專利名稱：長(zhǎng)爪沙鼠原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種簡(jiǎn)便實(shí)用的長(zhǎng)爪沙鼠原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)長(zhǎng)爪沙鼠的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化研究始于1978年，目前我國(guó)主要有兩個(gè)長(zhǎng)爪沙鼠群，分別保存于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心和首都醫(yī)科大學(xué)。長(zhǎng)爪沙鼠對(duì)食物中的脂肪、維他命EJi固醇敏感，可作為研究食物源性膽固醇誘導(dǎo)的高膽固醇血癥的動(dòng)物模型。長(zhǎng)爪沙鼠肝臟中低密度脂蛋白受體的表達(dá)與食物源蛋白顯著相關(guān)，而人肝癌細(xì)胞的低密度脂蛋白受體表達(dá)則無(wú)顯著變化，表明在研究細(xì)胞表面受體時(shí)原代肝細(xì)胞較瘤化的肝細(xì)胞系具有優(yōu)勢(shì)。值得注意的是長(zhǎng)爪沙鼠的脂代謝與人類的脂代謝有諸多相似。長(zhǎng)爪沙鼠血液中載脂蛋白與高密度脂蛋白膽固醇水平呈高度正相關(guān)，與人類代謝研究結(jié)果一致；低密度脂蛋白是脂蛋白膽固醇的主要載體，與人類相近；對(duì)紅花油、橄欖油或椰子油的反應(yīng)都與人相似。此外，長(zhǎng)爪沙鼠是雜食性動(dòng)物，由貧瘠的荒漠地帶至實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，飲食結(jié)構(gòu)中脂質(zhì)含量顯著增加，與國(guó)民飲食結(jié)構(gòu)改善類似。且長(zhǎng)爪沙鼠個(gè)體小、易管理，因而是研究脂代謝的良好動(dòng)物模型。肝臟在脂質(zhì)代謝中起著重要作用，它能合成脂蛋白，有利于脂質(zhì)運(yùn)輸，也是脂肪酸氧化和酮體形成的主要場(chǎng)所。肝臟主導(dǎo)膽固醇代謝，膽固醇在肝臟中合成，并可轉(zhuǎn)變成膽汁酸鹽隨膽汁排出，同時(shí)肝臟還能將碳水化合物轉(zhuǎn)變成脂肪。肝細(xì)胞是肝臟眾多功能的最終承擔(dān)者，肝細(xì)胞的體外培養(yǎng)成為很多體外實(shí)驗(yàn)研究的前提，治療藥物的研發(fā)、細(xì)胞周期的調(diào)控、激素與受體的相互作用等都廣泛地應(yīng)用離體肝細(xì)胞模型。原代肝細(xì)胞較好保留并維持了肝細(xì)胞形態(tài)的完整性和體外代謝活性，可以在接近生理濃度的情況下開展研究，并排除了其他器官、組織的影響。原代肝細(xì)胞培養(yǎng)已廣泛應(yīng)用于藥物的體外代謝研究，它能在較短時(shí)間內(nèi)得到大量的代謝產(chǎn)物，相對(duì)而言易于控制代謝條件、代謝體系單純，在研究藥物代謝途徑、代謝機(jī)制和藥物相互作用，尤其在代謝物結(jié)構(gòu)鑒定方面具有較大的優(yōu)越性。中國(guó)專利申請(qǐng)CN200910031021.9中公開了一種大鼠肝細(xì)胞分離培養(yǎng)的方法。大鼠用戊巴比妥鈉麻醉，并給予肝素鈉抗凝，做門靜脈插管，兩步灌流法灌流，取下消化成熟肝臟，收集肝細(xì)胞于4°C含1%牛血清白蛋白(BSA)的HANKS液中，肝細(xì)胞懸液用篩網(wǎng)過(guò)濾，濾液離心、沉淀后，收集沉淀于LEIBOVITZ’ S-15 (L-15)完全培養(yǎng)基中，調(diào)整肝細(xì)胞密度為3 6 X IO5個(gè)/mL接種于鋪鼠尾膠原的培養(yǎng)板中，于37°C、5%C02環(huán)境中培養(yǎng)。接種后4h換液去除未貼壁及死細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)20h后可用于試驗(yàn)。但該方法并不適用于長(zhǎng)爪沙鼠肝細(xì)胞的培養(yǎng)。理想的肝細(xì)胞是該體外模型建立的前提，高產(chǎn)量、高活性、功能良好的肝細(xì)胞是其關(guān)鍵因素。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)關(guān)于長(zhǎng)爪沙鼠原代肝細(xì)胞離體模型的研究，國(guó)外也尚未建立完善的培養(yǎng)體系
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在針對(duì)目前長(zhǎng)爪沙鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)方法的空缺，提供了一種簡(jiǎn)便實(shí)用的長(zhǎng)爪沙鼠原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法，為長(zhǎng)爪沙鼠肝細(xì)胞應(yīng)用于科學(xué)研究提供技術(shù)保障?！N長(zhǎng)爪沙鼠原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括步驟( I)從消化成熟的離體長(zhǎng)爪沙鼠肝臟中收集肝細(xì)胞初懸液，過(guò)濾，濾液除雜后加入含5%小牛血清的Hank' s平衡鹽溶液(Hanks Balanced SaltSolutions,簡(jiǎn)稱HBSS),反復(fù)離心洗滌，收集細(xì)胞沉淀于含20%新生牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，調(diào)整肝細(xì)胞濃度為
3.OX IO5個(gè) 5. OX IO5個(gè)/mL，制備成肝細(xì)胞懸液；(2)將肝細(xì)胞懸液接種于鋪有鼠尾膠原的培養(yǎng)板中，于37°C、5%C02環(huán)境中培養(yǎng)，4h 后除去死亡及懸浮細(xì)胞，將培養(yǎng)基更換成含細(xì)胞因子的維持培養(yǎng)基，細(xì)胞貼壁過(guò)夜后，得到長(zhǎng)爪沙鼠原代肝細(xì)胞。步驟(2)中，所述的含細(xì)胞因子的維持培養(yǎng)基為在DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10%新生牛血清、5 μ g/mL胰島素、4 μ g/mL地塞米松、10ng/mL表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、5ng/mL肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和2% 二甲基亞砜(DMS0);pH=7. 0-7. 4。含細(xì)胞因子的維持培養(yǎng)基的配制方法包括在DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入新生牛血清、胰島素、地塞米松、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和DMS0，混合均勻，調(diào)節(jié)pH=7. 0-7. 4，制得含細(xì)胞因子的維持培養(yǎng)基，其中，新生牛血清的濃度為10%，胰島素的濃度為5 μ g/mL，地塞米松的濃度為4 μ g/mL，表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度為10ng/mL，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度為5ng/mL，DMSO的濃度為2%。所述的含細(xì)胞因子的維持培養(yǎng)基的pH值優(yōu)選為7. 0-7. 2，進(jìn)一步優(yōu)選為pH=7. 0，更利于長(zhǎng)爪沙鼠原代肝細(xì)胞的成活。步驟(I)中，所述的過(guò)濾包括依次用100目和200目鋼篩過(guò)濾。100目鋼篩主要過(guò)濾肉眼可見(jiàn)的大的組織碎塊，200目鋼篩過(guò)濾微小碎塊。如果直接用200目鋼篩過(guò)濾，將導(dǎo)致大的組織碎塊堵塞篩孔，使細(xì)胞得率大大降低、過(guò)濾耗時(shí)延長(zhǎng)、增大了細(xì)胞受污染的可能性。步驟(I)中，所述的除雜包括18°C _28°C靜置后過(guò)濾。步驟(I)中，所述的反復(fù)離心洗漆優(yōu)選包括800rpm離心3min、600rpm離心3min、400rpm離心3min及400rpm離心3min,棄上清。rpm為轉(zhuǎn)/分鐘。步驟(I)中，調(diào)整肝細(xì)胞濃度優(yōu)選為4. O X IO5個(gè) 5. O X IO5個(gè)/mL。所述的消化成熟的離體長(zhǎng)爪沙鼠肝臟采用本領(lǐng)域現(xiàn)有方法得到，如膠原酶原位灌流法，一般可采用以下方法將長(zhǎng)爪沙鼠用速眠新麻醉，同時(shí)注射肝素鈉抗凝，用連接注射器的留置針行門靜脈插管，首先用無(wú)鈣灌流液開放灌流至肝臟呈土黃色或灰白色，接著用含鈣的O. 025%膠原酶液開放灌流，2min后夾閉下腔靜脈，繼續(xù)灌注含鈣膠原酶液至肝臟充盈，待肝臟消化成熟，柔軟、壓之留痕時(shí)開放下腔靜脈，分離得到肝臟。本發(fā)明DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，是一種含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基。一般在DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加血清、抗生素等中的一種或多種物質(zhì)后，得到DMEM完全培養(yǎng)基。本發(fā)明所用的試劑和培養(yǎng)基等均采用市售產(chǎn)品，%除特別說(shuō)明外，均指質(zhì)量百分比。本發(fā)明方法得到的長(zhǎng)爪沙鼠原代肝細(xì)胞變平變薄，核圓易見(jiàn)，逐漸呈島嶼狀。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下效果本發(fā)明的培養(yǎng)方法中，選用含20%新生牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基制備肝細(xì)胞懸液，并輔助使用經(jīng)過(guò)鼠尾膠原包被的培養(yǎng)板接種肝細(xì)胞，細(xì)胞貼壁效果更好，接種后4h即可形成單層緊密排列貼壁生長(zhǎng)；選用含細(xì)胞因子的維持培養(yǎng)基對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠原代肝細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)的肝細(xì)胞能夠保留許多長(zhǎng)爪沙鼠體內(nèi)肝細(xì)胞的細(xì)胞功能和活性，可用于探索肝臟疾病機(jī)理、篩選防治藥物等的研究。本發(fā)明的培養(yǎng)方法中，采用的試劑及培養(yǎng)基等均可市售得到，價(jià)格低廉，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，操作簡(jiǎn)便易行，獲得的肝細(xì)胞貼壁牢、活力高，培養(yǎng)細(xì)胞的成活率高，穩(wěn)定可靠，適于大規(guī)模生產(chǎn)。
圖I為新分離的長(zhǎng)爪沙鼠肝細(xì)胞200倍倒置 顯微鏡下觀察圖；圖2為實(shí)施例I中培養(yǎng)24h后的長(zhǎng)爪沙鼠肝細(xì)胞200倍倒置顯微鏡下觀察圖；圖3為實(shí)施例I中培養(yǎng)48h后的長(zhǎng)爪沙鼠肝細(xì)胞200倍倒置顯微鏡下觀察圖；圖4為實(shí)施例I中培養(yǎng)72h后的長(zhǎng)爪沙鼠肝細(xì)胞200倍倒置顯微鏡下觀察圖；圖5為實(shí)施例I中長(zhǎng)爪沙鼠肝細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)染色后200倍倒置顯微鏡下觀察圖；圖6為新分離的長(zhǎng)爪沙鼠肝細(xì)胞PAS染色后200倍倒置顯微鏡下觀察圖；圖7為實(shí)施例I中培養(yǎng)24h后的長(zhǎng)爪沙鼠肝細(xì)胞PAS染色后200倍倒置顯微鏡下觀察圖；圖8為實(shí)施例I中培養(yǎng)48h后的長(zhǎng)爪沙鼠肝細(xì)胞PAS染色后200倍倒置顯微鏡下觀察圖；圖9為實(shí)施例I中培養(yǎng)72h后的長(zhǎng)爪沙鼠肝細(xì)胞PAS染色后200倍倒置顯微鏡下觀察圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)，除非有另外說(shuō)明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體的制備實(shí)施例和應(yīng)用實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明，應(yīng)理解這些實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。本發(fā)明中所使用的百分濃度，除特別說(shuō)明外，均指質(zhì)量百分濃度。實(shí)施例I取禁食16h的長(zhǎng)爪沙鼠，以速眠新(lmL/kg)肌肉注射麻醉，腹腔注射O. ImL(12500IU/mL)肝素鈉抗凝，置解剖板上固定，胸腹部消毒開腹，靜脈留置針門靜脈插管固定，先用37°C水浴預(yù)熱的無(wú)鈣灌流液開放灌流至肝臟呈灰白色，灌流20ml。接著灌注鈣濃度為O. 025%含鈣的IV型膠原酶液，剛開始時(shí)緩慢開放灌注，2min后夾閉下腔靜脈，繼續(xù)灌注膠原酶液使肝臟充盈，待肝臟柔軟塌陷、壓之留痕后停止灌注。膠原酶消化總時(shí)間為8min,體積共IOml。分離肝臟，將肝臟置于含5%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，小心撕開肝包膜，輕輕抖落肝細(xì)胞，制備成肝細(xì)胞初懸液。肝細(xì)胞初懸液分別用100目、200目鋼篩過(guò)濾，濾液室溫下靜置15min使活細(xì)胞沉降，去除組織碎屑、死細(xì)胞，加入含5%小牛血清的 HBSS 離心洗漆 4 次，即800rpm 3min>600rpm 3min>400rpm 3min、400rpm3min,棄上清，向沉淀中加入含20%新生牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基(貼壁培養(yǎng)基)中，調(diào)整肝細(xì)胞濃度為5. O X IO5個(gè)/mL，制備成肝細(xì)胞懸液。將肝細(xì)胞懸液接種于預(yù)先鋪有鼠尾膠原的培養(yǎng)板，37°C、5%C02條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)4h細(xì)胞貼壁后去除死亡及未貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)基更換成含細(xì)胞因子的維持培養(yǎng)基，培養(yǎng)20h后細(xì)胞變平變薄，多呈雙核細(xì)胞，之后逐漸呈島嶼狀連接，形態(tài)良好。細(xì)胞分離純化臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算產(chǎn)量及活率，用倒置顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并用過(guò)碘酸-雪夫反應(yīng)(PAS)鑒定肝細(xì)胞。含細(xì)胞因子的維持培養(yǎng)基是在DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10%新生牛血清、5 μ g/mL胰島素、4 μ g/mL地塞米松、10ng/mL表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、5ng/mL肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、2%DMS0，pH 7. O。新分離的長(zhǎng)爪沙鼠肝細(xì)胞經(jīng)分離純化后置于倒置顯微鏡下觀察，鏡下可見(jiàn)活細(xì)胞呈光亮圓形，飽滿，透亮度好，見(jiàn)圖I。培養(yǎng)24h后可見(jiàn)細(xì)胞拉平變薄，體積增大，多呈雙核細(xì)胞，見(jiàn)圖2。培養(yǎng)48h后，細(xì)胞呈多邊形展開，幾個(gè)細(xì)胞聚集在一起，呈散落的島樣，見(jiàn)圖3。培養(yǎng)72h后，細(xì)胞展開程度增大，呈成片的島嶼狀連接，見(jiàn)圖4。新分離的長(zhǎng)爪沙鼠肝細(xì)胞做 臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)，活細(xì)胞透亮，死細(xì)胞呈明顯的藍(lán)色(顏色較深)，活率為95%，見(jiàn)圖5。PAS染色后，高倍鏡下觀察到新分離的長(zhǎng)爪沙鼠肝細(xì)胞由于含有大量的糖原顆粒而被染成紅色，見(jiàn)圖6。肝細(xì)胞培養(yǎng)24h (圖7)、48h (圖8)、72h (圖9)后，雖然細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，但PAS染色后胞漿均呈紅色或紫紅色，鑒定培養(yǎng)后的細(xì)胞仍為長(zhǎng)爪沙鼠肝細(xì)胞。實(shí)施例2取禁食16h的長(zhǎng)爪沙鼠，以速眠新(lmL/kg)肌肉注射麻醉，腹腔注射O. ImL(12500IU/mL)肝素鈉抗凝，置解剖板上固定，胸腹部消毒開腹，靜脈留置針門靜脈插管固定，先用37°C水浴預(yù)熱的無(wú)鈣灌流液開放灌流至肝臟呈灰白色，灌流20ml。接著灌注鈣濃度為O. 025%含鈣的IV型膠原酶液，剛開始時(shí)緩慢開放灌注，2min后夾閉下腔靜脈，繼續(xù)灌注膠原酶液使肝臟充盈，待肝臟柔軟塌陷、壓之留痕后停止灌注。膠原酶消化總時(shí)間為8min,體積共IOml。分離肝臟，將肝臟置于含5%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，小心撕開肝包膜，輕輕抖落肝細(xì)胞，制備成肝細(xì)胞初懸液。肝細(xì)胞初懸液分別用100目、200目鋼篩過(guò)濾，濾液室溫下靜置15min使活細(xì)胞沉降，去除組織碎屑、死細(xì)胞，加入含5%小牛血清的 HBSS,離心洗漆 4 次，即800rpm 3min、600rpm 3min、400rpm 3min、400rpm 3min,棄上清，向沉淀中加入含20%新生牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基(貼壁培養(yǎng)基)中，調(diào)整肝細(xì)胞濃度為3. OX IO5個(gè)/mL，制備成肝細(xì)胞懸液。將肝細(xì)胞懸液接種于預(yù)先鋪有鼠尾膠原的培養(yǎng)板，37°C、5%C02條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)4h細(xì)胞貼壁后去除死亡及未貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)基更換成含細(xì)胞因子的維持培養(yǎng)基，培養(yǎng)20h后細(xì)胞變平變薄，多呈雙核細(xì)胞，之后逐漸呈島嶼狀連接，形態(tài)良好。細(xì)胞分離純化臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算產(chǎn)量及活率，用倒置顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并用過(guò)碘酸-雪夫反應(yīng)(PAS)鑒定肝細(xì)胞。含細(xì)胞因子的維持培養(yǎng)基是在DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10%新生牛血清、5 μ g/mL胰島素、4 μ g/mL地塞米松、10ng/mL表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、5ng/mL肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、2%DMS0，pH 7. 4。新分離的長(zhǎng)爪沙鼠肝細(xì)胞經(jīng)分離純化后置于倒置顯微鏡下觀察，鏡下可見(jiàn)活細(xì)胞呈光亮圓形，飽滿，透亮度好。培養(yǎng)24h后可見(jiàn)細(xì)胞拉平變薄，體積增大，多呈雙核細(xì)胞。培養(yǎng)48h后，細(xì)胞呈多邊形展開，幾個(gè)細(xì)胞聚集在一起，呈散落的島樣。培養(yǎng)72h后，細(xì)胞展開程度增大，呈成片的島嶼狀連接。新分離的長(zhǎng)爪沙鼠肝細(xì)胞做臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)，活細(xì)胞透亮，死細(xì)胞呈明顯的藍(lán)色(顏色較深)，活率為90%。PAS染色后，高倍鏡下觀察到新分離的長(zhǎng)爪沙鼠肝細(xì)胞由于含有大量的糖原顆粒而被染成紅色。肝細(xì)胞培養(yǎng)24h、48h、72h后，雖然細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，但PAS染色后胞漿均呈紅色或紫紅色，鑒定培養(yǎng)后的細(xì)胞仍為長(zhǎng)爪沙鼠肝細(xì)胞。實(shí)施例3取禁食16h的長(zhǎng)爪沙鼠，以速眠新(lmL/kg)肌肉注射麻醉，腹腔注射O. ImL(12500IU/mL)肝素鈉抗凝，置解剖板上固定，胸腹部消毒開腹，靜脈留置針門靜脈插管固定，先用37°C水浴預(yù)熱的無(wú)鈣灌流液開放灌流至肝臟呈灰白色，灌流20ml。接著灌注鈣濃度為O. 025%含鈣的IV型膠原酶液，剛開始時(shí)緩慢開放灌注，2min后夾閉下腔靜脈，繼續(xù)灌注膠原酶液使肝臟充盈，待肝臟柔軟塌陷、壓之留痕后停止灌注。膠原酶消化總時(shí)間為8min,體積共IOml。分離肝臟，將肝臟置于含5%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，小心撕開肝包膜，輕輕抖落肝細(xì)胞，制備成肝細(xì)胞初懸液。肝細(xì)胞初懸液分別用100目、200 目鋼篩過(guò)濾，濾液室溫下靜置15min使活細(xì)胞沉降，去除組織碎屑、死細(xì)胞，加入含5%小牛血清的 HBSS,離心洗漆 4 次，即800rpm 3min、600rpm 3min、400rpm 3min、400rpm 3min,棄上清，向沉淀中加入含20%新生牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基(貼壁培養(yǎng)基)中，調(diào)整肝細(xì)胞濃度為4. OX IO5個(gè)/mL，制備成肝細(xì)胞懸液。將肝細(xì)胞懸液接種于預(yù)先鋪有鼠尾膠原的培養(yǎng)板，37°C、5%C02條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)4h細(xì)胞貼壁后去除死亡及未貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)基更換成含細(xì)胞因子的維持培養(yǎng)基，培養(yǎng)20h后細(xì)胞變平變薄，多呈雙核細(xì)胞，之后逐漸呈島嶼狀連接，形態(tài)良好。細(xì)胞分離純化臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算產(chǎn)量及活率，用倒置顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并用過(guò)碘酸-雪夫反應(yīng)(PAS)鑒定肝細(xì)胞。含細(xì)胞因子的維持培養(yǎng)基是在DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10%新生牛血清、5 μ g/mL胰島素、4 μ g/mL地塞米松、10ng/mL表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、5ng/mL肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、2%DMS0，pH 7. 2。新分離的長(zhǎng)爪沙鼠肝細(xì)胞經(jīng)分離純化后置于倒置顯微鏡下觀察，鏡下可見(jiàn)活細(xì)胞呈光亮圓形，飽滿，透亮度好。培養(yǎng)24h后可見(jiàn)細(xì)胞拉平變薄，體積增大，多呈雙核細(xì)胞。培養(yǎng)48h后，細(xì)胞呈多邊形展開，幾個(gè)細(xì)胞聚集在一起，呈散落的島樣。培養(yǎng)72h后，細(xì)胞展開程度增大，呈成片的島嶼狀連接。新分離的長(zhǎng)爪沙鼠肝細(xì)胞做臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)，活細(xì)胞透亮，死細(xì)胞呈明顯的藍(lán)色(顏色較深)，活率為93%。PAS染色后，高倍鏡下觀察到新分離的長(zhǎng)爪沙鼠肝細(xì)胞由于含有大量的糖原顆粒而被染成紅色。肝細(xì)胞培養(yǎng)24h、48h、72h后，雖然細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，但PAS染色后胞漿均呈紅色或紫紅色，鑒定培養(yǎng)后的細(xì)胞仍為長(zhǎng)爪沙鼠肝細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.一種長(zhǎng)爪沙鼠原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括步驟 (1)從消化成熟的離體長(zhǎng)爪沙鼠肝臟中收集肝細(xì)胞初懸液，過(guò)濾，濾液除雜后加入含5%小牛血清的HanV s平衡鹽溶液，反復(fù)離心洗滌，收集細(xì)胞沉淀于含20%新生牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，調(diào)整肝細(xì)胞濃度為3. O X IO5個(gè) 5. O X IO5個(gè)/mL，制備成肝細(xì)胞懸液； (2)將肝細(xì)胞懸液接種于鋪有鼠尾膠原的培養(yǎng)板中，于37°C、5%C02環(huán)境中培養(yǎng)，4h后除去死亡及懸浮細(xì)胞，將培養(yǎng)基更換成含細(xì)胞因子的維持培養(yǎng)基，細(xì)胞貼壁過(guò)夜后，得到長(zhǎng)爪沙鼠原代肝細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的長(zhǎng)爪沙鼠原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的含細(xì)胞因子的維持培養(yǎng)基為在DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10%新生牛血清、5 μ g/mL胰島素、4μ g/mL地塞米松、10ng/mL表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、5ng/mL肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和2% 二甲基亞砜；pH=7. 0-7. 4。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的長(zhǎng)爪沙鼠原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的含細(xì)胞因子的維持培養(yǎng)基pH=7. 0-7. 2。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的長(zhǎng)爪沙鼠原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的含細(xì)胞因子的維持培養(yǎng)基pH=7. O。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的長(zhǎng)爪沙鼠原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(I)中，所述的過(guò)濾包括依次用100目和200目鋼篩過(guò)濾。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的長(zhǎng)爪沙鼠原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(I)中，所述的除雜包括18°C _28°C靜置后過(guò)濾。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的長(zhǎng)爪沙鼠原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(I)中，所述的反復(fù)離心洗漆包括800rpm離心3min、600rpm離心3min、400rpm離心3min及400rpm離心3min,棄上清。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的長(zhǎng)爪沙鼠原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(I)中，調(diào)整肝細(xì)胞濃度為4. O X IO5個(gè) 5. O X IO5個(gè)/mL。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種長(zhǎng)爪沙鼠原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括(1)從消化成熟的離體長(zhǎng)爪沙鼠肝臟中收集肝細(xì)胞初懸液，過(guò)濾，濾液除雜后加入含5%小牛血清的HBSS，反復(fù)離心洗滌，收集細(xì)胞沉淀于含20%新生牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，調(diào)整肝細(xì)胞濃度為3.0×105個(gè)～5.0×105個(gè)/mL，制備成肝細(xì)胞懸液；(2)將肝細(xì)胞懸液接種于鋪有鼠尾膠原的培養(yǎng)板中，于37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，4h后除雜，將培養(yǎng)基更換成含細(xì)胞因子的維持培養(yǎng)基，細(xì)胞貼壁過(guò)夜后，得到長(zhǎng)爪沙鼠原代肝細(xì)胞。該方法價(jià)格低廉，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，操作簡(jiǎn)便易行，獲得的肝細(xì)胞貼壁牢、活力高，培養(yǎng)細(xì)胞的成活率高，穩(wěn)定可靠，適于大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N5/071GK102952776SQ20121043716
公開日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2012年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月5日
發(fā)明者陳立青, 郭紅剛, 李長(zhǎng)龍, 盧領(lǐng)群, 薩曉嬰, 戴方偉, 宋曉明 申請(qǐng)人:浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院