一種無色素普魯蘭多糖的發(fā)酵生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種無色素普魯蘭多糖的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特點在于在發(fā)酵過程中添加微量復合氨基酸，氨基酸的添加量為0-0.5%，使發(fā)酵液色素含量低，發(fā)酵周期僅為50-55h，后續(xù)處理工藝簡單，生產(chǎn)出的普魯蘭多糖無色素，品質(zhì)好。本方法的實施步驟如下：1）制備種子培養(yǎng)基；2）制備發(fā)酵培養(yǎng)基；3）將液體種子接入到一級種子罐，接種量為3-5%，發(fā)酵培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)入二級種子罐中培養(yǎng)12h，將種子培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入所述發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，控制發(fā)酵溫度為29℃±1℃，罐壓為0.08MPa，初始pH為6.5-6.7，發(fā)酵培養(yǎng)50-55h；4）將上述發(fā)酵液經(jīng)過濾，酒精沉淀，干燥得到無色素的普魯蘭多糖。
【專利說明】一種無色素普魯蘭多糖的發(fā)酵生產(chǎn)方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物多糖的方法，更具體的說是普魯蘭多糖的發(fā)酵方法，屬于生物工程領域。
【背景技術】
[0002]普魯蘭多糖(Pullulan)又稱短梗霉多糖，是出芽短梗霉的發(fā)酵產(chǎn)物，是一種水溶性的細胞外中性大分子多糖。早在1936年人們就發(fā)現(xiàn)了普魯蘭多糖，1958年Bernier再次從發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)該多糖，次年Bender等人將之命名為短梗霉多糖。到二十世紀六十年代，人們開始對其發(fā)酵、提取和應用等方面進行研究，1978年日本林原公司實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)普魯蘭多糖。普魯蘭多糖是一種以麥芽三糖為單元，以α-1，6鍵重復連接而成的線狀高分子多糖，分子量一般在5.0X 104-5.0X 106dol.之間，它無色無味,無毒無害,對人體無任何副作用。并具有極佳的成膜性、氧氣不滲透性、成纖維性、可塑性、粘結(jié)性和易自然降解等許多獨特的物理化學和生物學特性，故可以被廣泛的應用到醫(yī)藥制造業(yè)、食品工業(yè)、化妝品工業(yè)和農(nóng)業(yè)等多個領域，是一種具有極大的應用價值和巨大開發(fā)潛力的多功能新型生物產(chǎn)品。目前，國內(nèi)外用于普魯蘭生產(chǎn)的菌種均為出芽短梗霉，以蔗糖、葡萄糖等多種小分子糖類及可溶性淀粉做碳源，以酵母膏、玉米漿為有機氮源，進行發(fā)酵；下游處理時目前的普遍采用的方法為:發(fā)酵液稀釋、離心、脫色、濃縮、酒精沉淀或者噴霧干燥。發(fā)酵時間一般在120-153小時，耗時比較長，得率低；發(fā)酵液為深褐色，含有的色素較多且難以除掉，使產(chǎn)品最終呈現(xiàn)不正常的顏色，影響產(chǎn)品品質(zhì)；在下游處理時工序太多，耗費大量的酒精，且需要重復提純、溶解、沉 降以除去雜質(zhì)，相應地會延長生產(chǎn)周期，產(chǎn)品的損失量較大，使得生產(chǎn)成本大大增加。
[0003]因此，研究出一種節(jié)能高效的生產(chǎn)高品質(zhì)無色素的普魯蘭多糖的發(fā)酵方法是該領域科研人員急待解決的問題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的在于克服上述不足之處，提供一種有效提高產(chǎn)品質(zhì)量、工藝簡單的無色素普魯蘭多糖的發(fā)酵方法以解決生產(chǎn)和應用的問題。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過下述步驟予以實現(xiàn):
O制備種子培養(yǎng)基，其水溶液組成為(g/L):蔗糖40.0-60.0，氯化鈉1.0-2.0，硫酸鎂
0.1-0.4，磷酸氫二鉀 5.0-8.0，硫酸銨 0.5-1.0，酵母膏 2.0-5.0，調(diào) pH 為 6.5-6.7 之間，121°C 滅菌 20min ；
2)取一環(huán)出芽短梗霉菌種接入在上述種子培養(yǎng)基中，經(jīng)一級種子、二級種子種子罐逐步擴大培養(yǎng)后，作為液體種子；
3)制備發(fā)酵初始培養(yǎng)基，其水溶液組成為(g/L):蔗糖100.0-150.0，氯化鈉1.0-2.0，硫酸鎂0.5-1.0，磷酸氫二鉀5.0-8.0，硫酸銨1.0-2.0，復合氨基酸0_5.0，酵母膏
2.0-5.0，，消泡劑 0.3-0.5，調(diào) pH 到 6.5-6.7 之間，121°C滅菌 20min ;4)將上述液體種子接入所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為3%-5%，控制發(fā)酵溫度為29 0C ±1°C，發(fā)酵培養(yǎng) 50-55h ;
5)將上述發(fā)酵液過濾，酒精沉淀，干燥得到白色的普魯蘭多糖。
[0006]本發(fā)明的有益效果是:在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了不同組成的復合氨基酸作為添加氮源，使得菌種在此條件下發(fā)酵的發(fā)酵液顏色淺，產(chǎn)量高，且發(fā)酵周期為50-55h，時間明顯縮短，后期處理工序簡單，使得生產(chǎn)更高效并節(jié)省了能源。在此條件下生產(chǎn)的普魯蘭多糖，顏色潔白，收率高。
【具體實施方式】
[0007]以下結(jié)合較佳實施例，【具體實施方式】詳述如下。
[0008]對照例
1)制備種子培養(yǎng)基，其水溶液組成為(g/L):蔗糖40.0，氯化鈉1.0，硫酸鎂0.2，磷酸氫二鉀6.0，硫酸銨1.0，酵母膏4.0，調(diào)Ph到6.5，121°C滅菌20min ；
2)取一環(huán)出芽短梗霉菌種接入在上述種子培養(yǎng)基中，經(jīng)一級種子、二級種子種子罐逐步擴大培養(yǎng)后，作為液體種子；
3)制備發(fā)酵初始培養(yǎng)基，其水溶液組成為(g/L):蔗糖100.0，氯化鈉1.0，硫酸鎂0.2，磷酸氫二鉀6.0，硫酸銨1.06，酵母膏2.0，調(diào)PH到6.5之間，121。。滅菌20min ；
4)將上述液體種子接入所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為3%，控制發(fā)酵溫度為29°C，發(fā)酵培養(yǎng)74h，發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵液中多糖含量為64g/L ；
5)將上述發(fā)酵液過濾，酒精沉淀，干燥得到分子量為15萬道爾頓的普魯蘭多糖，產(chǎn)品為淺黃色粉末，白度為58.9%，溶解后黃色透明。
[0009]比較例I
1)制備種子培養(yǎng)基，其水溶液組成為(g/L):蔗糖40.0，氯化鈉1.0，硫酸鎂0.2，磷酸氫二鉀6.0，硫酸銨1.0，酵母膏4.0，調(diào)PH到6.5，121°C滅菌20min ；
2)取一環(huán)出芽短梗霉菌種接入在上述種子培養(yǎng)基中，經(jīng)一級種子、二級種子種子罐逐步擴大培養(yǎng)后，作為液體種子；
3)制備發(fā)酵初始培養(yǎng)基，其水溶液組成為(g/L):蔗糖100.0，氯化鈉1.0，硫酸鎂0.2，磷酸氫二鉀6.0,硫酸銨1.06,谷氨酸0.6，纈氨酸0.4，絡氨酸0.3，絲氨酸0.4，酵母膏2.0，，調(diào) PH 到 6.5 之間，121°C滅菌 20min ；
4)將上述液體種子接入所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為3%，控制發(fā)酵溫度為29°C，發(fā)酵培養(yǎng)51h，發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵液中多糖含量為74g/L ；
5)將上述發(fā)酵液過濾，酒精沉淀，干燥得到分子量為18萬道爾頓的普魯蘭多糖，產(chǎn)品為白色粉末，白度達98.9%，溶解后無色透明。
[0010]比較例2
1)制備種子培養(yǎng)基，其水溶液組成為(g/L):蔗糖50.0，氯化鈉1.5，硫酸鎂0.3，磷酸氫二鉀7.0，硫酸銨0.8，酵母膏5.0，調(diào)PH到6.5之間，121。。滅菌20min ；
2)取一環(huán)出芽短梗霉菌種接入在上述種子培養(yǎng)基中，經(jīng)一級種子、二級種子種子罐逐步擴大培養(yǎng)后，作為液體種子；
3)制備發(fā)酵初始培養(yǎng)基，其水溶液組成為(g/L):蔗糖120.0，氯化鈉1.5，硫酸鎂0.3，磷酸氫二鉀7.0,硫酸銨0.8，谷氨酸0.1，蛋氨酸0.8，賴氨酸0.7，天冬氨酸0.8，酵母膏3.0，調(diào) PH 到 6.5 之間，121°C滅菌 20min ；
4)將上述液體種子接入所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為3%，控制發(fā)酵溫度為29°C，發(fā)酵培養(yǎng)54h，發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵液中多糖含量為82g/L ；
5)將上述發(fā)酵液過濾，酒精沉淀，干燥得到分子量為14萬道爾頓的普魯蘭多糖，產(chǎn)品為白色粉末，白度達98.5%，溶解后無色透明。
[0011]比較例3
1）制備種子培養(yǎng)基，其水溶液組成為(g/L):蔗糖5.0，氯化鈉1.5，硫酸鎂0.3，磷酸氫二鉀6.0，硫酸銨0.8，酵母膏3.0，調(diào)PH到6.7，121°C滅菌20min ；
2)取一環(huán)出芽短梗霉菌種接入在上述種子培養(yǎng)基中，經(jīng)一級種子、二級種子種子罐逐步擴大培養(yǎng)后，作為液體種子；
3)制備發(fā)酵初始培養(yǎng)基，其水溶液組成為(g/L):蔗糖150.0，氯化鈉2.0，硫酸鎂0.3，磷酸氫二鉀6.0，硫酸銨1.5，谷氨酸0.8，色氨酸0.5，丙氨酸0.5，胱氨酸0.5，酵母膏2.0,調(diào) PH 到 6.5，121°C 滅菌 20min ；
4)將上述液體種子接入所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5%，控制發(fā)酵溫度為29°C，發(fā)酵培養(yǎng)58h，發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵液中多糖含量為112g/L ；
5)將上述發(fā)酵液過濾，酒精沉淀，干燥得到分子量為14萬道爾頓之間的普魯蘭多糖，產(chǎn)品為白色粉末，白度達99.3%，溶解后無色透明。
【權利要求】
1.一種無色素普魯蘭多糖的發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括出芽短梗霉的發(fā)酵培養(yǎng)和普魯蘭多糖的分離純化，其特征在于在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加微量復合氨基酸，發(fā)酵培養(yǎng)50-55h后,進行發(fā)酵液后處理提取純化普魯蘭多糖。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種無色素普魯蘭多糖的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于:詳細的步驟如下: (1)制備液體種子培養(yǎng)基，將出芽短梗霉菌種接到上述種子培養(yǎng)基，經(jīng)一級、二級種子iil逐步擴大培養(yǎng)后，作為液體種子； (2)制備發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)pH到6.5-6.7之間，121。。滅菌20min ； (3)將(I)所述液體種子接入到(2)所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為3%-5%，控制發(fā)酵溫度為 29°C ± 1°C，罐壓為 0.08MPa,初始 pH 為 6.5-6.7，發(fā)酵培養(yǎng) 50_55h ； (4)將上述發(fā)酵液經(jīng)過濾除菌，酒精沉淀，干燥得到無色素的普魯蘭多糖。
3.根據(jù)權利要求1、2所述的一種無色素普魯蘭多糖的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于:種子培養(yǎng)基組成成分為(g/L):蔗糖40.0-60.0，氯化鈉1.0-2.0，硫酸鎂0.1-0.4，磷酸氫二鉀5.0-8.0，硫酸銨 0.5-1.0，酵母膏 2.0-5.0, pH 為 6.5-6.7 之間。
4.根據(jù)權利要求1、2所述的一種無色素普魯蘭多糖的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于:發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分為(g/L):蔗糖100.0-150.0，氯化鈉1.0-2.0，硫酸鎂0.5-1.0，磷酸氫二鉀5.0-8.0，硫酸銨1.0-2.0，復合氨基酸0-5.0，酵母膏2.0-5.0。
5.根據(jù)權利要求 1、4所述的一種無色素普魯蘭多糖的生產(chǎn)方法，其特征在于:發(fā)酵培養(yǎng)基中的復合氨基酸為蛋氨酸、絡氨酸、丙氨酸、絲氨酸、色氨酸、胱氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、絲氨酸、谷氨酸、精氨酸中的一種或幾種，每種氨基酸的濃度為0-0.5%。
【文檔編號】C12P19/04GK103805650SQ201210443725
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月9日 優(yōu)先權日:2012年11月9日
【發(fā)明者】王林, 朱希強, 蘇移山, 朱云峰, 李偉, 凌沛學 申請人:山東福瑞達生物科技有限公司