專(zhuān)利名稱(chēng):一種紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明專(zhuān)利涉及一種細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,特別是指一種紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,屬于種子培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù):
紫杉醇(Taxol)是最早從紅豆杉植物樹(shù)皮中分離提取出來(lái)的一種二萜類(lèi)生物堿,作為治療晚期卵巢癌、乳腺癌的首選抗癌藥,從1992年上市后,因資源缺乏,價(jià)格昂貴。目前紫杉醇原料藥來(lái)源主要有三種途徑一種是從紅豆杉種植枝葉中提取后得到紫杉醇,但因紅豆杉生長(zhǎng)緩慢,生產(chǎn)周期長(zhǎng)達(dá)3飛年,枝葉中紫杉醇含量低,導(dǎo)致紫杉醇的提取成本高。二是通過(guò)Baccatin III和1(TDAB等前體半合成紫杉醇,但所需要的半合成前 體也來(lái)源于種植枝葉,同樣受到提取原料來(lái)源的限制,仍然不能滿(mǎn)足臨床和試驗(yàn)對(duì)紫杉醇的大量需求。三是各國(guó)科學(xué)家采用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來(lái)解決紫杉醇藥源緊缺的問(wèn)題,通過(guò)紅豆杉植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紫杉醇被認(rèn)為是目前替代種植和半合成紫杉醇原料藥來(lái)源的最重要的途經(jīng)之一,其特點(diǎn)是1、細(xì)胞生產(chǎn)培養(yǎng)周期短、紫杉醇含量高(通過(guò)對(duì)紫杉醇高產(chǎn)細(xì)胞優(yōu)株篩選和條件優(yōu)化后,可比原植物提高幾十倍)、產(chǎn)量大,成本低;2、細(xì)胞培養(yǎng)得到的產(chǎn)物分布簡(jiǎn)單,雜質(zhì)含量少,便于后續(xù)分離;3、用于提取紫杉醇的原料來(lái)源穩(wěn)定可控,可在人為控制條件下按市場(chǎng)需求在反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行無(wú)限、連續(xù)、均勻地大規(guī)模生產(chǎn);4、沒(méi)有化肥、農(nóng)藥或重金屬帶來(lái)的污染,也沒(méi)有栽培植物所受到的病蟲(chóng)害和細(xì)菌的侵害,是真正無(wú)菌、無(wú)毒的綠色產(chǎn)品;5、不需大量砍伐、采挖植物,保護(hù)土地資源,保護(hù)了生態(tài)平衡;6、除提供紫杉醇外,還可生產(chǎn)各種紫杉烷類(lèi)前體及其他有抗癌活性的新化合物。中國(guó)、美國(guó)、加拿大、韓國(guó)、日本等國(guó)對(duì)應(yīng)用紅豆杉植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紫杉醇進(jìn)行了大量研究,但是科學(xué)家的研究熱點(diǎn)主要集中在紫杉醇高產(chǎn)上面,至今沒(méi)有提出一套紅豆杉細(xì)胞種子長(zhǎng)期穩(wěn)定繼代培養(yǎng)的技術(shù)方案,因種子質(zhì)量和生長(zhǎng)狀態(tài)差異太大,生長(zhǎng)緩慢,生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)不斷產(chǎn)生紅色或褐色類(lèi)物質(zhì),種子繼代培養(yǎng)時(shí)經(jīng)常出現(xiàn)過(guò)敏變紅或衰老死亡變褐而失敗的技術(shù)難題,導(dǎo)致植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇時(shí)批次之間的紫杉醇含量穩(wěn)定性差,是紅豆杉植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)紫杉醇面臨的共性技術(shù)難題,所以盡管從1992年開(kāi)始進(jìn)行紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)紫杉醇的技術(shù)攻關(guān),至今很少研究團(tuán)隊(duì)能進(jìn)入中試和產(chǎn)業(yè)化階段,沒(méi)有辦法培養(yǎng)質(zhì)量和生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定的紅豆杉細(xì)胞種子是細(xì)胞培養(yǎng)失敗的主要原因之一。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種經(jīng)濟(jì)可行、工藝簡(jiǎn)單可控、成本低并能夠穩(wěn)定培養(yǎng)紅豆杉植物細(xì)胞種子的方法,得到質(zhì)量和生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定的種子。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的該紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,依次包括下述步驟(I)對(duì)繼代培養(yǎng)的種子進(jìn)行取樣,檢測(cè)種子終生物量(以干重計(jì),后面相同)、培養(yǎng)液終pH、培養(yǎng)液終電導(dǎo)率、培養(yǎng)液終糖度;(2)根據(jù)種子終生物量的大小,通過(guò)倒去培養(yǎng)液或加入水,將種子終生物量調(diào)整到5 10g/L ;(3)根據(jù)培養(yǎng)液終糖度大小,加入糖溶液將種子繼代培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)液初始糖度提高到 15 25g/L ;(4)根據(jù)培養(yǎng)液終電導(dǎo)率大小,加入B5培養(yǎng)基或濃縮B5培養(yǎng)基將種子繼代培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)液初始電導(dǎo)率提高到2. 5^3. 5mS/cm。(5)將初始生物量控制在2. 5^3. 5g/L,培養(yǎng)液初始pH控制在5. (Γ6. O,攪拌轉(zhuǎn)速控制在l(Tl30rpm,罐壓控制在O. 03、. 07Mpa,培養(yǎng)溫度控制在25° C,調(diào)節(jié)通氣量大小并通過(guò)溶氧電極控制培養(yǎng)液溶氧為20飛0%,在黑暗條件下進(jìn)行種子繼代培養(yǎng);(6)當(dāng)步驟(5)中的繼代培養(yǎng)的種子,同時(shí)滿(mǎn)足A、B、C三個(gè)條件時(shí)A、培養(yǎng)液終糖度大于8g/L ;B、培養(yǎng)液終電導(dǎo)率大于2. 0mS/cm;C、培養(yǎng)液終pH小于6.0 ;按步驟(I廣(5)啟動(dòng)下一次種子繼代培養(yǎng)。進(jìn)一步的,上述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,種子繼代培養(yǎng)時(shí)所述的種子初始生物量是3. Og/L,種子終生物量是7. 5g/L。進(jìn)一步的,上述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,種子繼代培養(yǎng)時(shí)所述的溶氧是20 60%ο進(jìn)一步的,上述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,種子繼代培養(yǎng)時(shí)所述的攪 拌轉(zhuǎn)速是30rpm,罐壓是O. 05Mpa。進(jìn)一步的,上述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,種子繼代培養(yǎng)時(shí)所述的培養(yǎng)液初始糖度是21g/L,種子培養(yǎng)液終糖度是大于8g/L。進(jìn)一步的,上述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,所述的糖是蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、可溶性淀粉的其中一種糖或兩種及兩種以上的糖組合。進(jìn)一步的,上述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,種子繼代培養(yǎng)時(shí)所述的培養(yǎng)液初始電導(dǎo)率是3. Oms/cm,種子培養(yǎng)液終電導(dǎo)率是大于2. Oms/cm。進(jìn)一步的,上述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,種子繼代培養(yǎng)時(shí)所述的培養(yǎng)液初始PH是5. (Γ6. O,培養(yǎng)液終pH是小于6. O。進(jìn)一步的,上述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,所述的種子繼代時(shí)更換B5培養(yǎng)基或濃縮B5培養(yǎng)基占總體積的比例是50飛0%。現(xiàn)有植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)基本處于三角瓶小試規(guī)模,工藝控制操作不穩(wěn)定,沒(méi)有對(duì)繼代培養(yǎng)時(shí)的種子初始生物量、培養(yǎng)液初始糖度、培養(yǎng)液初始電導(dǎo)率,培養(yǎng)液初始PH參數(shù)進(jìn)行明確定義及相對(duì)準(zhǔn)確的控制,也沒(méi)有對(duì)繼代培養(yǎng)結(jié)束后種子終生物量、培養(yǎng)液終糖度、培養(yǎng)液終電導(dǎo)率、培養(yǎng)液終PH參數(shù)進(jìn)行明確定義及進(jìn)行準(zhǔn)確的控制,同時(shí)也沒(méi)有控制種子繼代培養(yǎng)時(shí)間,導(dǎo)致每次種子繼代培養(yǎng)時(shí)條件變化太大,種子質(zhì)量和生長(zhǎng)狀態(tài)難于控制,不斷發(fā)生過(guò)敏變紅和衰老死亡現(xiàn)象而培養(yǎng)失?。槐景l(fā)明通過(guò)對(duì)繼代培養(yǎng)的種子質(zhì)量和種子繼代培養(yǎng)的條件進(jìn)行控制,確保每一次種子繼代培養(yǎng)后種子質(zhì)量和生長(zhǎng)狀態(tài)的穩(wěn)定?,F(xiàn)有技術(shù)為了預(yù)防種子繼代培養(yǎng)出現(xiàn)變紅變褐色的現(xiàn)象,添加了維生素C、活性碳等抗褐化劑和氨基酸類(lèi)營(yíng)養(yǎng),雖然可以減少變紅變褐現(xiàn)象的發(fā)生,但增加了操作難度并增加了污染機(jī)會(huì),本發(fā)明操作更簡(jiǎn)單,無(wú)須額外添加抗褐化劑和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),培養(yǎng)成功率高。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
,對(duì)本發(fā)明的權(quán)利要求作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明,但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制,任何人在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)所做的有限次的修改,仍在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)。
本發(fā)明方法的具體步驟如下I、對(duì)需要繼代培養(yǎng)的種子進(jìn)行取樣,檢測(cè)種子終生物量、培養(yǎng)液終pH、培養(yǎng)液終電導(dǎo)率、培養(yǎng)液終糖度;2、根據(jù)種子終生物量的大小,采用如表11所說(shuō)的種子繼代培養(yǎng)時(shí)初始生物量的控制方法,通過(guò)倒去培養(yǎng)液或加入水,將種子終生物量調(diào)整到5 10g/L ;3、采用如表9所說(shuō)的培養(yǎng)液初始糖度和培養(yǎng)液終糖度的調(diào)控方法,根據(jù)培養(yǎng)液終糖度大小,加入糖溶液將種子繼代培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)液初始糖度提高到15 25g/L ;4、采用如表8所說(shuō)的培養(yǎng)液初始電導(dǎo)率和培養(yǎng)液終電導(dǎo)率的調(diào)控方法,根據(jù)培養(yǎng)液終電導(dǎo)率大小,加入B5培養(yǎng)基或濃縮B5培養(yǎng)基將種子繼代培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)液初始電導(dǎo)率提高到 2. 5 3. 5ms/cm ;5、對(duì)種子進(jìn)行繼代培養(yǎng)將培養(yǎng)初始生物量控制在2. 5^3. 5g/L,培養(yǎng)液初始pH控制在5. (Γ6. O,攪拌轉(zhuǎn)速控制在l(Tl30rpm,罐壓調(diào)為O. 03、. 05Mpa, 25±2°C黑暗條件,靈活調(diào)節(jié)通氣量大小并通過(guò)溶氧電極控制溶氧為20飛0%,進(jìn)行種子繼代培養(yǎng);6、當(dāng)步驟(5)中的繼代培養(yǎng)的種子,當(dāng)同時(shí)滿(mǎn)足如下三個(gè)條件時(shí)A、培養(yǎng)液終糖度大于8g/L ;B、培養(yǎng)液終電導(dǎo)率大于2. Oms/cm ;C、培養(yǎng)液終pH小于6. O ;按步驟f 6方法啟動(dòng)下次種子繼代培養(yǎng)。實(shí)施例I紅豆杉植物細(xì)胞種子來(lái)源和種子繼代培養(yǎng)條件I、材料和培養(yǎng)條件供試材料為本公司篩選實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)篩選并繼代培養(yǎng)的中國(guó)紅豆杉細(xì)胞株,以B5為基本培養(yǎng)基,添加 lmg/L NAA、0.2mg/L 6 BA、30g/L 蔗糖、100mg/L Vc 和 292. 8mg/L L 谷氨酰胺作為繼代培養(yǎng)基,繼代時(shí)采用IOOOml的三角瓶?jī)?nèi)裝400ml培養(yǎng)體積,按2:3比例接入紅豆杉植物細(xì)胞種子和B5培養(yǎng)基,然后將三角瓶置于23 27°C恒溫室內(nèi)的搖床上,以120rpm搖床轉(zhuǎn)速進(jìn)行振蕩培養(yǎng),細(xì)胞繼代培養(yǎng)擴(kuò)14天后作為種子做正交優(yōu)化試驗(yàn)。2、細(xì)胞培養(yǎng)物樣品的檢測(cè)方法①細(xì)胞鮮重的測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)物用120目尼龍篩網(wǎng)濾過(guò),細(xì)胞用水沖洗三次后,再用干紗布吸干細(xì)胞表面水分,在電子天平上稱(chēng)其重量,用g/L表示。②細(xì)胞干重的測(cè)定,鮮細(xì)胞置于恒溫烘箱中,60°C烘干至恒重,用電子天平稱(chēng)其重量,用g/L表示。③糖度測(cè)定用糖度儀(北京萬(wàn)成北增精密儀器有限公司)測(cè)定,用g/L表示。④pH測(cè)定用pHS 25型pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)測(cè)定。⑤電導(dǎo)率測(cè)定用DDSllA型電導(dǎo)率儀(上海雷磁儀器有限公司)測(cè)定,用ms/cm表
/Jn ο
⑥溶氧測(cè)定采用梅特勒溶氧電極在線(xiàn)檢測(cè),用%表示。3、生長(zhǎng)條件優(yōu)化方法60ml B5培養(yǎng)基裝入250ml三角瓶?jī)?nèi),培養(yǎng)基根據(jù)選取的正交表配方配制,接入40ml中國(guó)紅豆杉種子培養(yǎng)基中,在23 27°C、120rpm搖床轉(zhuǎn)速及黑暗條件下進(jìn)行生長(zhǎng)試驗(yàn)。實(shí)施例2初始生物量、種子培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)液初始糖度對(duì)中國(guó)紅豆杉細(xì)胞生長(zhǎng)的影響60ml培養(yǎng)基裝入250ml三角瓶?jī)?nèi),以B5培養(yǎng)基為基礎(chǔ)配方,添加lmg/L NAA和 0.2mg/L的6 BA,根據(jù)表I和表2的4因素3水平L9 (34)正交試驗(yàn)表配制成25g/L、16g/L、10g/L蔗糖濃度的不同培養(yǎng)基配方,接入40ml的細(xì)胞種子后使培養(yǎng)物中的初始生物量分別為I. 87 g/L、2. 81 g/L和3. 74 g/L,然后將搖瓶均勻置于25±2°C的恒溫室內(nèi)的搖床上,以120 rpm搖床轉(zhuǎn)速進(jìn)行振蕩培養(yǎng),細(xì)胞種子繼代培養(yǎng)到第7、9、11天取樣,檢測(cè)培養(yǎng)物中的細(xì)胞終生物量和培養(yǎng)液終pH、培養(yǎng)液終電導(dǎo)率、培養(yǎng)液終糖度。從表I和表2正交試驗(yàn)可得到如下結(jié)論I、種子初始生物量在2. 81 g/L時(shí),每升培養(yǎng)物中每克細(xì)胞每天鮮重和干重的增加速度都最快,而種子初始生物量在I. 87 g/L和3. 74 g/L時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯要慢,特別是在I. 87 g/L較低初始生物量時(shí)生長(zhǎng)最慢,證明細(xì)胞生長(zhǎng)有一最低密度效應(yīng),和現(xiàn)有文獻(xiàn)研究結(jié)果相同,因此將合適的細(xì)胞種子初始生物量定在2. 5^3. 5g/L之間。2、種子培養(yǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響在細(xì)胞生長(zhǎng)的前期7、天,有利于鮮重的增力口,而后期擴(kuò)11天有利于干重的增加,綜合鮮干重?cái)?shù)據(jù),在第擴(kuò)11天進(jìn)行細(xì)胞種子繼代培養(yǎng)比較合適。3、培養(yǎng)液初始糖度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響培養(yǎng)液初始糖度10g/L時(shí),細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯要快,培養(yǎng)液初始糖度為16g/L和25g/L時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)要慢,過(guò)高的培養(yǎng)液初始糖度減慢了細(xì)胞的生長(zhǎng)速度,結(jié)合2的結(jié)論種子在第911天進(jìn)行繼代培養(yǎng)比較合適,按糖度平均消耗為O. 26g/L/d/g為依據(jù),為了確保種子生長(zhǎng)狀態(tài)和質(zhì)量能維持穩(wěn)定,將合適的培養(yǎng)液初始糖度定在15 25g/L。表I L9 (34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表
權(quán)利要求
1.一種紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,其特征在于,依次包括下述步驟 (1)對(duì)繼代的種子進(jìn)行取樣,檢測(cè)種子終生物量、培養(yǎng)液終pH、培養(yǎng)液終電導(dǎo)率、培養(yǎng)液終糖度; (2)根據(jù)種子終生物量的大小,通過(guò)倒去培養(yǎng)液或加入水,將種子終生物量調(diào)整到5 10g/L ; (3)根據(jù)種子培養(yǎng)液終糖度大小,加入糖溶液將種子繼代培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)液初始糖度提高到 15 25 g/L ; (4)根據(jù)種子培養(yǎng)液終電導(dǎo)率大小,加入B5培養(yǎng)基或濃縮B5培養(yǎng)基將種子繼代培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)液初始電導(dǎo)率提高到2. 5^3. 5 ms/cm ; (5)將培養(yǎng)初始生物量控制在2.5^3. 5g/L,種子繼代培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)液初始pH控制在5.0 6. O,攪拌轉(zhuǎn)速控制在l(Tl30rpm,罐壓控制在0. 03 0. 07Mpa,25±2°C黑暗條件,調(diào)節(jié)通氣量大小并通過(guò)溶氧電極控制溶氧為20飛0%,進(jìn)行種子繼代培養(yǎng); (6)當(dāng)步驟(5)中的繼代培養(yǎng)的種子,同時(shí)滿(mǎn)足A、B、C三個(gè)條件時(shí)A、培養(yǎng)液終糖度大于8g/L ;B、培養(yǎng)液終電導(dǎo)率大于2. Oms/cm ;C、培養(yǎng)液終pH小于6. 0 ;按步驟(1) (5)啟動(dòng)下一次種子繼代培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,其特征在于,種子繼代培養(yǎng)時(shí)所述的種子初始生物量控制在3. Og/L,種子終生物量控制在7. 5g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,其特征在于,種子繼代培養(yǎng)時(shí)所述的溶氧控制在30 50%。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,其特征在于,種子繼代培養(yǎng)時(shí)所述的攪拌轉(zhuǎn)速控制在30rpm,罐壓控制在0. 05Mpa,培養(yǎng)溫度控制在25° C,在黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,其特征在于,種子繼代培養(yǎng)時(shí)所述的培養(yǎng)液初始糖度是21g/L,種子培養(yǎng)液終糖度大于8g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,其特征在于,所述的糖是蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、可溶性淀粉的其中一種糖或兩種及兩種以上的糖組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,其特征在于,種子繼代培養(yǎng)時(shí)所述的培養(yǎng)液初始電導(dǎo)率是3. Oms/cm,種子培養(yǎng)液終電導(dǎo)率大于2. Oms/cm。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,其特征在于,種子繼代培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)液初始PH范圍是5. (T6. 0,培養(yǎng)液終pH小于6. O。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,所述的種子繼代培養(yǎng)時(shí)更換B5培養(yǎng)基或濃縮B5培養(yǎng)基體積占總體積的比例是5(T60%。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種紅豆杉植物細(xì)胞種子穩(wěn)定培養(yǎng)方法,旨在提供一種經(jīng)濟(jì)可行、工藝簡(jiǎn)單可控、成本低并能夠穩(wěn)定培養(yǎng)紅豆杉植物細(xì)胞種子的方法;該方法是1)對(duì)繼代種子取樣檢測(cè);2)種子終生物量調(diào)整到5~10 g/L;3)培養(yǎng)液初始糖度提高到15~25 g/L;4)培養(yǎng)液初始電導(dǎo)率提高到2.5~3.5ms/cm;5)培養(yǎng)初始生物量控制在2.5~3.5g/L,初始pH控制在5.0~6.0,攪拌進(jìn)行種子繼代培養(yǎng);6)當(dāng)步驟5)中的繼代培養(yǎng)的種子滿(mǎn)足A、培養(yǎng)液終糖度大于8g/L或B、培養(yǎng)液終電導(dǎo)率大于2.0ms/cm或C、培養(yǎng)液終pH小于6.0;按步驟1)~5)啟動(dòng)下一次種子繼代培養(yǎng);屬于種子培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N5/04GK102965329SQ20121050620
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月30日
發(fā)明者李干雄, 侯云屏, 古志淵, 駱雪蘭, 曾騰鋒, 吳永艷, 肖華 申請(qǐng)人:廣東科倫藥業(yè)有限公司