專利名稱：一株固氮螺菌及其微生物制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株新菌種及其制劑，特別涉及一株固氮螺菌及其微生物制劑。
背景技術(shù)：
固氮螺菌屬由Tarrand et al. (1978)首次描述，現(xiàn)有15個(gè)種，其模式株為A lipoferum。固氮螺菌在自然界中分布廣泛,特別是在熱帶、亞熱帶、溫帶的土壤中(Lavrinenko et al., 2010)。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)該屬的數(shù)個(gè)種因?yàn)榫哂泄痰芰?，從而可以促進(jìn)植株生長(Dobereiner, 1983; Okon, 1985)。腐殖質(zhì)是富含醌基的、非均相的天然有機(jī)混合物，廣泛存在于陸地環(huán)境和水環(huán)境中，可以作為微生物厭氧生長的電子受體(Lovley ei a7.，1996; Wu et al. , 2011)。 腐殖質(zhì)厭氧呼吸在土壤有機(jī)污染物降解中有著重要的作用，能夠進(jìn)行腐殖質(zhì)厭氧呼吸的微生物可以更為快速有效地降解有機(jī)污染物。為了獲得可以進(jìn)行腐殖質(zhì)還原的菌株，在微生物的富集或分離培養(yǎng)中，經(jīng)常使用腐殖質(zhì)含醌部分的模式化合物6- 二磺酸二鈉(AQDS)作為電子受體(Straub et al.，2005)。盡管已經(jīng)在天然或人工生境中分離得到了多株腐殖質(zhì)還原菌株，但是，在此之前，并未有文章報(bào)導(dǎo)可進(jìn)行腐殖質(zhì)還原的固氮螺菌屬菌種。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株新的固氮螺菌及其微生物制劑。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是
申請人:于2012年11月I日將菌株提交位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所內(nèi)的中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏中心于2012年11月5日收到申請人提供的菌株SgZ-5T，給予該培養(yǎng)物的保藏號為CGMCC NO. 6778，建議的分類命名為AzospiriIlumhumicireducens SgZ_5T?！N微生物制劑,含有上述固氮螺菌SgZ_5T。本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明的固氮螺菌，不僅具有固氮作用，還可以進(jìn)行腐殖質(zhì)還原，在土壤修復(fù)、土質(zhì)改良及促進(jìn)作物生長等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。本發(fā)明的微生物制劑，可以很好地應(yīng)用于土壤修復(fù)、土質(zhì)改良及促進(jìn)作物生長。
圖I是本發(fā)明菌株SgZ_5T的透射電鏡 圖2是本發(fā)明菌株SgZ-5T內(nèi)含物PHB檢測的光學(xué)顯微鏡 圖3是本發(fā)明菌株SgZ-5T以不同電子供體還原AQDS 圖4是本發(fā)明菌株SgZ-5T與其他菌株比較AQDS還原能力 圖5是本發(fā)明菌株SgZ-5T的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹。
具體實(shí)施例方式申請人:于2012年11月I日將菌株提交位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所內(nèi)的中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏中心于2012年11月5日收到申請人提供的菌株SgZ-5T，給予該培養(yǎng)物的保藏號為CGMCC NO. 6778，建議的分類命名為AzospiriIlumhumicireducens SgZ_5T。一種微生物制劑，含有上述固氮螺菌SgZ-5T，余部可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的載體。菌株的富集和分離
本發(fā)明菌株SgZ-5T分離自本實(shí)驗(yàn)室的微生物燃料電池(MFC)的陽極生物膜。使用的MFC中接種有2g水稻土和10 ml的乙酸鈉(1000 mg Γ1)培養(yǎng)液。具體的富集和分離操作如下
取一小片陽極生物膜，置于100 ml添加有乙酸鈉(電子供體，終濃度為10 mmol Γ1)和AQDS (電子受體，終濃度為I mmol Γ1)的滅菌礦物鹽培養(yǎng)基(MSM)中[MSM，每升培養(yǎng)液中含有 2.5 g NaHCO3, O. 68 g NaH2PO4, O. 25 g NH4Cl, O. I g KCl (Li et al., 2009)，以及1% (V v)的微量元素溶液和1% (V v)的的維生素溶液(Lovley & Phillips, 1988)，pH 7.2]，向瓶中通入無氧的N2/C02 (80/20，v/v)混合氣30 min，排除其中存在的氧氣，之后使用丁基橡膠塞加鋁蓋密封，30°C靜置培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)液的顏色變化情況；
5d后，培養(yǎng)液變?yōu)槌赛S色，表達(dá)培養(yǎng)液中添加的AQDS被微生物還原了。因?yàn)锳QDS本身是無色的，其還原態(tài)是橙黃色。之后從瓶中取10% (10 ml)的培養(yǎng)液，接種至100 ml新鮮培養(yǎng)液中，如此富集培養(yǎng)3次。菌株的分離通過平板涂布法進(jìn)行。將富集培養(yǎng)物梯度稀釋，然后涂布在NA (營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，PH 7. 2)平板上，30 °C培養(yǎng)4 d。其中，NA的組成為每升去離子水中添加5g蛋白胨、3 g牛肉浸膏、5 g NaCl和15 g瓊脂。篩選出單菌落并接種至相同的培養(yǎng)基上，以便進(jìn)行后續(xù)研究。得到的菌株在添加了 15% (v/v)甘油的NB培養(yǎng)基中于-80°C保存。除非特別說明，進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、生化分類學(xué)研究時(shí)，菌株SgZ_5T均在pH為
7.2的NB培養(yǎng)基上，30°C條件下進(jìn)行培養(yǎng)。菌株SgZ_5T培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。菌落形態(tài)直接在NA培養(yǎng)基上觀察。革蘭氏反應(yīng)按Doetsch (1981)所述的方法進(jìn)行。使用Hugh和Leifson使用的培養(yǎng)基和方法(Leifson，1963)進(jìn)行氧化發(fā)酵測試。麥康凱培養(yǎng)基生長實(shí)驗(yàn)如下在麥康凱平板上接種150 μ I細(xì)菌懸浮液，30°C培養(yǎng)I周。生物素需求分析按Tarrand等人(1978)描述的方法進(jìn)行。測試了不同溫度下(0，4，10，15，20，25，30，37，40，42，and 45°C )菌株在NB培養(yǎng)基生長一周的情況。在含有0-10% NaCl (w/v)的NB培養(yǎng)基上進(jìn)行菌株的NaCl耐受生長測試，以增殖1%判定為可生長。在NB培養(yǎng)基上確定菌株的生長pH范圍，使用的緩沖系統(tǒng)為pH 4. O - 5. O, O. I M檸檬酸/0. I M檸檬酸鈉;pH 6. O - 8. O, O. IM KH2P04/0. I M NaOH; pH 9.0-10.0，O. I M NaHC03/0. I M Na2CO3; pH 11. 0, 0. 05 MNa2HP04/0.1 M NaOH (Zhang et al., 2009)。根據(jù)廠家的使用說明書，使用 API 20E, API20NE和API ID 32GN菌株鑒定試劑條(bioM6rieux)確定菌株的其他生理生化特性。菌株的運(yùn)動性、氧化酶活性、過氧化氫酶活性、脫氧核糖核酸酶活性，吐溫-80、吐溫-20、卵磷酯、酪蛋白、纖維素和淀粉的水解活性按《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》(東秀珠和蔡妙英，2001)進(jìn)行。所有的測試進(jìn)行2次。鑒定結(jié)果顯示
菌株SgZ-5T為革蘭氏陰性菌，兼性厭氧，有鞭毛，為螺旋或略為彎曲的棒狀，長I. 2 -
1.8Mm，寬2. 5-5. 5 Mm，依靠端生單鞭毛進(jìn)行運(yùn)動(見圖I);細(xì)胞內(nèi)含有顆粒，蘇丹黑染色后光鏡檢測確認(rèn)顆粒為聚羥基丁酸(PHB) (Schlegel et al. , 1970)(見圖2)。菌株在NA培養(yǎng)基上有氧生長24 h (30°C)后，形成奶油色、圖形、光滑、凸起并不透明的菌落，菌落直徑為I. O - I. 5 _。菌株582-57在咄培養(yǎng)基上，25 37°C，pH 5.5-8.5 (最佳7. 2)和O - 1% NaCl的條件下可以生長。菌株具有運(yùn)動性、氧化酶活性、過氧化氫酶活性、七葉甙水解活性、可利用葡萄糖鹽、己二酸，無脫氧核糖核酸酶活性、無法進(jìn)行亞硝酸鹽還原、無法利用苯乙酸，無法通過氧化發(fā)酵測試。菌株SgZ-5T與近源菌株的部分生理學(xué)特性比較見表I。表I、菌株特性比較表
權(quán)利要求
1.一株固氮螺菌，保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心，其保藏號為CGMCC NO.6778。
2.一種微生物制劑，含有權(quán)利要求I所述的固氮螺菌。
3.權(quán)利要求I所述的固氮螺菌在腐殖質(zhì)還原中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株固氮螺菌及其微生物制劑。固氮螺菌SgZ-5T保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CGMCCNO.6778。本發(fā)明的固氮螺菌SgZ-5T，不僅具有固氮作用，還可以進(jìn)行腐殖質(zhì)還原，在土壤修復(fù)、土質(zhì)改良及促進(jìn)作物生長等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N1/20GK102965307SQ20121044908
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月9日
發(fā)明者楊貴芹, 周順桂, 韓陸超 申請人:廣東省土壤科學(xué)博物館