一種亞硝酸菌的保藏方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種亞硝酸菌的保藏方法，包括如下步驟：（1）將亞硝酸菌培養(yǎng)至亞硝化率達80%以上，并收集菌體；（2）配制亞硝酸菌保藏營養(yǎng)液；（3）步驟（1）收集的亞硝酸菌體與步驟（2）配制的亞硝酸菌保藏營養(yǎng)液混合，pH為7.5～8.5，含水率為40%～80%，含水率指亞硝酸菌保藏體系中水的重量含量；（4）添加保藏劑；（5）低溫冷凍保藏。與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有方法簡單、存活率高、活性恢復快速等優(yōu)點，適宜于亞硝酸菌的大量長期保存。
【專利說明】一種亞硝酸菌的保藏方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種菌體保藏方法，具體涉及一種簡單有效的低溫冷凍保藏亞硝酸菌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]氨氮是國家實現(xiàn)水污染控制總量控制的污染物，水體中氨氮含量過高會引起水質(zhì)富營養(yǎng)化，導致水體中某些藻類過度繁殖，其它生物生長受到影響，從而破壞了水生生態(tài)系統(tǒng)，導致水質(zhì)惡化并影響到其使用功能。生物脫氮技術(shù)以其環(huán)保高效無二次污染等優(yōu)點是目前國內(nèi)外脫氮技術(shù)研究應用的熱點。生物脫氮的硝化過程是在好氧條件下通過硝酸菌或亞硝酸菌將氨氮氧化為硝氮或亞硝氮，再通過缺氧條件下的反硝化菌將硝氮或亞硝氮還原成氣態(tài)氮從水中除去。傳統(tǒng)生物脫氮工藝中間浪費了一個將亞硝氮轉(zhuǎn)化硝氮，硝氮又轉(zhuǎn)化為亞硝氮的過程。短程硝化反硝化脫氮是將硝化反應控制在亞硝氮階段，阻止亞硝氮的進一步硝化，然后直接進行反硝化。與傳統(tǒng)硝化反硝化相比，短程硝化反硝化具有如下的優(yōu)點:(1)硝化階段可減少25%左右的需氧量，降低了能耗；(2)反硝化階段可減少40%左右的有機碳源，降低了運行費用；⑶反應時問縮短，反應器容積可減小30%~40%左右；(4)具有較高的反硝化速率；(5)污泥產(chǎn)量降低；(6)減少了投堿量等。由此可見，控制硝化過程在亞硝化階段具有重要意義，而完成短程硝化的高性能亞硝酸菌被選育出來后，如何長期有效的保藏至關(guān)重要。
[0003]微生物菌種是重要的生物資源之一，一個優(yōu)良的菌種被選育出來以后，必須保持其優(yōu)良性狀不變或盡可能地少變慢變，才不至于降低菌體性能，能長期應用于生產(chǎn)中。菌種保藏的基本原理主要是根據(jù)其生理生化特征，人工創(chuàng)造條件，使微生物代謝處于不活潑、生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)，即采取低溫、干燥、缺氧等條件，使菌種暫時處于休眠狀態(tài)。一種好的保藏方法首先應能長期保持菌種原有的優(yōu)良性狀不變，同時還需考慮到方法本身的簡便和經(jīng)濟，以便在生產(chǎn)上能推廣使用。為了有效地保藏微生物菌種，就需要針對菌種的特性研究選用適宜的保藏方法。菌`種保藏方法很多，目前國內(nèi)外常用的有定期移植法、液體石蠟法、沙土管法、真空冷凍干燥法、超低溫冰箱冷凍法、超低溫液氮冷凍法等。其中定期移植法、液體石蠟法、沙土管法、真空冷凍干燥法不適合大量菌種的保藏；超低溫液氮冷凍法和超低溫冰箱冷凍法等均需使用保護劑來制備細胞懸液，保護劑有牛乳、血清、糖類、甘油、二甲亞砜等，目的是防止因冷凍或水分不斷升華對細胞的損害。冷凍保存是解決種質(zhì)退化和防止自然積累性突變的一種有效途徑，但傳統(tǒng)的低溫保存需要昂貴的程序降溫儀器，步驟繁瑣。完全玻璃化是低溫保存的一種新方法，即在高濃度保護劑下，細胞連同保護劑于快速降溫中都進入玻璃化狀態(tài)，避免胞內(nèi)冰晶形成，使器官和組織各部分都進入相同的狀態(tài)，具有設(shè)備簡單、程序簡單和凍存效果好等優(yōu)點。
[0004]CN200810124325.5提供了一種菌種保藏方法，采用半固體、低溫密封培養(yǎng)的方法:將菌種接種于無菌的半固體培養(yǎng)基中，倒入無菌液體石臘后豎直存放入6~8°C的環(huán)境溫度中保存。所述菌種為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、黑曲霉或白色鏈珠菌。采用此方法可延長菌種的保存時間，同時菌種的濃度保持相對穩(wěn)定，為生產(chǎn)、試驗節(jié)約了大量的成本，減少了菌種使用后廢棄物的處理和排放，減少了對環(huán)境的危害。但是該方法工序復雜繁瑣，不適合大量菌體的長期保藏。
[0005]CN201010299763.2提供了一種冷凍保存紅細胞的方法，向紅細胞中加入還原劑和甘油以及作為金屬離子螯合劑的乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸鹽；還原劑為抗壞血酸或抗壞血酸鹽、半胱氨酸鹽酸鹽或N-乙酰半胱氨酸、硼氫化鈉、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉或焦亞硫酸鈉、還原型谷胱甘肽中的任意一種或者兩種或兩種以上的混合物，還原劑終濃度各為
0.5~300mM ;甘油的量以終體積比計為5%~10% ;乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸鹽的終濃度為0.1~IOmM ;充分混勻并調(diào)節(jié)酸度值至6.5~8.0，將容器封口，靜置I小時后在_40°C以下冷凍保存。以該方法冷凍保存的紅細胞，一年后解凍，紅細胞破碎率大于95%，血紅蛋白無變性，未被氧化為高鐵血紅蛋白。此種方法適合細胞保藏法，不適合菌種活性的保藏。
[0006]CN200810190852.6涉及一種菌種保藏方法，包括以下步驟:(I)將需要保藏的菌種接種到滅過菌的麩皮培養(yǎng)基中；培養(yǎng)基配方為50~60%麩皮、35~45%粉碎后的谷殼、I~2%硝酸鈉、I~2%尿素、I~2%米粉、0.2~1%生物素營養(yǎng)添加劑，加入上述混合物相同重量的去離子水，混合均勻即可；(2)當菌絲長到需要的菌齡時，不需分離出菌絲制成菌懸液，直接將凍干液立即加入安瓿管中與培養(yǎng)物混合均勻；凍干液配方為10~20克脫脂牛奶、0.2~0.5克瓊脂粉、0.2~0.5克還原型谷胱甘肽、0.1~0.5克阿拉伯膠、0.5~I克叔丁醇，用去離子水定容到100毫升；(3)然后以2°C /分鐘的降溫速率降溫，冷凍干燥；
(4)凍干后對盛菌的安瓿管抽真空，然后封口 ；以及(5)將所得到的管置入低溫下保藏。該法采用真空冷凍干燥法保藏菌體，需要采用緩慢的降溫程序?qū)⒕w凍干進而低溫保藏，步驟繁瑣，能耗較高。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]針對現(xiàn)有技術(shù)的不`足，本發(fā)明提供一種亞硝酸菌的保藏方法。本發(fā)明具有方法簡單、存活率高、活性恢復快速等優(yōu)點，適宜于亞硝酸菌的大量長期保存。
[0008]本發(fā)明亞硝酸菌的保藏方法，包括如下步驟:
(1)將亞硝酸菌培養(yǎng)至亞硝化率達80%以上，并收集菌體；
(2)配制亞硝酸菌保藏營養(yǎng)液；
(3)步驟(1)收集的亞硝酸菌體與步驟(2)配制的亞硝酸菌保藏營養(yǎng)液混合，pH為
7.5~9.0，含水率為40%~80%，含水率指亞硝酸菌保藏體系中水的重量含量；
(4)添加保藏劑；
(5)低溫冷凍保藏。
[0009]本發(fā)明步驟(1)中，亞硝酸菌培養(yǎng)采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法，如采用間歇式活性污泥法等。亞硝酸菌培養(yǎng)可以采用人工配置的培養(yǎng)液，也可采用廢水對亞硝酸菌進行培養(yǎng)。培養(yǎng)液所含成分主要為銨鹽，氨氮濃度為200~1500mg/L，還有少量Fe2+、Mg2+、K+、Ca2+等金屬離子以及磷酸根離子等。亞硝酸菌培養(yǎng)條件為溫度30~40°C，pH為7.0~8.5，溶解氧為
1.0~5.0mg/L，培養(yǎng)至氨氮去除率達99%、亞硝化率達80%以上時收集菌體(亞硝化率是指氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝氮的比率)。亞硝酸菌培養(yǎng)至亞硝化率達80%以上時，通過沉降、過濾、離心等方法收集亞硝酸菌體。亞硝酸菌培養(yǎng)的初始來源可以是任意需要保藏的亞硝酸菌。[0010]本發(fā)明步驟(2)中，亞硝酸菌保藏營養(yǎng)液中含有(NH4)2SO4,同時含有微量物質(zhì)FeSO4, KH2PO4, MgCl2和CaCl2。各種物質(zhì)的用量按步驟(3)中所需濃度確定。
[0011]本發(fā)明步驟(3)中，亞硝酸菌與保藏營養(yǎng)液混合后，可以采用碳酸氫鈉、碳酸鈉和氫氧化鈉等調(diào)節(jié)pH。亞硝酸菌與保藏營養(yǎng)液混合物中，NH4+-N濃度為0.1~1.5g/L，F(xiàn)e2+濃度為 0.01 ~0.06g/L, K.濃度為 0.05 ~0.5g/L, Ca2+ 濃度為 0.01 ~0.1g/I, Mg2+ 濃度為 0.05 ~0.5g/L。
[0012]本發(fā)明步驟(4)中，所述的保藏劑可以是本領(lǐng)域應用的所有常規(guī)的保藏劑，優(yōu)選為二甲亞砜，用量為亞硝酸菌加入營養(yǎng)液后混合物體積的2%~5%。
[0013]本發(fā)明步驟(5)中，低溫冷凍保藏可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的超低溫冷凍設(shè)備。低溫冷凍保藏溫度為_20°C~-70°C。
[0014]本發(fā)明方法通過從菌體培養(yǎng)、含水率、營養(yǎng)液、保護劑等方面進行優(yōu)化考察，得到了最適宜的亞硝酸菌低溫冷凍保藏方法。本發(fā)明方法可以延長菌種的保存時間，同時使菌種的活性保持相對穩(wěn)定，菌體保藏后存活率高，活性恢復迅速，對于大量菌體保藏經(jīng)濟方便，為生產(chǎn)、試驗節(jié)約成本。本發(fā)明方法簡單，不需特殊設(shè)備，方便快捷，適合大量菌種保藏，存活率可以達到90%以上。
【具體實施方式】
[0015]本發(fā)明的一種具體實施過程如下:
Cl)利用適宜的培養(yǎng)液，溫度30~40°C，pH為7.0~8.5，溶解氧為L O~5.0mg/L,培養(yǎng)至氨氮去除率達99%、亞硝化率達80%以上時收集菌體。
[0016](2)菌懸液的含水`率對于胞內(nèi)外冰晶的形成有影響，進而影響保藏效果，因此需要適宜的含水率。菌體培養(yǎng)液的初始含水量較高，因此需要降低菌體含水率。
[0017](3) pH對控制硝化反應在亞硝化階段和亞硝酸菌的活性均具有一定影響，在低溫條件下，雖然菌體處于休眠狀態(tài)，但是由于營養(yǎng)物質(zhì)豐富，會使PH有所下降，因此控制混合液適宜的PH對于菌體的保藏至關(guān)重要。
[0018](4)營養(yǎng)物質(zhì)是菌體生存的必備條件，可使菌體在低溫冰箱中保藏若干年，而不影響其活性，需要按照適宜的營養(yǎng)物質(zhì)濃度加入保藏所需營養(yǎng)液。
[0019](5)保藏劑可以是本領(lǐng)域應用的所有保藏劑，優(yōu)選二甲亞砜C2H6SO作冷凍保藏劑。二甲亞砜是一種滲透性保護劑，對細胞無毒性，分子量小，溶解度好，能迅速透入細胞，降低冰點，提高細胞膜對水的通透性，延緩凍結(jié)過程，能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)之前透出細胞外，在胞外形成冰晶，提高細胞內(nèi)的電解質(zhì)濃度，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細胞凍傷。加入一定配比的冷凍保護劑，使用量為加入營養(yǎng)液后待保藏菌體體積的2%~5%。
[0020](6)低溫冰箱凍存:低溫冷凍是在_20°C~_70°C之間。保藏3~5年能力后，考察菌體存活率和活性。
[0021]實施例1
配制進水氨氮濃度為400mg/L的培養(yǎng)液，在IOOL生物曝氣反應池中采用間歇式活性污泥法對亞硝酸菌進行培養(yǎng)，溫度32°C，pH為7.8，溶解氧為1.0~2.5mg/L。當菌體的氨氮去除率達99%以上，亞硝化率達80%以上時停止培養(yǎng)，沉降或離心后進行多次洗滌，降低硝化產(chǎn)物濃度。按照50%的含水率，將菌體與配制的營養(yǎng)液混合，搖勻后加入3%的保藏劑二甲亞砜，于-50°C低溫冰箱保藏。2年后取出考察菌體的活性和存活率，經(jīng)過3d的恢復，菌體的活性可完全恢復，存活率可達94%。
[0022]亞硝酸菌與保藏營養(yǎng)液混合物中，營養(yǎng)物質(zhì)的組成和濃度為:氨氮濃度為0.4g/L, Fe2+ 濃度為 0.02g/L, K.濃度為 0.lg/L，Ca2+ 濃度為 0.05g/L, Mg2+ 濃度為 0.lg/L。
[0023]實施例2
配制進水氨氮濃度為600mg/L的培養(yǎng)液，在100L生物曝氣反應池中采用間歇式活性污泥法對亞硝酸菌進行培養(yǎng)，溫度35°C，pH為8.0，溶解氧為1.5~3.0mg/L。當菌體的氨氮去除率達99%以上，亞硝化率達80%以上時停止培養(yǎng)，沉降或離心后進行多次洗滌，降低硝化產(chǎn)物濃度。按照60%的含水率，將菌體與配制的營養(yǎng)液混合，搖勻后加入4%的保藏劑二甲亞砜，于-60°C低溫冰箱保藏。4年后取出考察菌體的活性和存活率，經(jīng)過5d的恢復，菌體的活性可完全恢復，存活率可達91%。
[0024]亞硝酸菌與保藏營養(yǎng)液混合物中，營養(yǎng)物質(zhì)的組成和濃度為:氨氮濃度為0.6g/L, Fe2+ 濃度為 0.02g/L, K.濃度為 0.lg/L, Ca2+ 濃度為 0.05g/L, Mg2+ 濃度為 0.lg/L。
[0025]實施例3
配制進水氨氮濃度為800mg/L的培養(yǎng)液，在IOOL生物曝氣反應池中采用間歇式活性污泥法對亞硝酸菌進行培養(yǎng)，溫度37°C，pH為8.5，溶解氧為1.5~2.5mg/L。當菌體的氨氮去除率達99%以上，亞硝化率達80%以上時停止培養(yǎng)，沉降或離心后進行多次洗滌，降低硝化產(chǎn)物濃度。按照70%的含水率，將菌體與配制的營養(yǎng)液混合，搖勻后加入5%的保藏劑二甲亞砜，于-70°C低溫冰箱保藏。5年后取出考察菌體的活性和存活率，經(jīng)過7d的恢復，菌體的活性可完全恢復，存活率可達90%。
[0026]亞硝酸菌與保藏營 養(yǎng)液混合物中，營養(yǎng)物質(zhì)的組成和濃度為:氨氮濃度為0.6g/L, Fe2+ 濃度為 0.02g/L, K.濃度為 0.lg/L, Ca2+ 濃度為 0.05g/L, Mg2+ 濃度為 0.lg/L。
【權(quán)利要求】
1.一種亞硝酸菌的保藏方法，其特征在于包括如下步驟: (1)將亞硝酸菌培養(yǎng)至亞硝化率達80%以上，并收集菌體； (2)配制亞硝酸菌保藏營養(yǎng)液； (3)步驟(1)收集的亞硝酸菌體與步驟(2)配制的亞硝酸菌保藏營養(yǎng)液混合，pH為7.5~8.5，含水率為40%~80%，含水率指亞硝酸菌保藏體系中水的重量含量； (4)添加保藏劑； (5)低溫冷凍保藏。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)中，亞硝酸菌培養(yǎng)采用間歇式活性污泥法。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)中，亞硝酸菌培養(yǎng)條件為溫度30~40°C，pH為7.0~8.5，溶解氧為1.0~5.0mg/L，培養(yǎng)至氨氮去除率達99%、亞硝化率達80%以上時收集菌體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于:步驟(1)中，亞硝酸菌培養(yǎng)至亞硝化率達80%以上時，通過沉降、過濾或離心方法收集亞硝酸菌體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，亞硝酸菌保藏營養(yǎng)液中含有(NH4)2SO4,同時含有微量物質(zhì) FeSO4, KH2PO4, MgCl2 和 CaCl20
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，亞硝酸菌與保藏營養(yǎng)液混合后，采用碳酸氫鈉、碳酸鈉或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，亞硝酸菌與保藏營養(yǎng)液混合物中，ΝΗ:-Ν 濃度為 0.1 ~1.5g/L, Fe2+ 濃度為 0.01 ~0.06g/L, K.濃度為 0.05 ~0.5g/L, Ca2+ 濃度為 0.01 ~0.1g/I, Mg2+ 濃度為 0.05 ~0.5g/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(4)中，保藏劑是二甲亞砜。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的方法，其特征在于:步驟(4)中，保藏劑用量為亞硝酸菌加入營養(yǎng)液后混合物體積的2%~5%。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(5)中，低溫冷凍保藏溫度為-20°C~-70°C。
【文檔編號】C12N1/04GK103773685SQ201210404073
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年10月23日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月23日
【發(fā)明者】孫丹鳳, 高會杰, 張鵬, 李寶忠 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院