質(zhì)粒、重組工程菌及制備均一分子量透明質(zhì)酸的方法

質(zhì)粒、重組工程菌及制備均一分子量透明質(zhì)酸的方法
【專利摘要】一種基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】的質(zhì)粒、重組工程菌及制備均一分子量透明質(zhì)酸的方法，向革蘭氏陽性安全微生物中引入禽多殺性巴氏桿菌透明質(zhì)酸合成酶(Pasteurella?multocida?hyaluronan?synthase)基因(序列表中的SEQ?NO.1)組成的第一個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒和克隆自枯草芽孢桿菌與透明質(zhì)酸前體合成相關(guān)基因(序列表中的SEQ?NO.2、SEQ?NO.3、SEQ?NO.4、SEQ?NO.5)組成的第二個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒，通過由兩種重組表達(dá)質(zhì)粒組成的表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)分別對(duì)透明質(zhì)酸合成酶和透明質(zhì)酸前體合成相關(guān)酶的控制，以生物合成的方法制備獲得均一分子量透明質(zhì)酸。本發(fā)明不僅提高了宿主菌株合成透明質(zhì)酸的能力，而且能夠獲得幾種足量、純凈和均一分子量的透明質(zhì)酸。
【專利說明】質(zhì)粒、重組工程菌及制備均一分子量透明質(zhì)酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的是一種微生物的基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】的方法，具體是通過質(zhì)粒形式和基因組整合方式構(gòu)建的革蘭氏陽性安全微生物為安全工程菌株制備幾種均一分子量透明質(zhì)酸的生物合成方法。
【背景技術(shù)】
[0002]透明質(zhì)酸(HyaluronicAcid,Hyaluronan,HA)是由 β-D-葡萄糖醒酸(GlcUA)和β -D-N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)組成的雙糖單位反復(fù)交連而成的線性無分支大分子酸性粘多糖。天然透明質(zhì)酸平均分子量(MW)范圍是2X 104-7X 107Da。不同分子量的HA具有不同的生物功能:高分子量HA(HMW-HA，MW> 2X106)具有的高度粘彈性、可塑性、滲透性和良好的生物相容性，臨床上透明質(zhì)酸主要進(jìn)行膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射透明質(zhì)酸治療骨關(guān)節(jié)炎，既可以關(guān)節(jié)滑液中形成的粘彈性對(duì)關(guān)節(jié)軟骨起著減震和潤(rùn)滑等機(jī)械保護(hù)作用，又能夠與靶細(xì)胞的受體結(jié)合發(fā)揮對(duì)滑膜炎癥的抑制作用及對(duì)關(guān)節(jié)疼痛的緩解作用。由于其良好的黏彈性和假塑流變性，HA被廣泛用于眼科顯微手術(shù)、關(guān)節(jié)炎治療、組織工程、外科手術(shù)防粘連等領(lǐng)域。其中，麗在(I~2)X106的HA因具有良好的保濕性而用于滴眼液和化妝品等。低分子量撤仏麗-通，8父104>麗> IXlO4)近年來在載藥系統(tǒng)方面的應(yīng)用以及長(zhǎng)效、緩釋藥物的開發(fā)方面逐漸顯現(xiàn)出其特有的優(yōu)勢(shì)。例如，輕度修飾的HA衍生物能夠用于核苷酸胞內(nèi)遞呈和靶向性治療，高度修飾的HA衍生物則能夠共價(jià)連接多肽和蛋白質(zhì)，在其長(zhǎng)效藥物開發(fā)方面發(fā)揮重要作用，此外，通過各種物理和化學(xué)方式交聯(lián)而成的HA水凝膠用于各種藥物的遞呈和緩釋也逐漸成為研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)。寡聚HA(01igo-HA，麗< IXlO4)具有促血管生成、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等生物活性，其中4糖的透明質(zhì)酸片斷具有上調(diào)Hsp72表達(dá)、上調(diào)Fas表達(dá)、抑制細(xì)胞凋亡等活性；6糖的透明質(zhì)酸對(duì)樹突狀細(xì)胞中細(xì)胞因子的合成具有促進(jìn)作用；10個(gè)單糖單位的透明質(zhì)酸具有上調(diào)腫瘤細(xì)胞中PTEN水平的作用；8~32個(gè)單糖單位的透明質(zhì)·酸具有促血管內(nèi)皮細(xì)胞生成作用；10~40個(gè)單糖單位的透明質(zhì)酸具有促腫瘤細(xì)胞遷移作用。然而無論是高分子量的長(zhǎng)鏈多糖還是低分子量的寡聚片段，良好的均一度才是多糖行使其生物和物理化學(xué)功能的基礎(chǔ)。
[0003]傳統(tǒng)的制備透明質(zhì)酸的方法為從雞冠等動(dòng)物組織提取，盡管這種方法制備的透明質(zhì)酸早已批準(zhǔn)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，但是分離純化困難，得率較低和具有安全隱患的問題依然存在。目前制備透明質(zhì)酸這一重要粘多糖的另一種主要方法是利用A組和C組鏈球菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。這種方法雖然具有成本低，產(chǎn)量大的優(yōu)點(diǎn)，但是所得透明質(zhì)酸成分極其復(fù)雜(含雜蛋白、菌體雜質(zhì)及其他糖類物質(zhì)等)，分子量分布于IO4~IO7Da的范圍內(nèi)，均一度較差，并且由于鏈球菌為條件致病菌，此方法制備的透明質(zhì)酸同樣具有一定的安全隱患。而利用透明質(zhì)酸酶降解法制備均一透明質(zhì)酸也存在底物特異性差，降解產(chǎn)物過短不易純化的問題。局限于化學(xué)合成策略的不可行性和分離純化的難度及成本考慮，此類嘗試從未能成為實(shí)質(zhì)性解決方案?；瘜W(xué)酶合成法可以通過人工添加UDP-單糖體外催化合成均一分子量的透明質(zhì)酸片段，但是也存在著合成成本高，僅能合成寡聚透明質(zhì)酸，產(chǎn)量過小等問題。這些問題使此方法無法應(yīng)用于生產(chǎn)，并未從實(shí)質(zhì)上解決制備均一透明質(zhì)酸這一難題。
[0004]利用基因工程技術(shù)構(gòu)建重組工程菌生產(chǎn)透明質(zhì)酸近年來逐漸成為研究熱點(diǎn)。研究者們除了對(duì)鏈球菌屬各種野生菌株通過基因工程以及發(fā)酵工程的手段對(duì)其進(jìn)行改造，從而達(dá)到降低生產(chǎn)成本和提高透明質(zhì)酸產(chǎn)量的目的以外，更多的精力放在了尋找新型表達(dá)系統(tǒng)以克服鏈球菌屬具有致病性這一安全隱患。近年來，包括枯草桿菌，土壤桿菌，乳酸乳球菌以及大腸桿菌在內(nèi)的各種革蘭氏陰性菌和陽性菌被用于利用基因工程手段引入外源透明質(zhì)酸合成酶基因表達(dá)透明質(zhì)酸已經(jīng)陸續(xù)見諸報(bào)道。盡管在產(chǎn)量上和傳統(tǒng)的鏈球菌生產(chǎn)透明質(zhì)酸相比還有一定差距，但是這些有益的嘗試卻為體內(nèi)合成制備均一分子量透明質(zhì)酸提供了廣泛的選擇和新穎的思路。
[0005]經(jīng)過對(duì)現(xiàn)有技術(shù)信息的查閱檢索發(fā)現(xiàn)，B.Widner等(Widner, B., R.Behr, etal.(2005)." Hyaluronic Acid Production in Bacillus subtilis." Appl.Environ.Microbiol.71 (7):3747-3752.)中國(guó)專利文獻(xiàn)號(hào) CN101426925A，
【公開日】 2009-5-6，記載了一種“在芽孢桿菌細(xì)胞中生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法”，這些方法在枯草芽孢桿菌中成功表達(dá)從革蘭氏陽性的鏈鎖狀鏈球菌中得到的透明質(zhì)酸合成基因，重組工程菌通過搖瓶發(fā)酵獲得lg/L的透明質(zhì)酸。
[0006]上述現(xiàn)有技術(shù)的共性在于描述了以枯草芽孢桿菌為宿主，將合成透明質(zhì)酸相關(guān)的基因組合構(gòu)成一個(gè)人工操縱子，包括透明質(zhì)酸合成酶基因和透明質(zhì)酸前體合成相關(guān)基因在內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄均同步進(jìn)行，另外，透明質(zhì)酸的合成與宿主細(xì)胞的增殖也是同步進(jìn)行。盡管上述技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)透明質(zhì)酸在枯草芽孢桿菌中的異源合成，但是如果高效制備更加精細(xì)的透明質(zhì)酸，即均一分子量透明質(zhì)酸，并且通過人工調(diào)控獲取不同分子量的均一透明質(zhì)酸，現(xiàn)有技術(shù)還無法實(shí)現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種基于革蘭氏陽性安全微生物的幾種不同分子量均一透明質(zhì)酸的生物合成制備方法，該方法將透明質(zhì)酸合成酶基因和透明質(zhì)酸前體合成相關(guān)酶基因分別與可誘導(dǎo)啟動(dòng)子組成兩個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒，通過將透明質(zhì)酸前體合成、透明質(zhì)酸合成與宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)分開以及基于兩個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒分別調(diào)控的誘導(dǎo)表達(dá)策略，最終，不但大大提高了宿主細(xì)胞合成透明質(zhì)酸的能力，完成了透明質(zhì)酸在革蘭氏陽性安全微生物的異源合成，而且獲得了幾種不同分子量的均一度良好的透明質(zhì)酸。
[0008]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明包括以下步驟:
一種重組質(zhì)粒1，其特征在于核苷酸序列為Seq NO:6。
一種重組質(zhì)粒2，其特征在于核苷酸序列為Seq NO:7。
一種重組質(zhì)粒3，其特征在于核苷酸序列為Seq NO:8。
一種重組質(zhì)粒4，其特征在于核苷酸序列為Seq NO:9。
一種重組工程菌I，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒I和權(quán)利要求2所述的重組質(zhì)粒2。` 一種重組工程菌2，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒I和權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒3。
一種重組工程菌3，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒I和權(quán)利要求4所述的重組質(zhì)粒4。
一種重組工程菌I制備透明質(zhì)酸的方法，其特征在于按如下步驟實(shí)現(xiàn):
A、以總體積IOOmL含Ig氯化鈉，Ig蛋白胨,0.5g酵母抽提物的體系中按1% v/v接種重組工程菌I ;發(fā)酵液OD6tltol達(dá)到0.2時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度lmmol/L，發(fā)酵液OD6tltol達(dá)到0.2到0.4時(shí)加入誘導(dǎo)劑木糖至終濃度0.5% w/v,發(fā)酵終點(diǎn)為接種后培養(yǎng)48小時(shí)，從培養(yǎng)基中分離得到重均分子量為5.43MDa的透明質(zhì)酸；
B、以總體積IOOmL含Ig氯化鈉，Ig蛋白胨,0.5g酵母抽提物的體系中按1% v/v接種重組工程菌I進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵液OD6tltol達(dá)到0.2時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度lmmol/L，發(fā)酵液OD6tltlnm達(dá)到0.2到0.4時(shí)加入誘導(dǎo)劑木糖至終濃度0.5% w/v,發(fā)酵終點(diǎn)為接種后培養(yǎng)8小時(shí)；從培養(yǎng)基中分離得到重均分子量為4.55MDa的透明質(zhì)酸；
C、以總體積IOOmL含Ig氯化鈉，Ig蛋白胨,0.5g酵母抽提物的體系中按1% v/v接種重組工程菌I進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵液OD6tltol達(dá)到0.2時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度lmmol/L，發(fā)酵液OD6tltlnm達(dá)到1.0到1.2時(shí)加入誘導(dǎo)劑木糖至終濃度0.5% w/v,發(fā)酵終點(diǎn)為接種后培養(yǎng)48小時(shí)；從培養(yǎng)基中分離得到重均分子量為7.99KDa的透明質(zhì)酸。
所述的一種重組工程菌2制備透明質(zhì)酸的方法，其特征在于按如下步驟實(shí)現(xiàn):
以總體積IOOmL含Ig氯化鈉，Ig蛋白胨,0.5g酵母抽提物的體系中按1% v/v接種重組工程菌2進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵液OD6tltol達(dá)到0.2時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度lmmol/L，發(fā)酵液OD6tltol達(dá)到0.2到0.4時(shí)加入誘導(dǎo)劑木糖至終濃度0.5% w/v,發(fā)酵終點(diǎn)為接種后培養(yǎng)48小時(shí)，從培養(yǎng)基中分 離得到重均分子量為13.20KDa的透明質(zhì)酸。
所述的一種重組工程菌3制備透明質(zhì)酸的方法，其特征在于按如下步驟實(shí)現(xiàn):
以總體積IOOmL含Ig氯化鈉，Ig蛋白胨,0.5g酵母抽提物的體系中按1% v/v接種重組工程菌3進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵液OD6tltol達(dá)到0.2時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度lmmol/L，發(fā)酵液OD6tltol達(dá)到0.2到0.4時(shí)加入誘導(dǎo)劑木糖至終濃度0.5% w/v,發(fā)酵終點(diǎn)為接種后培養(yǎng)48小時(shí)；從培養(yǎng)基中分離得到重均分子量為4.53MDa的透明質(zhì)酸。
進(jìn)一步說明:
[0009]第一步、從禽多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida P_1059ATCC#15742)分離透明質(zhì)酸合成酶基因(Pasteurella multocida Hyaluronate synthase gene),即 SEQN0.1 ；
[0010]第二步、從革蘭氏陽性安全微生物宿主分離與透明質(zhì)酸前體，即UDP-葡萄糖醛酸和UDP-N-乙酰-葡萄糖氨的合成相關(guān)基因，包括:UDP-葡萄糖脫氫酶基因(UDP-Glucosedehydrogenase gene),即 SEQ N0.2 ;UDP_ 葡萄糖焦憐酸化酶基因(UDP-Glucosepyrophosphorylase gene),即 SEQ N0.3 ;乙酸轉(zhuǎn)移酶(Acetyltransferase)和 UDP-N-乙酰-葡萄糖氨焦磷酸化酶基因(UDP-GlcNAc pyrophosphorylase gene),即SEQ N0.4 ;葡萄糖 _6_ 憐酸變位酶基因(phosphoglucoisomerase gene), SEQ N0.5 ；
[0011]第三步、將SEQ N0.1與化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子組成第一個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒；將來自SEQN0.2到SEQ N0.5中的任何一個(gè)基因與另一個(gè)化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子組成第二個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒；
[0012]所述的化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子包括:枯草芽孢桿菌的木糖異構(gòu)酶基因的啟動(dòng)子和大腸桿菌的乳糖利用操縱子的啟動(dòng)子。
[0013]所述的化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄是指:所述的木糖異構(gòu)酶基因的啟動(dòng)子只有加入木糖后才可能啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄，木糖的質(zhì)量百分比濃度為0.5%到2% ;所述的乳糖利用操縱子的啟動(dòng)子只有加入IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)后才可能啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄，IPTG的摩爾濃度為25mmol/L到lmmol/L。
[0014]所述的透明質(zhì)酸合成的誘導(dǎo)劑是指:木糖、IPTG (異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)O
[0015]第四步、采用制備感受態(tài)細(xì)胞的方法將兩個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化革蘭氏陽性微生物宿主菌，用選擇標(biāo)記篩選，得到能分泌表達(dá)不同分子量均一透明質(zhì)酸的革蘭氏陽性基因工程安全菌株。
[0016]所述的選擇標(biāo)記是指:用來篩選含有透明質(zhì)酸合成相關(guān)基因的基因工程安全菌株的抗性基因，包括:紅霉素抗性基因，氯霉素抗性基因。
[0017]第五步、對(duì)革蘭氏陽性基因工程安全菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，在不同培養(yǎng)階段加入誘導(dǎo)透明質(zhì)酸前體合成的誘導(dǎo)劑和誘導(dǎo)透明質(zhì)酸合成的誘導(dǎo)劑以及設(shè)置不同發(fā)酵終點(diǎn)，借此控制透明質(zhì)酸在宿主菌體內(nèi)合成進(jìn)程以獲得不同分子量均一透明質(zhì)酸，發(fā)酵結(jié)束后即從培養(yǎng)基中分離純化得到基于基因工程安全菌株的不同分子量均一透明質(zhì)酸。
[0018]本發(fā)明所述的革蘭氏陽性安全微生物包括枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、短芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、短短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜淀粉擬桿菌、嗜熱脂肪地芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、嗜淀粉擬桿菌、納豆芽孢桿菌。
發(fā)明原理
[0019]代謝工程即利用重組DNA技術(shù)有目的地操縱細(xì)胞的酶、轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)控功能從而改善細(xì)胞的活性，從上世紀(jì)90年代初期發(fā)展至今已有20年歷史，對(duì)微生物發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展起到了極大的推動(dòng)作用。從廣義上講，一直以來對(duì)透明質(zhì)酸生產(chǎn)菌株的開發(fā)和改造均屬于代謝工程范疇。目前，代謝工程亟待解決的問題是發(fā)展新型的代謝工程改造策略以使微生物表達(dá)系統(tǒng)獲得合成精細(xì)化合物的能力，而解決這一難題的關(guān)鍵是了解代謝合成途徑中關(guān)鍵酶基因在代謝網(wǎng)絡(luò)中的位置和作用并通過設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)牟呗詫⒏鱾€(gè)元件整合串聯(lián)起來從而能夠合成具有特殊性質(zhì)和滿足特殊要求的精細(xì)化合物。這與制備均一分子量透明質(zhì)酸在擴(kuò)展和延伸透明質(zhì)酸研究和應(yīng)用方面的重要性不謀而合。
[0020]傳統(tǒng)的天然透明質(zhì)酸生產(chǎn)菌株，即A組和C組鏈球菌中，透明質(zhì)酸的合成需要以透明質(zhì)酸合成酶基因?yàn)楹诵牡囊幌盗谢虻膮⑴c，這些基因包括UDP-葡萄糖脫氫酶基因，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因，葡萄糖-6-磷酸變位酶基因，乙酰轉(zhuǎn)移酶利Μ)Ρ-Ν-乙酰-葡萄糖氨焦磷酸化酶基因，這些基因往往和透明質(zhì)酸合成酶基因組成-個(gè)表達(dá)基因簇，完成透明質(zhì)酸的合成。盡管這樣的天然透明質(zhì)酸表達(dá)系統(tǒng)能夠合成滿足鏈球菌自身需要的足量透明質(zhì)酸，但是應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐總卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足人類對(duì)透明質(zhì)酸的需要，并且由于其鏈球菌透明質(zhì)酸表達(dá)系統(tǒng)的天然同有特性，無法對(duì)其進(jìn)行人工調(diào)控，從而無法制備更為精細(xì)的不同分子量大小的均一分子量透明質(zhì)酸，經(jīng)鏈球菌發(fā)酵制備的透明質(zhì)酸分子量分布于1O4~1O7Da的范圍內(nèi)，均一度較差，并且無法通過人工調(diào)控制備特定分子量的透明質(zhì)酸，從而極大的限制了透明質(zhì)酸這一重要生物聚合物分子的研究和應(yīng)用。
[0021]近年來，研究者們將研究重點(diǎn)放在了利用基因工程方法對(duì)鏈球菌屬各種野生菌株進(jìn)行改造從而達(dá)到降低生產(chǎn)成本和提高透明質(zhì)酸產(chǎn)量的目的和發(fā)掘新型微生物表達(dá)系統(tǒng)以克服鏈球菌屬具有致病性這一安全隱患上。而在大量制備更為精細(xì)的不同分子量的均一透明質(zhì)酸方面卻鮮有嘗試。
[0022]為了增強(qiáng)透明質(zhì)酸在革蘭氏陽性安全微生物宿主細(xì)胞體內(nèi)的合成能力，并通過人工調(diào)節(jié)控制透明質(zhì)酸前體合成以及透明質(zhì)酸的合成，達(dá)到制備不同分子量均一度良好的透明質(zhì)酸的目的，本發(fā)明設(shè)計(jì)并構(gòu)建如下兩種重組質(zhì)粒，并制定相應(yīng)的表達(dá)策略，即將透明質(zhì)酸合成酶基因(SEQ N0.1)與木糖異構(gòu)酶基因的啟動(dòng)子組成第一個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒，將與透明質(zhì)酸前體合成相關(guān)酶基因(SEQ N0.2，SEQ N0.3 ;SEQ N0.4 ;SEQ N0.5)，即UDP-葡萄糖脫氫酶基因，Μ)Ρ-葡萄糖焦磷酸化酶基因，乙酰轉(zhuǎn)移酶和Μ)Ρ-Ν-乙酰-葡萄糖氨焦磷酸化酶基因，葡萄糖-6-磷酸變位酶基因，分別與乳糖利用操縱子的啟動(dòng)子組成第二個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒。透明質(zhì)酸前體合成相關(guān)酶基因按在透明質(zhì)酸合成過程中的功能分為以下三類:第一類，m)P-葡萄糖脫氫酶基因，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(SEQ N0.2，SEQ N0.3)負(fù)責(zé)透明質(zhì)酸合成所需兩種單糖原料之一的m)P-葡萄糖醛酸(UDP-GIcUA)在宿主細(xì)胞體內(nèi)的合成；第二類，乙酰轉(zhuǎn)移酶和UDP-N-乙酰-葡萄糖氨焦磷酸化酶基因(SEQ N0.4)負(fù)責(zé)透明質(zhì)酸合成所需兩種單糖原料之一的UDP-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)在宿主細(xì)胞體內(nèi)的合成；第三類，葡萄糖-6-磷酸變位酶基因(SEQ N0.5)負(fù)責(zé)透明質(zhì)酸合成所需兩種單糖原料的相互轉(zhuǎn)化，能夠調(diào)節(jié)兩種單糖原料的平衡。將兩種重組表達(dá)質(zhì)粒按功能進(jìn)行有序組合，轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞內(nèi)，獲得三株革蘭氏陽性安全表達(dá)菌株:第一個(gè)表達(dá)菌株含有透明質(zhì)酸合成酶基因(SEQ N0.1)與木糖異構(gòu)酶基因的啟動(dòng)子組成第一個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒，UDP-葡萄糖脫氫酶基因，Μ)Ρ-葡萄糖焦磷酸化酶基因(SEQ N0.2，SEQ N0.3)與乳糖利用操縱子的啟動(dòng)子組成第二個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒。第二個(gè)表達(dá)菌株含有透明質(zhì)酸合成酶基因(SEQ N0.1)與木糖異構(gòu)酶基因的啟動(dòng)子組成第一個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒，乙酰轉(zhuǎn)移酶和UDP-N-乙酰-葡萄糖氨焦磷酸化酶基因(SEQ N0.4)與乳糖利用操縱子的啟動(dòng)子組成第二個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒。第三個(gè)表達(dá)菌株含有透明質(zhì)酸合成酶基因(SEQ N0.1)與木糖異構(gòu)酶基因的啟動(dòng)子組成第一個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒，葡萄糖-6-磷酸變位酶基因(SEQ N0.5)與乳糖利用操縱子的啟動(dòng)子組成第二個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒。其中，第一個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒由于含有宿主細(xì)胞缺乏的透明質(zhì)酸合成酶基因，因而確保了透明質(zhì)酸能夠在宿主菌株體內(nèi)進(jìn)行異源合成；第二個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒由于含有透明質(zhì)酸前體合成相關(guān)酶基因，·因而能夠?yàn)橥该髻|(zhì)酸在宿主細(xì)胞體內(nèi)的合成提供活性單糖原料。此外，由于兩個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒分別使用不同的化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子，因而能夠人工控制透明質(zhì)酸前體的合成與透明質(zhì)酸的合成，這樣設(shè)計(jì)的目的在于首先將透明質(zhì)酸前體的合成與透明質(zhì)酸的合成這兩個(gè)具有時(shí)間先后順序的代謝過程彼此分開，并且將其與宿主細(xì)胞的增殖分開，從而避免了各個(gè)代謝過程之間因?yàn)樵虾湍茉锤?jìng)爭(zhēng)而導(dǎo)致的效率低下，增強(qiáng)了透明質(zhì)酸的異源合成能力；其次，在將透明質(zhì)酸前體的合成與透明質(zhì)酸的合成這兩個(gè)具有時(shí)間先后順序的代謝過程彼此分開的基礎(chǔ)上，通過對(duì)不同誘導(dǎo)啟動(dòng)子的使用，能夠在不同時(shí)間，不同水平的啟動(dòng)透明質(zhì)酸前體的合成，即使透明質(zhì)酸合成所需活性單糖原料在宿主細(xì)胞內(nèi)不同程度的積累，進(jìn)而相應(yīng)的啟動(dòng)透明質(zhì)酸的合成，從而達(dá)到合成不同分子量均一度良好的透明質(zhì)酸的目的。本發(fā)明通過這種特殊的雙重組表達(dá)質(zhì)粒的形式以及相應(yīng)的人工調(diào)控誘導(dǎo)表達(dá)策略，不但大大提高了宿主細(xì)胞合成透明質(zhì)酸的能力，完成了透明質(zhì)酸在革蘭氏陽性安全微生物的異源合成，而且獲得了幾種不同分子量的均一度良好的透明質(zhì)酸。
[0023]為了得到較穩(wěn)定的能夠合成不同分子量均一透明質(zhì)酸的基因工程革蘭氏陽性安全微生物工程菌株，本發(fā)明將第一個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒定點(diǎn)整合到革蘭氏陽性安全微生物宿主基因組，整合位點(diǎn)IacA選擇為革蘭氏陽性安全微生物基因組上能夠接納外源表達(dá)元件而不會(huì)使宿主菌本身生長(zhǎng)和初級(jí)代謝受到影響的位置；第二個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒選擇為附加型嚴(yán)謹(jǐn)表達(dá)載體，選擇低拷貝的嚴(yán)謹(jǐn)型表達(dá)載體能夠克服革蘭氏陽性安全微生物中載體丟失的問題，增加外源表達(dá)元件的穩(wěn)定性。
有益效果:
[0024]經(jīng)攜帶兩種質(zhì)粒工程菌株發(fā)酵所得的不同分子量均一透明質(zhì)酸由D-葡萄糖醛酸與N-乙酰-葡萄糖氨組成的雙糖單位反復(fù)交替連接而成的線性無分支大分子酸性粘多糖，所得到的幾種均一透明質(zhì)酸重均分子量(Mw)分別為4.55MDa7.99KDal3.20KDa5.43MDa4.53MDa，分散度分別為 1.351.171.681.141.13。
[0024]重均分子量為5.43MDa4.55MDa7.99KDa的透明質(zhì)酸由第一個(gè)表達(dá)菌株，即含有透明質(zhì)酸合成酶基因(SEQ N0.1)和UDP-葡萄糖脫氫酶基因，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(SEQ N0.2，SEQ N0.3)通過不同條件生物合成獲得，三種分子量透明質(zhì)酸生物合成條件分別為:5.43MDa，發(fā)酵液OD6tltlnm達(dá)到0.2時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度lmmol/L，發(fā)酵液OD600nm達(dá)到0.2到0.4時(shí)加入誘導(dǎo)劑木糖至終濃度0.5% (w/v)，發(fā)酵終點(diǎn)為接種后培養(yǎng)48小時(shí)；4.55MDa，發(fā)酵液OD6tltol達(dá)到0.2時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度lmmol/L，發(fā)酵液OD6tltol達(dá)到0.2到0.4時(shí)加入誘導(dǎo)劑木糖至終濃度0.5% (w/v)，發(fā)酵終點(diǎn)為接種后培養(yǎng)8小時(shí)；
7.99KDa,發(fā)酵液OD6tltlnm達(dá)到0.2時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度lmmol/L，發(fā)酵液OD6tltol達(dá)到
1.0到1.2時(shí)加入誘導(dǎo)劑木糖至終濃度0.5% (w/v)，發(fā)酵終點(diǎn)為接種后培養(yǎng)48小時(shí)。
[0025]重均分子量為13.20 KDa的透明質(zhì)酸由第二個(gè)表達(dá)菌株，即含有透明質(zhì)酸合成酶基因(SEQ N0.1)和乙酰轉(zhuǎn)移酶和UDP-N-乙酰-葡萄糖氨焦磷酸化酶基因(SEQ N0.4)通過生物合成獲得，生物合成條件為:發(fā)酵液OD6tltlnm達(dá)到0.2時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度lmmol/L,發(fā)酵液OD6tltlnm達(dá)到0.2到0.4時(shí)加入誘導(dǎo)劑木糖至終濃度0.5% (w/v)，發(fā)酵終點(diǎn)為接種后培養(yǎng)48小時(shí)。
[0025]重均分子量為4.53MDa的透明質(zhì)酸由第三個(gè)表達(dá)菌株，即含有透明質(zhì)酸合成酶基因(SEQ N0.1)和葡萄糖-6-磷酸變位酶基因(SEQ N0.5)通過生物合成獲得，生物合成條件為:發(fā)酵液OD6tltol達(dá)到0.2時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度lmmol/L，發(fā)酵液OD6tltol達(dá)到
0.2到0.4時(shí)加入誘導(dǎo)劑木糖至終濃度0.5% (w/v)，發(fā)酵終點(diǎn)為接種后培養(yǎng)48小時(shí)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為第一個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒(SEQ N0.6)的構(gòu)建，即含有來自禽多殺性巴氏桿菌的透明質(zhì)酸合成酶基因與木糖誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的基因組整合型表達(dá)載體。
[0026]圖中:
[0027]IacA與lacA’分別表不beta-galactosidase基因的5’和3’端同源整合臂；erm表不紅霉素抗性基因
[0028]PmHAS表示禽多殺性巴氏桿菌透明質(zhì)酸合成酶基因；
[0029]PxylA表示來自枯草芽孢桿菌的木糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子；
[0030]bla表示氨芐青霉素抗性基因；
[0031 ] ori表示在大腸桿菌中復(fù)制起始DNA序列。[0032]圖2為第二個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒(SEQ N0.7)的構(gòu)建，即含有來自枯草芽孢桿菌Μ)Ρ_葡萄糖脫氫酶基因、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因和乳糖利用操縱子的啟動(dòng)子的附加型嚴(yán)謹(jǐn)表達(dá)載體。
[0033]圖中:
[0034]tuaD表示枯草芽孢桿菌UDP-葡萄糖脫氫酶基因；gtaB表示枯草芽孢桿菌UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因；
[0035]cat表不氣霉素抗性基因；
[0036]Pspac和IacI表示IPTG誘導(dǎo)的乳糖利用操縱子的啟動(dòng)子及其調(diào)控元件；
[0037]bla表示氨芐青霉素抗性基因；
[0038]rep表示來在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行theta復(fù)制的復(fù)制起始蛋白基因。
[0039]圖3為第三個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒(SEQ N0.8)的構(gòu)建，即含有來自枯草芽孢桿菌乙酰轉(zhuǎn)移酶和UDP-N-乙酰-葡萄糖氨焦磷酸化酶基因和乳糖利用操縱子的啟動(dòng)子的附加型嚴(yán)謹(jǐn)表達(dá)載體。
[0040]圖中:
[0041]gcaD表示枯草芽孢桿菌乙酰轉(zhuǎn)移酶和UDP-N-乙酰-葡萄糖氨焦磷酸化酶基因；
[0042]cat表不氣霉素抗性基因；
[0043]Pspac和IacI表示IPTG誘導(dǎo)的乳糖利用操縱子的啟動(dòng)子及其調(diào)控元件；
[0044]bla表示氨芐青霉素抗性基因；
[0045]rep表示來在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行theta復(fù)制的復(fù)制起始蛋白基因。
[0046]圖4為第四個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒(SEQ N0.9)的構(gòu)建，即含有來自枯草芽孢桿菌葡萄糖-6-磷酸變位酶基因和乳糖利用操縱子的啟動(dòng)子的附加型嚴(yán)謹(jǐn)表達(dá)載體。
[0047]圖中:
[0048]pgi表示來自枯草芽孢桿菌葡萄糖-6-磷酸變位酶基因；
[0049]cat表不氣霉素抗性基因；
[0050]Pspac和IacI表示IPTG誘導(dǎo)的乳糖利用操縱子的啟動(dòng)子及其調(diào)控元件；
[0051] bla表示氨芐青霉素抗性基因；
[0052]rep表示來在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行theta復(fù)制的復(fù)制起始蛋白基因。
[0053]圖5為實(shí)施例5中樣品紅外光譜鑒定圖譜。
[0054]圖6為實(shí)施例7中樣品高效液相色譜圖。
[0055]圖中:
[0056]圖6A為表1中N0.1樣品高效液相色譜圖
[0057]圖6B為表1中N0.2樣品高效液相色譜圖
圖6C為表1中N0.3樣品高效液相色譜圖
圖6D為表1中N0.4樣品高效液相色譜圖
圖6E為表1中N0.5樣品高效液相色譜圖
【具體實(shí)施方式】
下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。以下實(shí)施例中禽多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida P_1059ATCC#15742)來源于國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis subsp.subtilisl68BGSCID#lAl)來源于美國(guó)俄亥俄州州立大學(xué)桿狀菌遺傳庫存中心(BacillusGenetic Stock Center, The Ohio State University), pAXOl (BGSCID#ECE137)來源于美國(guó)俄亥俄州州立大學(xué)桿狀菌遺傳庫存中心(Bacillus Genetic Stock Center, The OhioState University)，原始質(zhì)粒 SEQ N0.10, pHCMCO5 構(gòu)建參考文獻(xiàn)(Nguyen, H.D.，Nguyen,Q.A., Ferreira, R.C., Ferreira, L.C.S., Tran, L.T., Schumann, ff., 2005.Constructionof plasmid-based expression vectors for Bacillus subtilis exhibiting fullstructural stability.Plasmid.54, 241-248.)原始質(zhì)粒 SEQ N0.11。
[0144] 各實(shí)施例中所用細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)于天根(北京)生化有限公司，限制性內(nèi)切酶和T載體連接試劑盒(pMD?18_T Simple Vector)購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，聚苯乙烯硫酸酯鈉鹽對(duì)照品購(gòu)于北京龍智達(dá)公司，凝膠柱Shodex SB-806HQ購(gòu)于昭和電工(東京)株式會(huì)社，其他試劑均為分析純，購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司。 [0058]實(shí)施例1:透明質(zhì)酸合成酶基因的克隆和整合表達(dá)載體的構(gòu)建
[0059](I)禽多殺性巴氏桿菌透明質(zhì)酸合成酶基因(Pasteurella multocidaHyaluronate synthase gene)的克隆
[0060]使用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取禽多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida P-1059ATCC#15742)基因組DNA，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以提取的禽多殺性巴氏桿菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，具體反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5分鐘，再按照94°C I分鐘、48°C I分鐘、72°C2分鐘30秒進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后按72°C延伸8分鐘的程序進(jìn)行。設(shè)計(jì)的一對(duì)引物序列如下:
[0061]5’-CGACTAGTATGAATACATTATCACAAGCAATAAAAGC-3’(5，端帶有 Spe I 酶切位點(diǎn)，ACTAGT)，引物 SEQ N0.12。
[0062]5’ -CGGGATCCCTAAATATCTTTTAAGATATCAATCT-3’ (5'端帶有 BamH I 酶切位點(diǎn)，GGATCC)，引物 SEQN0.13。
[0063]按照上面的方法擴(kuò)增出的禽多殺性巴氏桿菌透明質(zhì)酸合成酶基因大小為2109bp，即 SEQ N0.1。
[0064](2)含有禽多殺性巴氏桿菌透明質(zhì)酸合成酶基因的整合表達(dá)載體的構(gòu)建
[0065]將經(jīng)連接T載體(連接使用T載體連接試劑盒pMD? 18-T Simple Vector)后測(cè)序正確的禽多殺性巴氏桿菌透明質(zhì)酸合成酶基因用Spe I和BamH I雙酶切后進(jìn)行膠回收，連接至用Spe I和BamH I雙酶切的整合型表達(dá)載體pAXOl中，構(gòu)成含有禽多殺性巴氏桿菌透明質(zhì)酸合成酶基因的整合表達(dá)載體pAXO1-PmHAS (圖譜如圖1)，即重組質(zhì)粒1，其核苷酸序列為SEQ N0.6。該載體含有透明質(zhì)酸合成酶基因和可誘導(dǎo)的木糖異構(gòu)酶基因的啟動(dòng)子。
[0066]實(shí)施例2:透明質(zhì)酸前體合成相關(guān)酶基因的克隆和附加型嚴(yán)謹(jǐn)表達(dá)載體的構(gòu)建
[0067](I)來自枯草芽孢桿菌UDP-葡萄糖脫氫酶基因(UDP-Glucose dehydrogenasegene)的克隆
[0068]使用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilissubsp.subtilisl68)基因組DNA，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以提取的枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，具體反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5分鐘，再按照94°C I分鐘、48°C I分鐘、72°C I分鐘30秒進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后按72°C延伸8分鐘的程序進(jìn)行。設(shè)計(jì)的一對(duì)引物序列如下:
[0069]5’-CGGGATCCGGAGAGGGTTGAGCGCTGTGAA-3’(5，端帶有 BamH I 酶切位點(diǎn)，GGATCC)，引物 SEQN0.14。
[0070]5’-GCTCTAGATTATAAATTGACGCTTCCCAAGTCTTTAG-3’(5，端帶有 Xba I 酶切位點(diǎn)，TCTAGA)，引物 SEQ N0.15。
[0071]按照上面的方法擴(kuò)增出的來自枯草芽孢桿菌UDP-葡萄糖脫氫酶基因大小為1403bp,即 SEQ N0.2
[0072](2)來自枯草芽孢桿菌UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(UDP-Glucosepyrophosphorylase gene)的克隆
[0073]使用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilissubsp.subtilisl68)基因組DNA，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以提取的枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，具體反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5分鐘，再按照94°C I分鐘、48°C I分鐘、72°C I分鐘進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后按72°C延伸8分鐘的程序進(jìn)行。設(shè)計(jì)的一對(duì)引物序列如下:
[0074]5’ -GCTCTAGAGGAAGGTGCCTITTAAATGAA-3’(5，端帶有 Xba I 酶切位點(diǎn)，TCTAGA)，引物 SEQN0.16。
[0075]5’ -CCCCCGGGTTAGAITTCTTCTTTGTTTAGTAAACC-3’(5，端帶有 Xma I 酶切位點(diǎn)，CCCGGG)，引物 SEQ N0.17。
[0076]按照上面的方法擴(kuò)增出的來自枯草芽孢桿菌UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因大小為895bp,即 SEQ N0.3
[0077](3)含有來自枯草芽孢桿菌UDP-葡萄糖脫氫酶基因和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的附加型嚴(yán)謹(jǐn)表達(dá)載體的構(gòu)建
[0078]將經(jīng)連接T載體(連接使用T載體連接試劑盒pMD? 18-T Simple Vector)后測(cè)序正確的枯草芽孢桿菌Μ)Ρ-葡萄糖脫氫酶基因用BamH I和Xba I雙酶切后進(jìn)行膠回收，連接至用BamH I和Xba I雙酶切的附加型嚴(yán)謹(jǐn)表達(dá)載體pHCMC05中，構(gòu)成含有枯草芽孢桿菌UDP-葡萄糖脫氫酶基因的附加型嚴(yán)謹(jǐn)表達(dá)載體pHCMC05-tuaD，然后用Xba I利Xma I雙酶切pHCMC05-tuaD，膠回收得到載體片段DNA。將經(jīng)連接T載體(連接使用T載體連接試劑盒pMD?18_T Simple Vector)后測(cè)序正確的來自枯草芽孢桿菌UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因用Xba I和Xma I雙酶切，與用Xba I和Xma I雙酶切的載體pHCMC05_tuaD連接，得到新的附加型嚴(yán)謹(jǐn)表達(dá)載體pHCMC05-tuaD-gtaB(圖譜如圖2)，即重組質(zhì)粒2，其核苷酸序列為SEQ N0.7。該載體含有來自枯草芽孢桿菌UDP-葡萄糖脫氫酶基因和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因和可誘導(dǎo)的乳糖利用操縱子的啟動(dòng)子。[0079](4)來自枯草芽孢桿菌乙酰轉(zhuǎn)移酶(Acetyltransferase)和UDP-N-乙酰-葡萄糖氨焦憐酸化酶基因(UDP-GIcNAc pyrophosphorylase gene)的克隆
[0080]使用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilissubsp.subtilisl68)基因組DNA，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以提取的枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，具體反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5分鐘，再按照94°C I分鐘、48°C I分鐘、72°C I分鐘30秒進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后按72°C延伸8分鐘的程序進(jìn)行。設(shè)計(jì)的一對(duì)引物序列如下:
[0081]5’-CGGGATCCATGGATAAGCGGITTGCAGTTGT-3’(5，端帶有 BamH I 酶切位點(diǎn)，GGATCC)，引物 SEQN0.18。
[0082]5’-GCTCTAGATTATTTTTTATGAATATTTTTCACA-3’ (5，端帶有 Xba I 酶切位點(diǎn)，TCTAGA)，引物 SEQN0.19。
[0083]按照上面的方法擴(kuò)增出的來自枯草芽孢桿菌UDP-葡萄糖脫氫酶基因大小為1371bp,即 SEQ N0.4
[0084](5)含有來自枯草芽孢桿菌乙酰轉(zhuǎn)移酶和UDP-N-乙酰-葡萄糖氨焦磷酸化酶基因的附加型嚴(yán)謹(jǐn)表達(dá)載體的構(gòu)建
[0085]將經(jīng)連接T載體(連接使用T載體連接試劑盒pMD? 18-T Simple Vector)后測(cè)序正確的枯草芽孢桿菌Μ)Ρ-葡萄糖脫氫酶基因用BamH I和Xba I雙酶切后進(jìn)行膠回收，連接至用BamH I和Xba I雙酶切的附加型嚴(yán)謹(jǐn)表達(dá)載體pHCMC05中，構(gòu)成含有枯草芽孢桿菌乙酰轉(zhuǎn)移酶和UDP-N-乙酰-葡萄糖氨焦磷酸化酶基因的附加型嚴(yán)謹(jǐn)表達(dá)載體pHCMC05-gcaD(圖譜如圖3)，即重組質(zhì)粒3，其核苷酸序列為SEQ N0.8。該載體含有來自枯草芽孢桿菌乙酰轉(zhuǎn)移酶和UDP-N-乙酰-葡萄糖氨焦磷酸化酶基因和可誘導(dǎo)的乳糖利用操縱子的啟動(dòng)子。
[0086](6)來自枯草芽孢桿菌葡萄糖-6-磷酸變位酶基因(phosphoglucoisomerasegene)的克隆
[0087]使用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilissubsp.subtilisl68)基因組DNA，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以提取的枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，具體反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5分鐘，再按照94°C I分鐘、48°C I分鐘、72°C I分鐘30秒進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后按72°C延伸8分鐘的程序進(jìn)行。設(shè)計(jì)的一對(duì)引物序列如下:
[0088]5’ -TAGGATCCATGACGCATGTACGCTTTGA-3’(5，端帶有 BamH I 酶切位點(diǎn)，GGATCC)，弓丨物 SEQN0.20。`
[0089]5’-GCTCTAGATTAATCTTCCAGACGTTT-3’(5，端帶有 Xba I 酶切位點(diǎn)，TCTAGA)，引物SEQ N0.21。
[0090]按照上面的方法擴(kuò)增出的來自枯草芽孢桿菌葡萄糖-6-磷酸變位酶基因大小為1353bp,即 SEQ N0.5
[0091](7)含有來自枯草芽孢桿菌葡萄糖-6-磷酸變位酶基因的附加型嚴(yán)謹(jǐn)表達(dá)載體的構(gòu)建
[0092]將經(jīng)連接T載體(連接使用T載體連接試劑盒pMD? 18-T Simple Vector)后測(cè)序正確的枯草芽孢桿菌葡萄糖-6-磷酸變位酶基因用BamH I和Xba I雙酶切后進(jìn)行膠回收，連接至用BamH I和Xba I雙酶切的附加型嚴(yán)謹(jǐn)表達(dá)載體pHCMC05中，構(gòu)成含有枯草芽孢桿菌乙酰轉(zhuǎn)移酶和UDP-N-乙酰-葡萄糖氨焦磷酸化酶基因的附加型嚴(yán)謹(jǐn)表達(dá)載體pHCMC05-pgi (圖譜如圖4)，即重組質(zhì)粒4，其核苷酸序列為SEQ N0.9。該載體含有來自枯草芽孢桿菌葡萄糖-6-磷酸變位酶基因和可誘導(dǎo)的乳糖利用操縱子的啟動(dòng)子。
[0093]實(shí)施例3:將實(shí)施例1和2構(gòu)建的各個(gè)表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌宿主細(xì)胞中，獲得重組工程菌株，并通過其發(fā)酵制備幾種不同分子量的均一透明質(zhì)酸。
[0094]本項(xiàng)實(shí)施例描述通過制備感受態(tài)的方法將實(shí)施例1和2構(gòu)建的各個(gè)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌宿主細(xì)胞中，獲得重組工程菌株，并通過其發(fā)酵制備幾種不同分子量的均一透明質(zhì)酸。[0095](I)將構(gòu)建的整合型表達(dá)載體pAXOl-PmHAS轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌細(xì)胞中，獲得重組工程菌株 B.subtilis (pAXO1-PmHAS)。
[0096]按照以下方法制備枯草芽孢桿菌的感受態(tài):將枯草芽孢桿菌在LB平板上劃線得到單菌落，再將單菌落接種到3mL液體LB培養(yǎng)基中在37°C振蕩培養(yǎng)過夜，取160 μ L培養(yǎng)液接種到8mLSP I培養(yǎng)基中，370C，220r/min培養(yǎng)4到5小時(shí)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。取200 μ L培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP I培養(yǎng)液接種至2mLSPII培養(yǎng)基中，37°C，100r/min培養(yǎng)90分鐘。在上述SPII培養(yǎng)基的菌體中加入20μ L10mmol/L EGTA，再于37°C，100r/min培養(yǎng)10分鐘。將上述處理后的菌液分裝成500 μ L每管，加入5 μ L質(zhì)粒載體pAXO 1-PmHAS (I μ g/ μ L)，再于37°C,220r/min培養(yǎng)90分鐘，取菌液涂布含有5 μ g/mL紅霉素的LB平板，37°C培養(yǎng)48小時(shí)，得到單菌落。挑取單菌落提取基因組DNA，以克隆基因設(shè)計(jì)的引物(SEQN0.:12和13)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。得到大小為2100bp的DNA條帶，與禽多殺性巴氏桿菌透明質(zhì)酸合成酶基因?qū)嶋H大小一致。
[0097]感受態(tài)制備所需溶液的配制方法為:
[0098]SP-A鹽溶液:秤取2g硫酸銨，14g三水合磷酸氫二鉀，6g磷酸二氫鉀，Ig檸檬酸鈉加蒸懼水定容至500mL, 121°C滅菌20分鐘。
[0099]SP-B鹽溶液:秤取0.2g七水合硫酸鎂加蒸餾水定容至500mL，121°C滅菌20分鐘。
[0100]100X CAYE溶液:2g酪蛋白水解物，IOg酵母抽提物加蒸餾水定容至lOOmL，121°C滅菌20分鐘。
[0101]SP I培養(yǎng)基(20mL):量取9.8mL SP-A鹽溶液，9.8mL SP-B鹽溶液，200 μ L葡萄糖溶液(50% w/vll5°C滅菌 20 分鐘)，200μ L100X CAYE 溶液。
[0102]SPII培養(yǎng)基(6mL):·量取5.88mL SP I培養(yǎng)基，60 μ L50mmol/L氯化鈣溶液，60 μ L250mmol/L氯化鎂溶液。
[0103]100X EGTA溶液:10mmol/L EGTA溶液，溶解時(shí)加入少量氫氧化鈉至pH8.0。
[0104](2)將構(gòu)建的附加型嚴(yán)謹(jǐn)表達(dá)載體pHCMC05-tuaD_gtaB轉(zhuǎn)化到整合有PmHAS枯草芽孢桿菌細(xì)胞中，獲得重組工程菌株B.subtilis (pAX01-PmHAS/pHCMC05-tuaD-gtaB)。
[0105]按照以下方法制備整合有PmHAS枯草芽孢桿菌的感受態(tài):將整合有PmHAS枯草芽孢桿菌在含有5 μ g/mL紅霉素的LB平板上劃線得到單菌落，再將單菌落接種到3mL液體LB培養(yǎng)基中在37 °C振蕩培養(yǎng)過夜，取160 μ L培養(yǎng)液接種到8mLSP I培養(yǎng)基中，37 °C，220r/min培養(yǎng)4到5小時(shí)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。取200 μ L培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP I培養(yǎng)液接種至2mLSPII培養(yǎng)基中，37°C，100r/min培養(yǎng)90分鐘。在上述SPII培養(yǎng)基的菌體中加入20 μ LlOmmol/L EGTA，再于37°C，100r/min培養(yǎng)10分鐘。將上述處理后的菌液分裝成500 μ L每管，加入5 μ L 質(zhì)粒載體 pHCMC05-tuaD-gtaB (I μ g/ μ L)，再于 37°C，220r/min 培養(yǎng) 90 分鐘，取菌液涂布含有5 μ g/mL紅霉素和5 μ g/mL氯霉素的LB平板，37°C培養(yǎng)48小時(shí)，得到單菌落。挑取單菌落提取附加型質(zhì)粒載體DNA，以克隆基因設(shè)計(jì)的引物(SEQ N0.:14、15、16、17)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。得到大小為1400bp和900bp的DNA條帶，與來自枯草芽孢桿菌UDP-葡萄糖脫氫酶基因和TOP-葡萄糖焦磷酸化酶基因?qū)嶋H大小一致。
[0106](3)將構(gòu)建的附加型嚴(yán)謹(jǐn)表達(dá)載體pHCMC05-gcaD轉(zhuǎn)化到整合有PmHAS枯草芽孢桿菌細(xì)胞中獲得重組工程菌株 B.subtilis (pAX01-PmHAS/pHCMC05-gcaD)。
[0107]按照以下方法制備整合有PmHAS枯草芽孢桿菌的感受態(tài):將整合有PmHAS枯草芽孢桿菌在含有5 μ g/mL紅霉素的LB平板上劃線得到單菌落，再將單菌落接種到3mL液體LB培養(yǎng)基中在37°C振蕩培養(yǎng)過夜，取160 μ L培養(yǎng)液接種到8mLSP I培養(yǎng)基中，37°C，220r/min培養(yǎng)4到5小時(shí)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。取200 μ L培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP I培養(yǎng)液接種至2mLSPII培養(yǎng)基中，37°C，100r/min培養(yǎng)90分鐘。在上述SPII培養(yǎng)基的菌體中加入20 μ LlOmmol/L EGTA，再于37°C，100r/min培養(yǎng)10分鐘。將上述處理后的菌液分裝成500 μ L每管，加入5 μ L質(zhì)粒載體pHCMC05-gcaD (I μ g/ μ L)，再于37°C，220r/min培養(yǎng)90分鐘，取菌液涂布含有5 μ g/mL紅霉素和5 μ g/mL氯霉素的LB平板，37°C培養(yǎng)48小時(shí)，得到單菌落。挑取單菌落提取附加型質(zhì)粒載體DNA，以克隆基因設(shè)計(jì)的引物(SEQ N0.:18和19)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。得到大小為1400bp的DNA條帶，與來自枯草芽孢桿菌乙酰轉(zhuǎn)移酶和UDP-N-乙酰-葡萄糖氨焦磷酸化酶基因?qū)嶋H大小一致。
[0108](4)將構(gòu)建的附加型嚴(yán)謹(jǐn)表達(dá)載體pHCMC05-pgi轉(zhuǎn)化到整合有PmHAS枯草芽孢桿菌細(xì)胞中，獲得重組工程菌株 B.subtilis (pAX01-PmHAS/pHCMC05-pgi)。
[0109]按照以下方法制備整合有PmHAS枯草芽孢桿菌的感受態(tài):將整合有PmHAS枯草芽孢桿菌在含有5 μ g/mL紅霉素的LB平板上劃線得到單菌落，再將單菌落接種到3mL液體LB培養(yǎng)基中在37 °C振蕩培養(yǎng)過夜，取160 μ L培養(yǎng)液接種到8mLSP I培養(yǎng)基中，37 °C，220r/min培養(yǎng)4到5小時(shí)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。取200 μ L培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP I培養(yǎng)液接種至2mLSPII培養(yǎng)基中，37°C，100r/min培養(yǎng)90分鐘。在上述SPII培養(yǎng)基的菌體中加入20 μ LlOmmol/L EGTA，再于37°C，100r/min培養(yǎng)10分鐘。將上述處理后的菌液分裝成500 μ L每管，加入5 μ L質(zhì)粒載體pHCMC05-pgi (lg/ μ L)，再于37°C，220r/min培養(yǎng)90分鐘，取菌液涂布含有5 μ g/mL紅霉素和5 μ g/mL氯霉素的LB平板，37°C培養(yǎng)48小時(shí)，得到單菌落。挑取單菌落提取附加型質(zhì)粒載體DNA，以克隆基因設(shè)計(jì)的引物(SEQ N0.:20和21)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。得到大小為1400bp的DN A條帶，與來自枯草芽孢桿菌葡萄糖-6-磷酸變位酶基因?qū)嶋H大小一致。
[0110](5)利用重組工程菌株 B.subtilis (pAX01-PmHAS/pHCMC05-tuaD-gtaB)搖瓶發(fā)酵制備3種不同分子量均一透明質(zhì)酸。
[0111]①重組工程菌株B.subtilis (pAX01-PmHAS/pHCMC05-tuaD-gtaB)搖瓶發(fā)酵制備重均分子量為4.55MDa的均一分子量透明質(zhì)酸。
[0112]工程菌株搖瓶發(fā)酵制備重均分子量為4.55MDa的均一分子量透明質(zhì)酸按以下方法進(jìn)行:在500mL三角瓶中，以總體積IOOmL含Ig氯化鈉，Ig蛋白胨，0.5g酵母抽提物的體系中按 1% (v/v)接種含有 SEQ N0.USEQ N0.2,SEQ N0.3 的 pAX01/pHCMC05/B.subtilis,當(dāng)發(fā)酵液OD6tltlnm達(dá)到0.2時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度lmmol/L，當(dāng)發(fā)酵液OD6tltlnm達(dá)到0.2到0.4時(shí)加入誘導(dǎo)劑木糖至終濃度0.5% (w/v)，發(fā)酵條件為37°C，220rpm，發(fā)酵終點(diǎn)為接種后培養(yǎng)48小時(shí)，最后，從IOOmL培養(yǎng)基分離純化得到300mg的分子量為4.55MDa的均一分子量透明質(zhì)酸。
[0113]從工程菌株搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中分離純化透明質(zhì)酸按照以下方法進(jìn)行:向發(fā)酵液中加入等體積的十二烷基硫酸鈉溶液(0.1% SDS，w/v)，4000rpm離心20min,去除菌體沉淀，保留上清液。向上清液中加入10% (v/v)的十六烷基三甲基溴化銨溶液(10% CTAB，w/v)，4000rpm離心20min，棄去上清，保留沉淀。用lmol/L的NaCl溶液解離沉淀至溶液澄清。向溶液中加入5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，4°C醇沉。4000rpm離心20min,棄去上清,用無水乙醇洗滌沉淀2-3次，將沉淀放置在真空干燥箱中進(jìn)行干燥。干燥后白色沉淀即為透明質(zhì)酸樣品。
[0114]②重組工程菌株B.subtiIis (pAXOl-PmHAS/pHCMC05-tuaD-gtaB)搖瓶發(fā)酵制備重均分子量為7.99KDa的均一分子量透明質(zhì)酸。
[0115]工程菌株搖瓶發(fā)酵制備重均分子量為7.99KDa的均一分子量透明質(zhì)酸按以下方法進(jìn)行:在500mL三角瓶中，以總體積IOOmL含Ig氯化鈉，Ig蛋白胨，0.5g酵母抽提物的體系中按 1% (v/v)接種含有 SEQ N0.USEQ N0.2,SEQ N0.3 的 pAX01/pHCMC05/B.subtilis,當(dāng)發(fā)酵液OD6tltlnm達(dá)到0.2時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度lmmol/L，當(dāng)發(fā)酵液OD6tltlnm達(dá)到1.0到 1.2時(shí)加入誘導(dǎo)劑木糖至終濃度0.5% (w/v)，發(fā)酵條件為37°C，220rpm，發(fā)酵終點(diǎn)為接種后培養(yǎng)48小時(shí)，最后，從IOOmL培養(yǎng)基分離純化得到IOOmg的分子量為7.99KDa的均一分子量透明質(zhì)酸。
[0116]從工程菌株搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中分離純化透明質(zhì)酸按照以下方法進(jìn)行:向發(fā)酵液中加入等體積的十二烷基硫酸鈉溶液(0.1% SDS，w/v)，4000rpm離心20min,去除菌體沉淀，保留上清液。向上清液中加入4% (v/v)的十六烷基三甲基溴化銨溶液(10% CTAB，w/v)，4000rpm離心20min，棄去上清，保留沉淀。用lmol/L的NaCl溶液解離沉淀至溶液澄清。向溶液中加入5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，4°C醇沉。4000rpm離心20min,棄去上清,用無水乙醇洗滌沉淀2-3次，將沉淀放置在真空干燥箱中進(jìn)行干燥。干燥后白色沉淀即為透明質(zhì)酸樣品。
[0117]③重組工程菌株B.subtilis (pAX01-PmHAS/pHCMC05-tuaD-gtaB)搖瓶發(fā)酵制備重均分子量為5.43MDa的均一分子量透明質(zhì)酸。
[0118]工程菌株搖瓶發(fā)酵制備重均分子量為5.43MDa的均一分子量透明質(zhì)酸按以下方法進(jìn)行:在500mL三角瓶中，以總體積IOOmL含Ig氯化鈉，Ig蛋白胨，0.5g酵母抽提物的體系中按 1% (v/v)接種含有 SEQN0.1、SEQ N0.2、SEQ N0.3 的 pAX01/pHCMC05/B.subtilis,當(dāng)發(fā)酵液OD6tltlnm達(dá)到0.2時(shí)加入`誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度lmmol/L，當(dāng)發(fā)酵液OD6tltlnm達(dá)到0.2到0.4時(shí)加入誘導(dǎo)劑木糖至終濃度0.5% (w/v)，發(fā)酵條件為37°C，220rpm，發(fā)酵終點(diǎn)為接種后培養(yǎng)8小時(shí)，最后，從IOOmL培養(yǎng)基分離純化得到60mg的分子量為5.43MDa的均一分子量透明質(zhì)酸。
[0119]從工程菌株搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中分離純化透明質(zhì)酸按照以下方法進(jìn)行:向發(fā)酵液中加入等體積的十二烷基硫酸鈉溶液(0.1% SDS，w/v)，4000rpm離心20min,去除菌體沉淀，保留上清液。向上清液中加入4% (v/v)的十六烷基三甲基溴化銨溶液(10% CTAB，w/v)，4000rpm離心20min，棄去上清，保留沉淀。用lmol/L的NaCl溶液解離沉淀至溶液澄清。向溶液中加入5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，4°C醇沉。4000rpm離心20min,棄去上清,用無水乙醇洗滌沉淀2-3次，將沉淀放置在真空干燥箱中進(jìn)行干燥。干燥后白色沉淀即為透明質(zhì)酸樣品。
[0120](6)利用重組工程菌株 B.subtilis (pAX01-PmHAS/pHCMC05-gcaD)搖瓶發(fā)酵制備 I種重均分子量為13.20KDa均一透明質(zhì)酸。
[0121]工程菌株搖瓶發(fā)酵制備重均分子量為13.20KDa的均一分子量透明質(zhì)酸按以下方法進(jìn)行:在500mL三角瓶中，以總體積IOOmL含Ig氯化鈉，Ig蛋白胨，0.5g酵母抽提物的體系中按 1% (v/v)接種含有 SEQ N0.1、SEQ N0.4 的 pAX01/pHCMC05/B.subtilis,當(dāng)發(fā)酵液OD600nm達(dá)到0.2時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度lmmol/L，當(dāng)發(fā)酵液OD6tltlnm達(dá)到0.2到0.4時(shí)加入誘導(dǎo)劑木糖至終濃度0.5% (w/v)，發(fā)酵條件為37°C，220rpm，發(fā)酵終點(diǎn)為接種后培養(yǎng)48小時(shí)，最后，從IOOmL培養(yǎng)基分離純化得到80mg的分子量為13.20KDa的均一分子量透明質(zhì)酸。
[0122]從工程菌株搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中分離純化透明質(zhì)酸按照以下方法進(jìn)行:向發(fā)酵液中加入等體積的十二烷基硫酸鈉溶液(0.1% SDS，w/v)，4000rpm離心20min,去除菌體沉淀，保留上清液。向上清液中加入4% (v/v)的十六烷基三甲基溴化銨溶液(10% CTAB，w/v)，4000rpm離心20min，棄去上清，保留沉淀。用lmol/L的NaCl溶液解離沉淀至溶液澄清。向溶液中加入5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，4°C醇沉。4000rpm離心20min,棄去上清,用無水乙醇洗滌沉淀2-3次，將沉淀放置在真空干燥箱中進(jìn)行干燥。干燥后白色沉淀即為透明質(zhì)酸樣品。
[0123](7)利用重組工程菌株 B.subtilis (pAX01-PmHAS/pHCMC05-pgi)搖瓶發(fā)酵制備 I種重均分子量為4.54MDa均一透明質(zhì)酸。
[0124]工程菌株搖瓶發(fā)酵制備重均分子量為4.54MDa的均一分子量透明質(zhì)酸按以下方法進(jìn)行:在500mL三角瓶中，以總體積IOOmL含Ig氯化鈉，Ig蛋白胨，0.5g酵母抽提物的體系中按 1% (v/v)接種含有 SEQN0.1、SEQ N0.5 的 pAX01/pHCMC05/B.subtilis,當(dāng)發(fā)酵液OD600nm達(dá)到0.2時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度lmmol/L，當(dāng)發(fā)酵液OD6tltlnm達(dá)到0.2到0.4時(shí)加入誘導(dǎo)劑木糖至終濃度0.5% (w/v)，發(fā)酵條件為37°C，220rpm，發(fā)酵終點(diǎn)為接種后培養(yǎng)48小時(shí)，最后，從IOOmL培養(yǎng)基分離純化得到150mg的分子量為4.54MDa的均一分子量透明質(zhì)酸。
[0125]從工程菌株搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中分離純化透明質(zhì)酸按照以下方法進(jìn)行:向發(fā)酵液中加入等體積的十二烷基硫酸鈉溶液(0.1% SDS，w/v)，4000rpm離心20min,去除菌體沉淀，保留上清液。向上清液中加入8% (v/v)的十六烷基三甲基溴化銨溶液(10% CTAB，w/v)，4000rpm離心20min，棄去上清，保留沉淀。用lmol/L的NaCl溶液解離沉淀至溶液澄清。向溶液中加入5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，4°C醇沉。4000rpm離心20min,棄去上清,用無水乙醇洗滌沉淀2-3次，將沉淀放置在真空干燥箱中進(jìn)行干燥。干燥后白色沉淀即為透明質(zhì)酸樣品。
[0126]實(shí)施例4:工程菌株搖瓶發(fā)酵制備幾種不同分子量均一透明質(zhì)酸的紅外光譜鑒定
[0127]將實(shí)施例3得到的白色透明質(zhì)酸樣品進(jìn)行溴化鉀壓片，再進(jìn)行紅外光譜檢測(cè)分析，得到紅外吸收特征性光譜圖，與標(biāo)準(zhǔn)透明質(zhì)酸紅外吸收特征性光譜圖進(jìn)行比較，結(jié)果可以看出，經(jīng)工程菌發(fā)酵制備所得的白色沉淀即為透明質(zhì)酸。經(jīng)工程菌發(fā)酵制備所得的白色沉淀紅外吸收光譜圖如圖5
[0128]由圖5可以看出，在3400cm-1-3440cm-1有強(qiáng)的0_H伸縮振動(dòng)的特征吸收，表明有多羥基結(jié)構(gòu)；在290001^-29300^1附近有-CH2的伸縮振動(dòng)；在1729cm-1-1622cm-1處有-C =O和-C-N伸縮振動(dòng)及-N-H彎曲振動(dòng)的吸收峰，表明存在乙酰氨基結(jié)構(gòu)1405cm-1處有O =C-O-伸縮振動(dòng)及1251CHT1處的-OH伸縮振動(dòng)的兩個(gè)吸收峰表明羧基的存在。該白色沉淀物質(zhì)的紅外吸收峰與標(biāo)準(zhǔn)透明質(zhì)酸紅 外吸收峰完全吻合，表明經(jīng)工程菌發(fā)酵制備所得的白色沉淀為透明質(zhì)酸。
[0129]實(shí)施例5:工程菌株搖瓶發(fā)酵制備幾種不同分子量均一透明質(zhì)酸的含量測(cè)定[0130](I)通過硫酸咔唑法測(cè)定葡萄糖醛酸含量計(jì)算透明質(zhì)酸含量。
[0131]對(duì)照品溶液的制備:取經(jīng)105°C干燥至恒重的葡萄糖醛酸對(duì)照品60mg，精密稱定，置100ml容量瓶中，用水溶解，并稀釋至刻度，搖勻；精密量取10ml，置100ml容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。
[0132]樣品溶液的制備:取本品約80mg，精密稱定，置100ml容量瓶中，用水溶解，并稀釋至刻度，搖勻；用內(nèi)容量移液管量取10ml，置100ml容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。
[0133]標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密量取對(duì)照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.01111，分別置25ml具塞試管中，依次分別加水至1.0ml,混勻，冰浴中冷卻，并在不斷振搖下緩緩滴加0.025mol/L硼砂硫酸溶液5.0ml，密塞，沸水浴加熱10分鐘(中間振搖一次)，迅速冷卻，加0.125%咔唑的無水乙醇溶液0.2ml，搖勻，沸水浴中加熱15分鐘(中間振搖一次)，冷卻至室溫。照紫外-可見分光光度法(中國(guó)藥典2010年版二部附錄IVA)，以O(shè)管為空白，在530nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以葡萄糖醛酸的μ g數(shù)對(duì)相應(yīng)的吸光度計(jì)算回歸方程。
[0134]測(cè)定法:精密量取樣品溶液1ml，置25ml具塞試管中，自“冰浴中冷卻”起照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法測(cè)定，由回歸方程計(jì)算葡萄糖醛酸的含量，乘以2.0675，即得透明質(zhì)酸含量。
[0135](2)通過CTAB比濁法測(cè)定發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量。
[0136]對(duì)照品溶液的制備:精密稱定IOmg透明質(zhì)酸標(biāo)準(zhǔn)品，置IOml量瓶中，用水溶解，并稀釋至刻度，搖勻。
[0137]樣品溶液的制備:取發(fā)酵液培養(yǎng)基ImL加入3mL無水乙醇，離心去上清，將沉淀溶于ImL水。
[0138]標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:從精密配制的濃度為lmg/mL的HA標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別量取0，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8mL于帶塞試管中，加水至ImL,加入2mL2.5g/L的CTAB溶液后混勻，在25°C的條件下反應(yīng)lOmin，測(cè)定以HA標(biāo)準(zhǔn)液的濃度對(duì)A4tltlnm做圖，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0139]測(cè)定法:精密量取樣品溶液1ml，稀釋適當(dāng)倍數(shù)，按照上述方法測(cè)定由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出相應(yīng)濃度，乘以稀釋倍數(shù)得到發(fā)酵液培養(yǎng)基中透明質(zhì)酸的含量。
[0140]實(shí)施例6:工程菌株搖瓶發(fā)酵制備幾種不同分子量均一透明質(zhì)酸的分子量與分子量分布測(cè)定
[0141]取本品5mg，加流動(dòng)相至50ml，搖勻，室溫放置過夜，作為供試品溶液。另取5個(gè)已知分子量范圍0.1萬~500萬的聚苯乙烯硫酸酯鈉鹽對(duì)照品，同法配制成每Iml中約含0.1mg的溶液作為系列對(duì)照 品溶液。照分子排阻色譜法(中國(guó)藥典2010年版二部附錄VH)，用多糖測(cè)定用凝膠柱Shodex SB-806HQ(8.0mmX 300mm),以0.2mol/L氯化鈉溶液(取氯化鈉11.9g，疊氮化鈉0.1g,加純水使溶解并稀釋至1000ml)為流動(dòng)相，柱溫35°C，流速為每分鐘0.5ml，檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器，高效液相系統(tǒng)為安捷倫(Agilent) 1100。透明質(zhì)酸樣品高效液相色譜圖如圖6。
[0142]取上述各對(duì)照品溶液ΙΟΟμ 1，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，由GPC軟件進(jìn)行普適校正計(jì)算線性回歸方程，對(duì)照品K值為0.00018, a值為0.65 ;本品K值為0.00057, a值為0.75。取供試品溶液ΙΟΟμ 1，同法測(cè)定，用GPC軟件計(jì)算出供試品的分子量及分子量分布。[0143]本發(fā)明的工程菌株搖瓶發(fā)酵制備的幾種不同分子量均一透明質(zhì)酸的分子量與分子量分布見表1。
表1幾種不同分子量均一透明質(zhì)酸的分子量與分子量分布
【權(quán)利要求】
1.一種重組質(zhì)粒1，其特征在于核苷酸序列為SEQ NO: 6。
2.一種重組質(zhì)粒2，其特征在于核苷酸序列為SEQ NO: 7。
3.—種重組質(zhì)粒3，其特征在于核苷酸序列為SEQ NO: 8。
4.一種重組質(zhì)粒4，其特征在于核苷酸序列為SEQ NO: 9。
5.一種重組工程菌1，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒I和權(quán)利要求2所述的重組質(zhì)粒2。
6.一種重組工程菌2，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒I和權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒3。
7.—種重組工程菌3，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒I和權(quán)利要求4所述的重組質(zhì)粒4。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種重組工程菌I制備透明質(zhì)酸的方法，其特征在于按如下步驟實(shí)現(xiàn): A、以總體積IOOmL含Ig氯化鈉，Ig蛋白胨,0.5g酵母抽提物的體系中按1% v/v接種重組工程菌I ;發(fā)酵液OD6tltol達(dá)到0.2時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度lmmol/L，發(fā)酵液OD6tltol達(dá)到0.2到0.4時(shí)加入誘導(dǎo)劑木糖至終濃度0.5% w/v,發(fā)酵終點(diǎn)為接種后培養(yǎng)48小時(shí)，從培養(yǎng)基中分離得到重均分子量為5.43MDa的透明質(zhì)酸； B、以總體積tOOmL含Ig氯化鈉，Ig蛋白胨,0.5g酵母抽提物的體系中按1% v/v接種重組工程菌I進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵液OD6tltol達(dá)到0.2時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度lmmol/L，發(fā)酵液OD6tltlnm達(dá)到0.2到0.4時(shí)加入誘導(dǎo)劑木糖至終濃度0.5% w/v,發(fā)酵終點(diǎn)為接種后培養(yǎng)8小時(shí)；從培養(yǎng)基中分離得到重均分子量為4.55MDa的透明質(zhì)酸； C、以總體積IOOmL含Ig氯化鈉，Ig蛋白胨,0.5g酵母抽提物的體系中按1% v/v接種重組工程菌I進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵液OD6tltol達(dá)到0.2時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度lmmol/L，發(fā)酵液OD6tltlnm達(dá)到1.0到1.2時(shí)加入誘導(dǎo)劑木糖至終濃度0.5% w/v,發(fā)酵終點(diǎn)為接種后培養(yǎng)48小時(shí)；從培養(yǎng)基中分離得到重均分子量為7.99KDa的透明質(zhì)酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種重組工程菌2制備透明質(zhì)酸的方法，其特征在于按如下步驟實(shí)現(xiàn):以總體積IOOmL含Ig氯化鈉，Ig蛋白胨，0.5g酵母抽提物的體系中按1% v/v接種重組工程菌2進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵液OD6tltol達(dá)到0.2時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度lmmol/L，發(fā)酵液OD6tltlnm達(dá)到0.2到0.4時(shí)加入誘導(dǎo)劑木糖至終濃度0.5% w/v,發(fā)酵終點(diǎn)為接種后培養(yǎng)48小時(shí)，從培養(yǎng)基中分離得到重均分子量為13.20KDa的透明質(zhì)酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種重組工程菌3制備透明質(zhì)酸的方法，其特征在于按如下步驟實(shí)現(xiàn): 以總體積1OOmL含Ig氯化鈉，Ig蛋白胨,0.5g酵母抽提物的體系中按1% v/v接種重組工程菌3進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵液OD6tltol達(dá)到0.2時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度lmmol/L，發(fā)酵液OD6tltol達(dá)到0.2到0.4時(shí)加入誘導(dǎo)劑木糖至終濃度0.5% w/v,發(fā)酵終點(diǎn)為接種后培養(yǎng)48小時(shí)；從培養(yǎng)基中分離得到重均分子量為4.53MDa的透明質(zhì)酸。
11.一種制備透明質(zhì)酸的生物合成方法，其特征在于按如下步驟實(shí)現(xiàn): 第一步、從禽多殺性巴氏桿菌Pasteurella multocida P_1059ATCC#15742分離透明質(zhì)酸合成酶基因，即SEQN0.1 ； 第二步、從革蘭氏陽性安全微生物宿主分離與透明質(zhì)酸前體，即UDP-葡萄糖醛酸和UDP-N-乙酰-葡萄糖氨的合成相關(guān)基因，包括:UDP-葡萄糖脫氫酶基因，即SEQ N0.2 ；Μ)Ρ-葡萄糖焦磷酸化酶基因，即SEQ N0.3 ;乙酰轉(zhuǎn)移酶和UDP-N-乙酰-葡萄糖氨焦磷酸化酶基因，即SEQ N0.4 ;葡萄糖-6-磷酸變位酶基因，即SEQ N0.5 ； 第三步、將SEQ N0.1與化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子組成第一個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒；將來自SEQ N0.2到SEQ N0.5中的任何一個(gè)基因與另一個(gè)化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子組成第二個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒； 所述的化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子包括:枯草芽孢桿菌的木糖異構(gòu)酶基因的啟動(dòng)子和大腸桿菌的乳糖利用操縱子的啟動(dòng)子； 第四步、采用制備感受態(tài)細(xì)胞的方法將兩個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化革蘭氏陽性微生物宿主菌，用選擇標(biāo)記篩選，得到能分泌表達(dá)不同分子量均一透明質(zhì)酸的革蘭氏陽性基因工程安全菌株； 所述的選擇標(biāo)記是指:用來篩選含有透明質(zhì)酸合成相關(guān)基因的基因工程安全菌株的抗性基因，包括:紅霉素抗性基因，氯霉素抗性基因； 第五步、對(duì)革蘭氏陽性基因工程安全菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，在不同培養(yǎng)階段加入誘導(dǎo)透明質(zhì)酸前體合成的誘導(dǎo)劑和誘導(dǎo)透明質(zhì)酸合成的誘導(dǎo)劑以及設(shè)置不同發(fā)酵終點(diǎn)，借此控制透明質(zhì)酸在宿主菌體內(nèi)合成進(jìn)程以獲得不同分子量均一透明質(zhì)酸，發(fā)酵結(jié)束后即從培養(yǎng)基中分離純化得到基于基因工程安全菌株的不同分子量均一透明質(zhì)酸； 所述的化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄是指:所述的木糖異構(gòu)酶基因的啟動(dòng)子只有加入木糖后才可能啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄，木糖的質(zhì)量百分比濃度為0.5%到2% ;所述的乳糖利用操縱子的啟動(dòng)子只有加入IPTG后才可能啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄，IPTG的摩爾濃度為lmmol/L到25mmol/L。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的一種制備透明質(zhì)酸的生物合成方法，其特征在于所述的革蘭氏陽性安全微生物包括枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、短芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、短短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜淀粉擬桿菌、嗜熱脂肪地芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、嗜淀粉擬桿菌、納豆芽孢桿菌中任一種。
【文檔編號(hào)】C12N15/75GK103789338SQ201210427972
【公開日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2012年11月1日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月1日
【發(fā)明者】高向東, 姚文兵, 賈毓寧, 陳曉菲 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)