一株能防治植物細(xì)菌病害的產(chǎn)酶溶桿菌無標(biāo)記工程菌株構(gòu)建與應(yīng)用的制作方法

專利名稱：一株能防治植物細(xì)菌病害的產(chǎn)酶溶桿菌無標(biāo)記工程菌株構(gòu)建與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一株能防治植物細(xì)菌病害的產(chǎn)酶溶桿菌無標(biāo)記工程菌株構(gòu)建與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
產(chǎn)酶溶桿菌(Lysobacter enzymogenes)是溶桿菌屬(Lysobacter)的模式種，屬于黃單胞科(Xanthomonadaceae),該菌菌落黏性、黃色、富含G+C%、有滑行能力，能產(chǎn)生蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、β -I, 3-葡聚糖酶，纖維素酶等多種胞外酶,對真菌、卵菌和線蟲等多種植物病原物都有很好的拮抗活性。
OHl I菌株分離于辣椒根際土壤，是國內(nèi)首次報道的一株生防細(xì)菌菌株。該菌株對水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)、黃瓜腐霉(Pythium ultimum)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、小麥赤霉病菌(Fusarum solani)、南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)等多種植物病原物均具有強(qiáng)烈的拮抗活性。在溫室盆栽試驗(yàn)中，OHll對辣椒疫病防治效果達(dá)到了 83.6%。然而，到目前為止，仍未見產(chǎn)酶溶桿菌防治植物細(xì)菌病害的報道。細(xì)菌的QS (Quorum sensing)系統(tǒng)是細(xì)菌通過分泌可溶性信號分子(autoinducer, Al)來監(jiān)測群體密度并調(diào)控細(xì)菌生物功能的信息交流機(jī)制。植物病原細(xì)菌產(chǎn)生的Al多數(shù)為?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHL)，該分子由一個可變的?；?ayslside chain)尾部與一個穩(wěn)定的高絲氨酸內(nèi)酯(HSL)頭部相連。不同的AHL分子其酰基鏈的長度為4至18個碳。大量研究證實(shí)植物病原細(xì)菌的QS系統(tǒng)調(diào)控細(xì)菌在寄主植物上的致病性，破壞細(xì)菌的QS系統(tǒng)，可以顯著降低病菌的致病性或使病菌完全喪失致病性。破壞植物病原細(xì)菌QS系統(tǒng)的方法有兩種，一種是將Al的合成酶基因敲除，使細(xì)菌無法產(chǎn)生Al，導(dǎo)致QS系統(tǒng)完全破壞。另外一種是利用相關(guān)外源蛋白(也稱為降解酶)來降解細(xì)菌QS信號分子，起到干擾或破壞細(xì)菌QS的目的,這種機(jī)制稱為群體淬滅(Quorum quenching, QQ)。在現(xiàn)有報道的降解酶中，研究最為透徹的是AiiA蛋白。該蛋白最早分離于Bacillus sp. 24菌株,能夠降解不同碳鏈分子的AHL類信號分子。在前期工作中，我們將外源的ai iA基因克隆到廣宿主載體PBBRI-MCS5，并導(dǎo)入OHll菌株。轉(zhuǎn)化后的OHll菌株能顯著降解軟腐病菌(Pectobacteriumcarotovorum)產(chǎn)生的AHL信號分子，并顯著降低該病菌在大白菜和馬鈴薯上的致病性，表明基于質(zhì)粒表達(dá)的外源AiiA降解酶有助于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)酶溶桿菌防治植物細(xì)菌病害。然而，含有外源質(zhì)粒的工程菌株，因?yàn)橘|(zhì)粒上往往含有抗生素編碼基因，導(dǎo)致這類工程菌株在田間應(yīng)用存在一定的風(fēng)險，如抗性基因可能會水平轉(zhuǎn)移，也可能會破壞土壤或植物根圍的微生物群落組成。針對這種情況，替代的方案是將外源優(yōu)良基因整合到生防細(xì)菌的染色體上，構(gòu)建出無抗生素標(biāo)記的工程菌株。無標(biāo)記工程菌株的構(gòu)建一般需要兩個條件，一是尋找或克隆一個組成型表達(dá)的強(qiáng)啟動子，便于在染色體上高強(qiáng)度啟動外源基因的表達(dá)，二是尋找一個合適的整合靶標(biāo)。因?yàn)楫?dāng)外源基因整合到靶基因后，靶基因會被插入突變失活，導(dǎo)致靶基因的功能喪失。因此，我們需要找到一個對產(chǎn)酶溶桿菌生防效果具有負(fù)向調(diào)控的功能基因來作為外源基因整合的靶標(biāo)基因。在前期工作中，我們構(gòu)建了一個新型、有效的啟動子探針，并從OHll菌株中克隆了一個組成型表達(dá)的強(qiáng)啟動子PB500。同時，我們又從產(chǎn)酶溶桿菌中克隆了一個色素合成相關(guān)基因hmgA(基因登錄號EU717786)。該基因突變后，OHll菌落在LB平板上會產(chǎn)生黑色素，但突變株對水稻紋枯病菌等植物真菌病害的防治效果提高近20%，表明hmgA是一個合適的外源基因整合靶標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明將以hmgA為祀標(biāo)基因，SacB為反向篩選標(biāo)記,將融合基因PB500_aiiA無標(biāo)記整合到OHll的染色體上，構(gòu)建無標(biāo)記、穩(wěn)定遺傳，并具有降解AHL類信號分子能力的產(chǎn)酶溶桿菌工程菌株OHl 1PA。工程菌株OHllPA對細(xì)菌性軟腐病具有較好的生防效果。 有益效果本發(fā)明提供的無標(biāo)記遺傳工程菌的構(gòu)建策略可為后續(xù)將其他優(yōu)良的外源基因定向整合到產(chǎn)酶溶桿菌中提供了技術(shù)參考。同時，本發(fā)明提供的多功能工程菌株OHllPA既能防治植物真菌病害，又具有了防治植物細(xì)菌病害的能力，拓寬了產(chǎn)酶溶桿菌的生防范圍，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)該菌的產(chǎn)業(yè)化發(fā)酵和田間應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。


圖I工程菌株OHllPA的構(gòu)建示意 2 PB500、ai iA 及 PB500_ai iA 的 PCR 擴(kuò)增圖3 DNA 片段 hmgA-F、hmgA-R、PB500-aiiA 和 pEX18GM 的電泳檢測圖4重組載體pEX18PAT的酶切驗(yàn)證圖5質(zhì)粒pEX18PAT的圖譜圖6疑似工程菌株OHl IPA的抗性和表型圖7疑似工程菌株OHl IPA的PCR驗(yàn)證圖8葡萄糖對OHllPA黑色素產(chǎn)生的抑制現(xiàn)象圖9菌株OHl IA對信號分子AHLA的降解活性圖10菌株OHllPA對大白菜軟腐病的離體生防效果
具體實(shí)施例方式以下通過具體實(shí)施對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但不限制本發(fā)明實(shí)施例I :含PB500-aiiA的產(chǎn)酶溶桿菌無標(biāo)記工程菌株的構(gòu)建I材料和方法I. I試驗(yàn)材料本試驗(yàn)所用的大腸桿菌菌株DH5a購置大連寶生物公司(TaKaRa)，SMlO λ pir和DH5a λ pir菌株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院朱軍教授惠贈。產(chǎn)酶溶桿菌由發(fā)明人分離并保存。載體pE)(18GM由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院朱軍教授惠贈。質(zhì)粒pME6863由SwissFederal Institute of Technology的Molina教授惠贈。大腸桿菌菌株的培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為37°C，液體培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為225 rpm / min。產(chǎn)酶溶桿菌的培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為30°C，液體培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為225rpm / min?？股貞c大霉素(Gm)、鏈霉素(Sm)、5_溴-4-氯-3- Π引哚-β -D-半乳糖苷(X_gal)均購置南京助研生物公司。I. 2 PB500_aiiA融合片段的構(gòu)建根據(jù)PB500和aiiA序列，設(shè)計如下引物PBA-I 5’ -AAGGATCCTGCGAGACAACTTTTTTCCG-3,(下劃緯為 BamHI) ;PBA_2 5’-GAAATAAAGCTTCTTTACTGTCATGGATCGAATATTCCTGGTTTTTC-3’ ；PBA-3 :5’-GAAAAACCAGGAATATTCGATCCATGACAGTAAAGAAGCTTTATTTC-3’ ；PBA_4:5’-AAAAGCTTCTATATATATTCAGGGAACAC-3’(下劃線為Hindlll)。以O(shè)Hll菌株的基因組DNA為模板，利用引物PBA-I / PBA_2，PCR擴(kuò)增啟動子PB500 ;以質(zhì)粒PME6863為模板，利用引物PBA-3 / PBA-4，PCR擴(kuò)增aiiA基因。之后，將PB500和aiiA的PCR產(chǎn)物按照mol比I : I混合，并以此混合液為模板，利用引 物 PBA-I / PBA-4，通過重疊 PCR 將 PB500 與 aiiA 連接成為 PB500-aiiA。PB500_aiiA 回收純化后進(jìn)行“TA”克隆，測序驗(yàn)證序列的正確性。I. 3hmgA-F 和 hmgA-R 的 PCR 擴(kuò)增根據(jù)hmgA 的序列.設(shè)計引物EHmgA-1 5, -AAGAATTCCGGCGCGTTCTCGCCGTTCG-3，(下劃線為酶切位點(diǎn) EcoRI) ；BhmgA-2 5, -AA GGATCCCGGCCCCAGATCCGGCAGCC-3，(下劃線為BamHI) ;HhmgA_3 :5’ 一 AAAAGCTTATCGGTTCCAACGGCCTGGC-3，(下劃線為 HindIII );PhmgA_4 5’ -AACTGCAGCCCGGGGCGAAGCCGCCGGC-3,(下劃線為酶切位占PstI)。以O(shè)Hll菌株的基因組DNA為模板，利用引物EhmgA-I / BhmgA_2，PCR擴(kuò)增hmgA基因5’端420bp的DNA片段，命名為HmgA-F ;同樣，以O(shè)Hl I基因組DNA為模板，利用引物HmgA-I / PhmgA-4，PCR擴(kuò)增hmgA基因3’端430bp的DNA片段，命名為hmgA-R。I. 4重組載體的pEX18PAT的構(gòu)建及驗(yàn)證建立200 μ L的酶切體系。分別使用內(nèi)切酶EcoRI/BamHI、BamHI / Hindi 11、HindIII / PstI、EcoRI / PstI 對 hmgA-F、PB500_aiiA、HmgA-R 和 pEX18GM 進(jìn)行雙酶切，回收純化。之后，將純化后的hmgA-F、PB500-aiiA、hmgA-R、pEX18GM在T4 DNA連接酶的作用下于16°C進(jìn)行連接，反應(yīng)20h后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 λ pir感受態(tài)細(xì)胞，在LA平板(含20 μ g / ml Gm)上篩選轉(zhuǎn)化子。陽性轉(zhuǎn)化子的篩選首先使用aiiA的特異性引物(PBAT3 /PBAT4)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，之后，培養(yǎng)PCR陽性克隆，并提取質(zhì)粒，用EcoRI / PstI進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，觀察hmgA-F、PB500-aiiA、hmgA-R能否同時連接到pEX18GM載體上。最后，攜帶有3個外源插入片段(hmgA-F、PB500-aiiA、hmgA-R)的 pEX18GM 被命名為 pEX18PAT。I. 5無標(biāo)記工程菌株OHllPA的構(gòu)建及驗(yàn)證無標(biāo)記工程菌株0H11PA的構(gòu)建過程見圖I。將ρΕΠ8ΡΑΤ電擊轉(zhuǎn)化SMlO λ pir感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性轉(zhuǎn)化子SM / PEX18PAT，將分別處于對數(shù)生長期的0H11(0D_=0. 5)與SM / PEX18GMPAT進(jìn)行兩親接合，在LA平板(100 μ g / mL Sm+200 μ g / mL Gm)上篩選單交換子。選取10個單交換子分別在空白LA培養(yǎng)基上劃線后2天后，再次劃線于含有10%蔗糖的LA(無Nacl)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2-3天后生長出來的單菌落(產(chǎn)可溶性黑色素)初步判定為“hmgA-disruption突變體”即工程菌株0H11PA。用滅菌牙簽將初步判定的工程菌株OHlIPA平行劃線接種于LB平板(100 μ g / mLSm)、LB 平板(100 μ g / mL Sm+200 μ g / mL Gm)，篩選在 LB 平板(100 μ g / mL Sm+200 μ g /mL Gm)中無法生長同時在LB平板(IOOyg / mL Sm)上生長，并在菌落周圍產(chǎn)生黑色暈圈的菌落，將這些菌株活化后，提取DNA，利用aiiA的特異性引物PBAT3 / PBAT4進(jìn)一步對篩選的疑似突變株進(jìn)行PCR驗(yàn)證，將陽性突變株命名為OHl 1PA。2結(jié)果顯示通過PCR擴(kuò)增，如圖2所示，成功獲得了 PB500_aiiA的融合片段(1434bp)、hmgA-F(420bp)和hmgA-R(430bp)。隨后通過酶促連接反應(yīng)，成功將hmgA-F、hmgA-R和PB500-ai iA克隆到自殺載體PEH8GM中，構(gòu)建成重組載體pEX18PAT (圖3 ;圖4)。通過接合作用，將pEX18PAT導(dǎo)入0Hll中，在LA平板(IOOyg / mLSm+200 μ g / mL Gm)上篩選產(chǎn)生可溶性黑色素的菌落(即hmgA第一次交換接合子)。將接合子在空白LB上劃線后，重新劃線于10%蔗糖的2YT平板上，在22°C培養(yǎng)2天后，將產(chǎn)生可溶性黑色素的單菌落挑出，驗(yàn)證對Gm的敏感性。如圖5所示，從含有10%蔗糖的LA平板上生長出來單菌落均對Gm敏感，而且在LA平板上產(chǎn)生可溶性黑色素。提取產(chǎn)可溶性黑色素的菌株的DNA，利用aiiA的特 異性引物PAT-I / PAT-2對疑似雙交換突變株進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)所有的疑似突變株均能擴(kuò)增出一條O. 75kb的特異性條帶(圖6)，以預(yù)期相符，表明aiiA已經(jīng)成功整合到OHll菌株的hmgA基因中，工程菌株OHl IPA構(gòu)建成功。實(shí)施例2 :含PB500_aiiA的產(chǎn)酶溶桿菌無標(biāo)記工程菌株對細(xì)菌性軟腐病的生防應(yīng)用I材料和方法I. I試驗(yàn)材料本試驗(yàn)所用的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院朱軍教授惠贈。產(chǎn)酶溶桿菌和大白菜軟腐病菌由發(fā)明人分離并保存。載體PME6863由 Swiss Federal Institute of Technology 的 Molina 教授惠贈。細(xì)菌培養(yǎng)使用 LB 培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為30°C，液體培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為225rpm / min?？股貞c大霉素(Gm)、鏈霉素(Sm)、壯觀霉素(Spe)、四環(huán)素(Tc)、5_漠-4-氣-3-卩引噪-β -D-半乳糖昔(X-gal)、SDS>NaC03等化學(xué)試劑均購置南京助研生物公司。I. 2 AHL類信號分子的提取和檢測用乙酸乙酯萃取的方法從大白菜軟腐病菌(Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum)中提取AHL類信號分子。將參試細(xì)菌進(jìn)行LB培養(yǎng)(IOOmL)，當(dāng)細(xì)菌培養(yǎng)液濃度達(dá)到OD6tltlnm=O. 6時，收集各細(xì)菌培養(yǎng)液，離心(12，OOOrpm, IOmin)后收集上清。之后，培養(yǎng)上清用乙酸乙酯萃取兩次，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中將萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮200倍后于-70°C保存，備用。AHL的定性檢測方法如下在96孔板中加入180 μ L AT培養(yǎng)基(2 μ g/mLTc+100 μ g / mL Spe+100 μ g / mL Gm+300 μ g / mL X-gal)，之后將 20 μ L 107cfu / mL 的超敏感檢測菌株JZAl加入到上述180 μ L AT培養(yǎng)基中，最后加入100 μ L 1%水瓊脂(60°C )，用移液器將培養(yǎng)液均勻混合后，將96孔板放入28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，10-12h后觀察X-gal的水解結(jié)果。如果X-gal水解變藍(lán)(即小孔呈藍(lán)色)，表明檢測液中存在一定濃度的AHL，顏色越藍(lán)，揭示檢測液中AHL的濃度越高；小孔中無藍(lán)色，表明檢測液中的AHL被完全降解。AHL的定量檢測采用β -半乳糖苷酶法按I 100的比例將檢測菌株JZAl加入到AT培養(yǎng)基中，分別加入?yún)⒃嚲甑臐饪s培養(yǎng)上清(10% )，培養(yǎng)至OD_為O. 2 I. O ;在2mL離心管中加入Z-bufTer，0. 5% SDS, CHCl3及O. 2mL上述培養(yǎng)菌液，充分振蕩。加入顯色底物ONPG，計時至溶液顯黃色，加入IM NaCO3終止反應(yīng)，計算Miller Units，檢測β-半乳糖苷酶活性。I. 3 AHL類信號分子的降解試驗(yàn)在5mL液體LB培養(yǎng)基中加入5 μ L濃縮的AHL類信號分子，配成LB-AHL液體培養(yǎng)基。之后，將10 μ L OHll和OHllPA的細(xì)菌培養(yǎng)液(OD600nm=O. 6)加入LB-AHL培養(yǎng)液中，過夜培養(yǎng)后，利用AHL類信號分子超敏感檢測菌株JZAl檢測過夜培養(yǎng)中AHL的濃度，通過比較過夜培養(yǎng)液和空白培養(yǎng)液(LB-AHL)中AHL濃度差異(β-半乳糖苷酶的活性)來評價OHl IA菌株對AHL的降解能力。I. 4大白菜軟腐病的離體生防試驗(yàn)及發(fā)病組織中病菌和生防菌的重新分離
用自來水清洗新鮮大白菜的葉片，之后，用70%的酒精進(jìn)行表面消毒。待葉片表面的酒精揮發(fā)后，用滅菌手術(shù)刀片將葉片切成10X4cm的小方塊。產(chǎn)酶溶桿菌和軟腐病菌在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h后，將菌液濃度調(diào)整為IO7 CFU / mL，之后將產(chǎn)酶溶桿菌菌液與軟腐病菌菌液按體積比I : I混合，并在28°C培養(yǎng)箱中放置4h。隨后，用滅菌牙簽在消毒過的葉片表面扎一個2mm深的小孔，將5μ L產(chǎn)酶溶桿菌與軟腐病菌混合菌液接種于小孔中，接種后的葉塊放置在含有無菌濾紙(無菌水濕潤)的培養(yǎng)皿中，并在28°C培養(yǎng)箱中放置12h后，觀察葉塊的發(fā)病程度。采用十字交叉法測定病斑的最長直徑和最短直徑，平均值最為有效直徑，利用公式^!※(直徑/ 2)2計算發(fā)病面積，并作為發(fā)病嚴(yán)重度的評價指標(biāo)。病原真菌或卵菌的平板拮抗活性測定2、結(jié)果顯示由于菌株OHllPA在LB-AHLA (LB中含有2% (v / V)信號分子AHLA)中產(chǎn)生可溶性黑色素，使得培養(yǎng)上清變?yōu)楹谏?，這給后續(xù)利用JZAl檢測培養(yǎng)液中AHLA的濃度帶來了困難，因?yàn)楹谏馗蓴_了小孔中X-gal被水解后藍(lán)色的觀察。為了克服這一問題，我們篩選了能抑制黑色素產(chǎn)生的物質(zhì)。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基含有2%葡萄糖時，OHllPA則不產(chǎn)生黑色素，揭示葡萄糖可以抑制OHlIPA產(chǎn)生黑色素(圖7)。因此，在后續(xù)的AHLA降解試驗(yàn)中，我們在原先的LB-AHLA培養(yǎng)中又額外添加了終濃度為2 %葡萄糖，有效抑制了 OHl IPA產(chǎn)生黑色素。因此，使用LB-AHLA-glucose培養(yǎng)基，并結(jié)合AHL超敏感檢測菌株JZAl，可以評價OHl IPA對外源信號分子AHLA的降解效率。如圖8所示，在AHL的定性試驗(yàn)中，根據(jù)每個小孔是否藍(lán)色，可以發(fā)現(xiàn)菌株OHllPA能顯著降解由A. tumefaciens RlO產(chǎn)生的信號分子AHLA,小孔基本沒有顯藍(lán)。在同樣的操作條件下，野生型OHll則無法降解AHLA，導(dǎo)致小孔呈現(xiàn)明顯藍(lán)色。為了進(jìn)一步確定OHllPA對AHLA的降解效率，我們進(jìn)行了 AHL的定量檢測，如圖9所示，通過測定培養(yǎng)液中半乳糖苷酶的活性，發(fā)現(xiàn)在對照培養(yǎng)液(AHLA與LB混合液)中β-半乳糖苷酶的活性(Miller unite) : 1579. I± 111. O。同時，在OHl IPA與AHLA的混合培養(yǎng)液中半乳糖苷酶的活性(Miller unite)為149. 3±7. 8，表明大部分的AHLA已被OHlIPA降解，進(jìn)一步確認(rèn)OHlIPA能對AHLA的降解效率。此外，在OHll與AHLA混合培養(yǎng)液中，β-半乳糖苷酶的活性(Miller unite) :1448. 5±34. 7，與對照培養(yǎng)液中β-半乳糖苷酶的活性相似，進(jìn)一步表明OHll不能降解AHLA。離體試驗(yàn)表明，菌株OHllPA能顯著降低軟腐病菌在大白菜上的致病性。如圖10所示，接種12h后，在大白菜葉片上，單獨(dú)接種軟腐病菌的接種點(diǎn)周圍變得腐爛，腐爛面積達(dá)到I. 44±0. 07cm2。同時，OHll與軟腐病菌共同接種的接種點(diǎn)周圍的腐爛面積也達(dá)到了
I.51±0. 13cm2，表明OHll不能降低軟腐病菌在大白菜上的致病性。然而，在同樣的操作條件下，OHllPA與軟腐病菌共同接種的接種點(diǎn)周圍腐爛面積最小，僅有O. 38±0. 07cm2，表明OHllPA降低病菌在大白菜上的致病性。
權(quán)利要求
1.一株能防治植物細(xì)菌病害的產(chǎn)酶溶桿菌無標(biāo)記工程菌株構(gòu)建。
2.編碼權(quán)利要求I所述的工程菌對細(xì)菌性軟腐病菌產(chǎn)生的群體感應(yīng)信號分子AHL的降解應(yīng)用。
3.編碼權(quán)利要求I所述的工程菌對細(xì)菌性軟腐病的生防應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株能防治植物細(xì)菌病害的產(chǎn)酶溶桿菌無標(biāo)記工程菌株構(gòu)建策略及過程，屬于微生物基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明提供的產(chǎn)酶溶桿菌無標(biāo)記工程菌株只是將外源優(yōu)良基因aiiA定向整合到染色體上，無任何標(biāo)記基因帶入。該工程菌株能高效破壞植物病原細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)，顯著降低病原細(xì)菌在寄主植物(大白菜)上的致病性，實(shí)現(xiàn)對植物細(xì)菌病害的生物防治。
文檔編號C12N1/21GK102943061SQ20121049251
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月28日
發(fā)明者劉鳳權(quán), 錢國良 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)