專利名稱：：似vbnc的可培養(yǎng)乳酸桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種活的細(xì)菌存在形式，確切地說是似活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的可培養(yǎng)乳酸桿菌。
背景技術(shù)：
：眾所周知，目前普遍使用的動物微生態(tài)活菌制劑主要是以乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌等多種益生菌研制的，其中應(yīng)用最廣泛、種類最多的是以乳酸桿菌為主的活菌制劑。但由于乳酸桿菌不耐熱，經(jīng)受不住飼料制粒與膨化過程中高溫高壓的破壞作用，因而許多專家極力建議應(yīng)直接飼喂。然而，用于直接飼喂的活菌制劑產(chǎn)品最重要的標(biāo)志是活菌數(shù)量，規(guī)定合格產(chǎn)品中的活菌數(shù)應(yīng)達(dá)到IO9CFU/g，因而有效活菌數(shù)的多少和保存期的長短就成了產(chǎn)品貨架壽命的關(guān)鍵指標(biāo)。當(dāng)前市售的該類產(chǎn)品主要用凍干技術(shù)保持活菌活力，但生產(chǎn)成本較高。一般含有IO9個活菌數(shù)的凍干粉價格約1000元/Kg，而含有101°個活菌數(shù)的價格則為兩倍。盡管采用穩(wěn)定化、微膠囊化及包膜等先進(jìn)工藝替代，也克服不了高成本、繁制備等缺點(diǎn)。由此反映出動物微生態(tài)產(chǎn)業(yè)中存在的主要問題，一是基礎(chǔ)研究問題，主要涉及微生物菌種的篩選與鑒定；二是產(chǎn)業(yè)化問題，主要涉及產(chǎn)品的制劑技術(shù)。而其核心問題只有一個，即保持微生物活性、提高微生物活力、延長微生物保存。自1982年細(xì)菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)(viablebutnoncultutable,VBNC)發(fā)現(xiàn)以來，獨(dú)特的生物學(xué)特征不僅讓更多的人認(rèn)識到VBNC病菌的巨大危害，同時也會讓研究者看到VBNC益生菌的實(shí)際應(yīng)用價值，即VBNC益生菌可由寡營養(yǎng)、低溫等不利條件誘導(dǎo)，可以相當(dāng)長時間內(nèi)保留原菌生物學(xué)特征。盡管喪失了平板上生長繁殖能力，但卻可以長久存活。此狀態(tài)下的細(xì)菌均可啟動全部促進(jìn)生存和抵御不良環(huán)境的基因群，就是這些基因群的表達(dá)產(chǎn)物維持著菌體活性。擺在現(xiàn)階段的一個瓶頸問題是VBNC維持期內(nèi)的細(xì)菌，其生物學(xué)性質(zhì)難以穩(wěn)定存在，極易在研究過程中突然消失，使細(xì)菌轉(zhuǎn)入真正死亡期，而且進(jìn)入VBNC狀態(tài)的細(xì)菌常規(guī)的培養(yǎng)方法不可培養(yǎng)。只有采用特殊的方法復(fù)蘇后，才可培養(yǎng)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為解決VBNC維持期內(nèi)的細(xì)菌，其生物學(xué)性質(zhì)難以穩(wěn)定存在，極易在研究過程中突然消失，保存期短的問題，而提供一種耐寡營養(yǎng)、低溫等不利條件，進(jìn)入VBNC狀態(tài)后，用常規(guī)的培養(yǎng)方法既可培養(yǎng)的，能穩(wěn)定繁殖遺傳的VBNC細(xì)菌突變體，似活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的可培養(yǎng)乳酸桿菌。似VBNC的可培養(yǎng)乳酸桿菌，保藏編號為CGMCCNo.6579。所述的VBNC的可培養(yǎng)乳酸桿菌，是從自然發(fā)酵酸牛奶中分離出來的植物乳酸桿菌LactobaciIlusplantarum,似VBNC的可培養(yǎng)乳酸桿菌的鑒定方法，用常規(guī)的方法誘導(dǎo)乳酸桿菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)，可培養(yǎng)的即為似VBNC的可培養(yǎng)乳酸桿菌；所述的可培養(yǎng)是不經(jīng)過VBNC的復(fù)蘇，用常規(guī)方法既可培養(yǎng)。似VBNC的可培養(yǎng)乳酸桿菌作為VBNC細(xì)菌模型用于研究VBNC細(xì)菌的應(yīng)用。細(xì)菌VBNC狀態(tài)是指細(xì)菌在不良環(huán)境中，細(xì)胞縮成球形，用常規(guī)方法(平板法、最大可能近似值法)培養(yǎng)時，不能生長繁殖，但仍然是活的細(xì)菌的特殊存在形式。不可培養(yǎng)是指用常規(guī)的方法不可培養(yǎng)；可培養(yǎng)是指用常規(guī)的方法既可培養(yǎng)。目前將正常的細(xì)菌經(jīng)過誘導(dǎo)進(jìn)入VBNC狀態(tài)，及檢測其是否進(jìn)入VBNC狀態(tài)的技術(shù)手段已經(jīng)很成熟，寡營養(yǎng)、低溫等不利條件均能誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)。細(xì)菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)(ViablebutNon-culturable,VBNC)的復(fù)蘇是指將不能培養(yǎng)的細(xì)菌恢復(fù)為可培養(yǎng)狀態(tài)的過程，國內(nèi)外用于VBNC沙門氏菌復(fù)蘇的方法主要源自于Reissbrodt等人在2002年發(fā)表在AppliedandEnvironmentalMicrobiology刊物上的一篇題為((ResuscitationofSalmonellaentericaSerovarTyphimuriumandEnterohemorrhagicEscherichiacolifromtheViablebutNonculturableStatebyHeat-StableEnterobacterialAutoinducer》的文章。文中提及的VBNC沙門氏菌復(fù)蘇所需主要材料為含有30%牛血清和50ymol/L去甲腎上腺素的SAPI培養(yǎng)基，其中SAPI培養(yǎng)基成份較為復(fù)雜。通過此法可以使維持VBNC長達(dá)I年的細(xì)菌恢復(fù)為可培養(yǎng)狀態(tài)。本發(fā)明人多年從事VBNC細(xì)菌的研究，新近研究發(fā)現(xiàn)了又一種活的細(xì)菌存在形式，有些VBNC細(xì)菌突變體，在進(jìn)入VBNC狀態(tài)后，具備了VBNC細(xì)菌相關(guān)基因，不經(jīng)過細(xì)菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)(ViablebutNon-culturable,VBNC)的復(fù)蘇，用常規(guī)方法培養(yǎng)，即可培養(yǎng)。這些突變體與VBNC細(xì)菌具有相同的特征，但又有別于VBNC細(xì)菌，命名為似VBNC的可培養(yǎng)細(xì)菌。獲得了多株VBNC細(xì)菌突變體，其中植物乳桿菌和鼠傷寒沙門氏菌的VBNC細(xì)菌突變體于2012年9月18日保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心。彌補(bǔ)了VBNC細(xì)菌不能生長繁殖和無法保存的缺憾，在不良環(huán)境中能持續(xù)存活的“菌種”。解決了微生態(tài)制劑產(chǎn)業(yè)中存在的核心問題。在作為VBNC細(xì)菌模型用于研究VBNC細(xì)菌，研究VBNC的發(fā)生機(jī)制，及以乳酸菌為載體，研制口服疫苗等方面，本研究對乳酸桿菌實(shí)施化學(xué)誘變，經(jīng)VBNC誘導(dǎo)條件篩選，以及AFLP鑒定后獲得VBNC乳酸桿菌突變體，并對VBNC乳酸桿菌及其突變體對斷奶仔豬的免疫學(xué)活性進(jìn)行測定，從而為進(jìn)一步研制新型豬用微生態(tài)制劑奠定基礎(chǔ)。圖1選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物PAGE檢測，M:分子量標(biāo)記；1:陰性對照；2:乳酸桿菌；3:似VBNC的可培養(yǎng)乳酸桿菌；圖2早期斷奶仔豬平均體重變化；圖3不同時期內(nèi)斷奶仔豬血清中IL-1O含量；圖4不同時期內(nèi)各組斷奶仔豬血清中TNF-α含量。具體實(shí)施方式實(shí)施例1植物乳酸桿菌化學(xué)誘變?nèi)樗釛U菌(L)是吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室從自然發(fā)酵酸牛奶中分離，經(jīng)16sRNA鑒定為植物乳酸桿菌plantarum)0由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。I)似活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的可培養(yǎng)乳桿菌MVR株的獲得。實(shí)驗(yàn)組取5XIO8個/ml的乳酸桿菌(L)菌體懸浮液lml，加入100μINTG(lmg/ml)，充分混合后，在30°C條件下作用30min，反應(yīng)結(jié)束后用O.1M磷酸緩沖液[pH7.O]終止反應(yīng)，NTG用量以致死率達(dá)到80%95%為宜。對照組未經(jīng)NTG處理的乳酸桿菌(L)懸浮液。實(shí)驗(yàn)組、對照組的菌液進(jìn)行10倍稀釋，涂布于MRS固體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)。將單菌落接種到100ml的液體MRS中，振蕩培養(yǎng)至0D_接近O.8時，取Iml菌液至pH2.O3.0，MRS液體培養(yǎng)基中，4°C兼性厭氧培養(yǎng)。在VBNC誘導(dǎo)過程中，取經(jīng)NTG和未經(jīng)NTG處理的菌液涂布于固體MRS中，37°C培養(yǎng)，未經(jīng)NTG處理的乳酸桿菌作為對照組在35d內(nèi)可培養(yǎng)菌數(shù)顯著下降，連續(xù)培養(yǎng)3d，無細(xì)菌生長，按專利200810051106.9提供方法檢測，即取待檢菌液50μ1，加入SYT09和PI各25μ1，吹吸混勻，避光染色1520min。然后將經(jīng)墨水染黑的微孔濾膜置于無自發(fā)熒光的載玻片上，吸取適量菌體滴在微孔濾膜上，待液體剛好被濾膜吸干時，在其上蓋上蓋玻片，并用力壓片，使細(xì)菌充分固定在膜上。最后在蓋玻片上滴一滴無自發(fā)熒光的油，用落射熒光顯微鏡于暗室觀察。而熒光顯微鏡觀察全部為呈現(xiàn)綠色熒光的活菌，表明對照組已于第35d進(jìn)入VBNC狀態(tài)。而經(jīng)NTG處理的實(shí)驗(yàn)組的可培養(yǎng)菌數(shù)在整個觀察期內(nèi)一直具備可培養(yǎng)能力。采用AFLP法，對實(shí)驗(yàn)組、對照組的基因組DNA，用MseI和EcoRI兩種酶對對基因組DNA進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物與接頭連接后，依次進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增。選擇性擴(kuò)增的模板是預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，在擴(kuò)增前要對預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物做20倍稀釋，最后選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物用8%中性聚丙烯酰胺凝膠EB染色檢測。圖1可見每條泳道上隨機(jī)分布的清晰條帶，而且條帶數(shù)目適中，譜帶質(zhì)量較高，產(chǎn)物多集中在50bp750bp。而且實(shí)驗(yàn)組與對照組間存在多條差異條帶，說明兩者基因組DNA存在多態(tài)性。由此證明乳酸桿菌在NTG誘變后，其基因組發(fā)生了突變。實(shí)驗(yàn)組中獲得經(jīng)NTG處理的VBNC乳酸桿菌突變體，命名為似活的非可培養(yǎng)狀態(tài)可培養(yǎng)乳桿菌MVR株，已于2012年9月18日，送至中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCCNo.6579ο實(shí)施例2飼喂似活的非可培養(yǎng)狀態(tài)可培養(yǎng)乳酸桿菌MVR株，對斷奶仔豬的影響試驗(yàn)動物分組將斷奶仔豬隨機(jī)分為1、2、3、4四組。其中，I組飼喂VBNC乳酸桿菌突變體，2組飼喂VBNC乳酸桿菌，3組飼喂乳酸桿菌，4組為空白對照。I3組按每克飼料中含IO9個CFU活菌數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)添加至飼料中，采取分圈和自由采食的方式飼養(yǎng)。每天飼喂3次，試驗(yàn)周期為7d。飼養(yǎng)7d后，停止飼喂各實(shí)驗(yàn)菌株，仍按每克飼料中含IO9個CFU活菌數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)加入大腸桿菌，每天觀察各組腹瀉情況。出現(xiàn)腹瀉后次日，按上述設(shè)計(jì)繼續(xù)飼喂7d。在整個試驗(yàn)周期內(nèi)，每隔2d早晨空腹稱重，以每個重復(fù)為單位，計(jì)算各組平均日增重(ADG)，同時每天觀察仔豬的精神狀態(tài)、腹瀉等情況。DVBNC乳酸菌及其突變體對斷奶仔豬生長性能的影響將12只斷奶仔豬隨機(jī)分組后于第2d開始稱重，動物體重總體呈增長趨勢，但3，4組在第18d體重下降。圖2顯示，第I組仔豬平均體重高于其它3組，特別是在第6d后體重迅速增加。而且在第7d攻入大腸桿菌后，4個組的體重仍在增長，其中I組體重增長率最高。通過對動物精神狀態(tài)及腹瀉等情況觀察，I組動物活潑好動，腹瀉于第12d最晚出現(xiàn)，而且只表現(xiàn)為輕度；2組于第IOd出現(xiàn)腹瀉，為輕度；3、4組均于第9d出現(xiàn)重度腹瀉。上述結(jié)果表明，VBNC乳酸桿菌突變體對攻菌前動物機(jī)體有一定的調(diào)節(jié)效果。當(dāng)腹瀉后再次飼喂不同處理的乳酸桿菌時，1，2組動物體重略有增長，但3，4組卻在調(diào)整后期出現(xiàn)體重下降情況，這可能因腹瀉導(dǎo)致食欲下降有關(guān)。但從整體動物體重變化情況看，只有I組與對照組相比差異顯著0°〈0.05)，表明應(yīng)用VBNC乳酸桿菌突變體，即似活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的可培養(yǎng)乳桿菌MVR株，可明顯促進(jìn)斷奶仔豬增重。2)VBNC乳酸菌及其突變體對斷奶仔豬外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率測定仔豬前腔靜脈無菌采血，肝素鈉抗凝。用淋巴細(xì)胞分離液小心將淋巴細(xì)胞提取出來。用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5XIO5個/ml，然后加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞懸液分裝3n個孔，200μI/孔，其中3(η_1)個孔加入不同濃度的ConA(5μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、200μg/ml),另3個孔不加ConA作為對照。置5%0)2，371培養(yǎng)48117211，于培養(yǎng)結(jié)束前411611在各孔內(nèi)加入1(^1MTT(5mg/ml)，37°C培養(yǎng)4h6h，立即測定無需終止反應(yīng)，最后用酶標(biāo)儀測定570nm下的OD值，并根據(jù)OD值計(jì)算刺激指數(shù)(SI)。實(shí)驗(yàn)設(shè)立了5組ConA濃度(5μg/ml、10μg/ml、100μg/ml>200μg/ml),并同時對仔豬外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行刺激。由表2可知，組別的F=7.685，P=Q.04<0.05，差異顯著；而ConA濃度的F=14.015，P=Q.00<0.01，差異極顯著。說明不同組別和不同ConA濃度對淋巴細(xì)胞的增殖均存在顯著影響，有必要進(jìn)一步對組別及ConA濃度兩因素不同水平的均值進(jìn)行多重比較。而校正模型對應(yīng)的F=Il.302,/^=0.00<0.01，表明所用分析模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因而由表3可知，I組與4組間差異極顯著0°〈0.01)，而與3組差異顯著(7X0.05)。另外，2組與4組亦存在顯著差異G°〈0.05)。上述結(jié)果表明，飼喂VBNC乳酸桿菌突變體和VBNC乳酸桿菌的仔豬淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率高，均比正常機(jī)體獲得了較高的細(xì)胞免疫能力，兩者均對斷奶仔豬免疫機(jī)能具有促進(jìn)作用。當(dāng)ConA濃度達(dá)到200μg/ml時,對每組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響極顯著0°〈0.01)，故而此濃度即為最適濃度，可以用于斷奶仔豬的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中。3)VBNC乳酸菌及其突變體對斷奶仔豬外周血細(xì)胞因子濃度的影響外周血中細(xì)胞因子濃度監(jiān)測采集第一次飼喂期、`攻菌期、腹瀉期，以及第二次飼喂期的豬血，分離血清。用ELISA方法檢測血清中TNF-α、IL-10等細(xì)胞因子的含量，具體操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行，每個樣品做2個復(fù)孔。按繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，換算出各樣品中相應(yīng)細(xì)胞因子的濃度。經(jīng)單因素ANOVA方差分析，4個組動物體內(nèi)的IL-10含量在不同時期內(nèi)均不存在顯著差異0°>0.05)，盡管在機(jī)體遭受外來抗原時，各組IL-10含量有所起伏，但對整體免疫機(jī)能的影響不顯著(圖3)，這說明不同處理的乳酸桿菌均未能通過刺激機(jī)體產(chǎn)生抗炎因子IL-10的方式來提高免疫機(jī)能。而從TNF-α含量及變化卻明顯看出(圖4)，I組的TNF-a量始終低于對照組(4組)，特別是在病原感染時，與對照組存顯著差異(/X0.05)，說明VBNC乳酸桿菌突變體能夠有效抑制機(jī)體產(chǎn)生腫瘤壞死因子，降低了機(jī)體遭遇炎癥的風(fēng)險，因?yàn)門NF-α是一種致炎性細(xì)胞因子。2組的TNF-a量除在第一次飼喂期內(nèi)其含量與對照組持平外，在其它3個時期內(nèi)均低于對照組，特別是在腹瀉期與第二次飼喂期內(nèi)，顯著低于對照組(/X0.05)，說明VBNC乳酸菌同樣具有抑制腫瘤壞死因子產(chǎn)生的作用，但它可以保護(hù)整個機(jī)體免遭炎性的效果尚需經(jīng)過長期多次飼喂才能顯現(xiàn)出來。相比之下，3組的TNF-a含量與對照組無顯著差別，說明未經(jīng)任何處理的乳酸桿菌抑制機(jī)體炎性反應(yīng)的作用不顯著。所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組間比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，多組之間的比較采用單因數(shù)方差分析。顯著性差異水平為P<O.05，極顯著性差異水平為P<O.01。綜合以上分析結(jié)果可知，VBNC乳酸桿菌及其突變體可有效促進(jìn)機(jī)體淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，抑制腫瘤壞死因子，降低炎性反應(yīng)，具有免疫調(diào)節(jié)作用。權(quán)利要求1.似VBNC的可培養(yǎng)乳酸桿菌，保藏編號為CGMCCNo.6579。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的似VBNC的可培養(yǎng)乳酸桿菌，是從自然發(fā)酵酸牛奶中分離出來的植物乳酸桿菌。3.似VBNC的可培養(yǎng)乳酸桿菌的鑒定方法，用常規(guī)的方法誘導(dǎo)乳酸桿菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)，可培養(yǎng)的即為似VBNC的可培養(yǎng)乳酸桿菌；所述的可培養(yǎng)是不經(jīng)過VBNC的復(fù)蘇，用常規(guī)方法既可培養(yǎng)。4.權(quán)利要求1所述的似VBNC的可培養(yǎng)乳酸桿菌作為VBNC細(xì)菌模型用于研究VBNC細(xì)菌的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了似VBNC的可培養(yǎng)乳酸桿菌，是新近研究發(fā)現(xiàn)的又一種活的細(xì)菌存在形式，是VBNC細(xì)菌突變體，在進(jìn)入VBNC狀態(tài)后，具備了VBNC細(xì)菌相關(guān)基因，不經(jīng)過細(xì)菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的復(fù)蘇方法復(fù)蘇，用常規(guī)方法就可培養(yǎng)。其中植物乳桿菌的VBNC細(xì)菌突變體于2012年9月18日保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心。彌補(bǔ)了VBNC細(xì)菌不能生長繁殖和無法保存的缺憾；作為VBNC細(xì)菌模型用于研究VBNC的發(fā)生機(jī)制，及以乳酸菌為載體、研制口服疫苗等方面具有廣闊的前景，并對VBNC乳酸桿菌及其突變體對斷奶仔豬的免疫學(xué)活性進(jìn)行測定，從而為進(jìn)一步研制新型豬用微生態(tài)制劑奠定基礎(chǔ)。文檔編號C12N1/20GK103031259SQ20121040381公開日2013年4月10日申請日期2012年10月22日優(yōu)先權(quán)日2012年10月22日發(fā)明者李影,錢愛東,段銳,段冶,王立新,張宇申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)