄色毛片| av免费观看日本| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产成人午夜福利电影在线观看| 日本五十路高清| 最近中文字幕高清免费大全6| 午夜福利成人在线免费观看| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 欧美在线一区亚洲| av在线老鸭窝| 日韩精品青青久久久久久| 女人十人毛片免费观看3o分钟| av黄色大香蕉| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲精品国产成人久久av| 成人二区视频| 久久亚洲国产成人精品v| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 欧美色视频一区免费| 午夜视频国产福利| www日本黄色视频网| 最近手机中文字幕大全| 国产成人午夜福利电影在线观看| 哪个播放器可以免费观看大片| 性色avwww在线观看| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 一区二区三区四区激情视频 | 一区二区三区高清视频在线| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲不卡免费看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲第一电影网av| 免费无遮挡裸体视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 免费观看的影片在线观看| 99久久精品一区二区三区| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲精品久久国产高清桃花| 久久这里有精品视频免费| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 国产精品,欧美在线| av女优亚洲男人天堂| 日韩在线高清观看一区二区三区| 哪个播放器可以免费观看大片| 好男人视频免费观看在线| 成人综合一区亚洲| 2021天堂中文幕一二区在线观| 一级毛片久久久久久久久女| 久久久久久久久久久丰满| 一区二区三区高清视频在线| 综合色丁香网| 观看免费一级毛片| 国产亚洲5aaaaa淫片| 久久6这里有精品| 99热这里只有是精品50| 日本五十路高清| 精品久久久久久久末码| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 少妇人妻一区二区三区视频| 一本久久精品| 99久久精品一区二区三区| 精品人妻视频免费看| 成人无遮挡网站| 99久久精品一区二区三区| 深夜a级毛片| 99riav亚洲国产免费| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 精华霜和精华液先用哪个| 最近手机中文字幕大全| 中文字幕av在线有码专区| 看非洲黑人一级黄片| 久久久久九九精品影院| 日韩成人伦理影院| 丰满的人妻完整版| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 在线a可以看的网站| 午夜福利高清视频| 一区二区三区四区激情视频 | av国产免费在线观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产免费男女视频| 精品久久国产蜜桃| 一本精品99久久精品77| 精品久久久久久久久亚洲| 欧美色欧美亚洲另类二区| 寂寞人妻少妇视频99o| 日日摸夜夜添夜夜爱| 午夜视频国产福利| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲人与动物交配视频| 波野结衣二区三区在线| 舔av片在线| 亚洲天堂国产精品一区在线| 村上凉子中文字幕在线| 欧美色视频一区免费| 亚洲性久久影院| 26uuu在线亚洲综合色| 一级黄片播放器| 亚洲第一区二区三区不卡| 日日摸夜夜添夜夜爱| 免费av观看视频| 精品午夜福利在线看| 久久精品影院6| 成人鲁丝片一二三区免费| 在线观看免费视频日本深夜| 国产精品女同一区二区软件| 精品久久久噜噜| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲av不卡在线观看| 只有这里有精品99| 久久国内精品自在自线图片| 伊人久久精品亚洲午夜| 欧美一区二区国产精品久久精品| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 精品人妻视频免费看| av女优亚洲男人天堂| 婷婷精品国产亚洲av| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久久久久国产a免费观看| 国产午夜精品一二区理论片| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 久久久久久国产a免费观看| 真实男女啪啪啪动态图| www.色视频.com| 国产91av在线免费观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 久久九九热精品免费| 看十八女毛片水多多多| 中国国产av一级| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| avwww免费| 成年免费大片在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 亚洲精品粉嫩美女一区| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产三级在线视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产极品精品免费视频能看的| 久久午夜福利片| 国产精品国产高清国产av| 亚洲av一区综合| 久久久久久久久中文| 亚洲av成人av| 亚洲国产精品久久男人天堂| 黄片无遮挡物在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 欧美区成人在线视频| 99国产精品一区二区蜜桃av| 91精品一卡2卡3卡4卡| 一边亲一边摸免费视频| 午夜久久久久精精品| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 国产片特级美女逼逼视频| 一级黄色大片毛片| 两个人视频免费观看高清| 亚洲成av人片在线播放无| 99在线人妻在线中文字幕| 乱码一卡2卡4卡精品| 午夜a级毛片| 日本黄色片子视频| 又粗又爽又猛毛片免费看| 人妻少妇偷人精品九色| 天堂中文最新版在线下载 | 一区福利在线观看| 干丝袜人妻中文字幕| 日本与韩国留学比较| 久久久久性生活片| 亚洲av中文av极速乱| 国产美女午夜福利| 亚洲精品自拍成人| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产精品久久久久久久电影| 夜夜爽天天搞| 伦理电影大哥的女人| 69av精品久久久久久| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 欧美激情久久久久久爽电影| 日日干狠狠操夜夜爽| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 嫩草影院新地址| 内射极品少妇av片p| 欧美一区二区亚洲| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 中文字幕熟女人妻在线| 97超碰精品成人国产| 青春草亚洲视频在线观看| 91精品一卡2卡3卡4卡| 黄色视频,在线免费观看| 日韩成人伦理影院| 乱人视频在线观看| 在线播放无遮挡| 麻豆国产97在线/欧美| 国产探花在线观看一区二区| 精品午夜福利在线看| 国内精品久久久久精免费| 精品午夜福利在线看| 精品国内亚洲2022精品成人| 97在线视频观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 中国国产av一级| 成人永久免费在线观看视频| 超碰av人人做人人爽久久| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 日韩成人av中文字幕在线观看| 亚洲性久久影院| 国产黄色小视频在线观看| 看免费成人av毛片| 欧美成人a在线观看| 一级黄色大片毛片| 亚洲最大成人手机在线| 亚洲欧美精品自产自拍| 在现免费观看毛片| 午夜福利高清视频| 99热全是精品| 亚洲国产精品sss在线观看| 如何舔出高潮| 热99在线观看视频| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产成年人精品一区二区| 日韩大尺度精品在线看网址| 色哟哟·www| 99久久精品一区二区三区| 国产视频首页在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 欧美性感艳星|