專利名稱：中堿性纖維素酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到生物遺傳領(lǐng)域，具體涉及一種來源于深海真菌Phaeosphaeriasp. LH21的中堿性纖維素酶及其制備方法。
背景技術(shù)：
1904年Seiliere首次發(fā)現(xiàn)蝸牛消化液存在纖維素酶，它是由多種組分構(gòu)成，是能有效水解纖維素及其衍生物的一組酶的總稱。根據(jù)纖維素酶的作用位點分為三類。(I)內(nèi)切-β-1，4_葡萄糖苷酶，也稱羧甲基纖維素酶(endo-1， 4-β—D-glucanase,EC 3.2. I.4,簡稱EG)。它能水解可溶性纖維素,也可作用于無定形纖維素，隨機切斷纖維素內(nèi)部分子鏈β -1，4鍵，但不能分解排列整齊的結(jié)晶纖維素。(2)外切_β-1,4-葡萄糖苷酶,也稱纖維二糖水解酶(θχο-1,4_β-D-glucanase,EC3. 2. I. 91，簡稱CBH)。它不能水解可溶性纖維素，但可作用于結(jié)晶纖維素，進(jìn)攻纖維素還原性末端或非還原性末端，每次作用生成纖維二糖及纖維糊精，扮演著自然界纖維素降解的主要角色。(3) β-1,4-葡萄糖苷酶，也稱纖維二糖酶(β-1,4-D-glucosidase, EC3.2. I. 21，簡稱BG)。經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的β-1，4-葡萄糖苷酶，可分泌于胞外，也存在于胞內(nèi)，作用底物是纖維二糖及纖維寡糖，最終生成D-葡萄糖。人們對纖維素酶做了大量的研究，特別是針對里氏木霉等木霉屬真菌纖維素酶的研究更是達(dá)到登峰造極的程度，克隆了其基因，構(gòu)建里氏木霉表達(dá)體系，優(yōu)化了發(fā)酵條件，達(dá)到了纖維素酶的最高產(chǎn)，但是對于真菌來說所產(chǎn)生的纖維素酶主要是酸性的，這限制了其在堿性條件下的應(yīng)用，比如紡織、洗滌等行業(yè)的應(yīng)用。紡織行業(yè)是中國傳統(tǒng)支柱產(chǎn)業(yè)，占國民經(jīng)濟的比例很大，其中纖維素酶在起花、拋光、除毛的應(yīng)用很早就已經(jīng)開始，主要由酸性纖維素酶負(fù)責(zé)，但因酸性纖維素酶對布料處理非常劇烈，工藝不易控制，返染現(xiàn)象嚴(yán)重，重復(fù)性差，正逐步被中堿性內(nèi)切纖維素酶所代替。市場上中性內(nèi)切纖維素酶的價格一直是酸性纖維素酶的四五倍，且全部由國際酶制劑生產(chǎn)巨頭公司所壟斷，比如，諾維信和杰能科，市場上流通的中性內(nèi)切纖維素酶，由國內(nèi)一些企業(yè)用上述公司所提供的原酶進(jìn)行復(fù)配而得，導(dǎo)致國內(nèi)企業(yè)利潤空間壓縮。堿性纖維素酶可應(yīng)用于洗滌劑行業(yè)，將此酶以適當(dāng)?shù)谋壤c洗滌劑中混合，將明顯提高洗滌效果，可以減少洗滌劑的用量，降低對環(huán)境的污染，是洗滌劑行業(yè)應(yīng)用的趨勢。堿性內(nèi)切纖維素酶能夠作用于非結(jié)晶區(qū)而去除內(nèi)部的污物、皮脂等。至今發(fā)現(xiàn)的堿性纖維素酶絕大多數(shù)來源于芽孢桿菌，還有來源于特異腐質(zhì)霉。除了上述的兩個應(yīng)用外，纖維素酶已經(jīng)在食品、飼料、造紙、化工、釀造、石油、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等行業(yè)得到了應(yīng)用。國內(nèi)在產(chǎn)中堿性纖維素酶菌的篩選有較多的研究，但是涉及到分子水平的研究較少，以我們所知，中堿性纖維素酶基因序列及氨基酸序列的報道更是少見
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種中堿性纖維素酶及其制備方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案一種中堿性纖維素酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。 上述中堿性纖維素酶基因，其中，所述的纖維素酶基因編碼的多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示。一種上述纖維素酶基因的編碼多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。上述的編碼多肽，其中，所述的編碼多肽在中堿性條件下具有纖維素酶活性。一種中堿性纖維素酶的制備方法，包括以下步驟I)由深海真菌Phaeosphaeria sp. LH21培養(yǎng)分離出中堿性纖維素酶基因，該基因具有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列；2)將基因克隆到表達(dá)載體pPIC9K中；3)將構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到宿主細(xì)胞，生產(chǎn)中堿性纖維素酶的基因工程菌；4)培養(yǎng)基因工程菌，獲得中堿性纖維素酶。上述中堿性纖維素酶的制備方法，其中，所述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，原核細(xì)胞包括大腸桿菌、枯草桿菌、鏈霉菌、或分支桿菌；真核細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、里氏木霉、黑曲霉、米曲霉或各種動植物細(xì)胞。本發(fā)明以Phaeosphaeria sp. LH21菌基因組為基礎(chǔ)，利用同源性搜索得到保守性氨基酸片段，設(shè)計簡并性引物得到中間序列，用基因組走讀擴增兩端未知序列，反轉(zhuǎn)錄PCR擴增該基因，然后克隆到表達(dá)載體pPIC9K中，并在畢赤酵母GS115中獲得表達(dá)。通過Genbank同源搜索和蛋白質(zhì)功能研究表明，該基因是一個編碼中堿性纖維素酶的基因序列。該基因能在任何宿主細(xì)胞中表達(dá)具有生物活生功能中堿性纖維素酶。在本發(fā)明中，“中堿性纖維素酶基因”指編碼的纖維素酶在中性pH和堿性pH條件下可以表現(xiàn)出最大活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列及其簡并密碼子所產(chǎn)生的序列。由已知密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO. I核苷酸序列同源性小于70%的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO. 2所述的氨基酸序列，還包括核苷酸雜交的核苷酸序列。還可包括同源性至少70%，直到至少95%的核苷酸序列。在本發(fā)明中，“中堿性纖維素酶”指在中堿性pH條件下具有纖維素酶活性的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。該術(shù)語還包括SEQ ID NO. 2序列的突變體，這些突變體具有與天然中堿性纖維素酶相同的功能。這些突變體包括若干個氨基酸的缺失，插入和/或取代，以及在兩端添加一個、數(shù)個或一段氨基酸片段，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異。例如，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在兩端添加一個、數(shù)個或一段氨基酸也不影響酶的功能。該術(shù)語還包括中堿性纖維素酶的活性片段和活性衍生物。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，比如市場上流通的質(zhì)粒。在生產(chǎn)本發(fā)明的中堿性纖維素酶時，可以將中堿性纖維素酶基因編碼序列連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成中堿性纖維素酶表達(dá)載體。表達(dá)載體含有復(fù)制起始點、啟動子、增強子和必要的加工信息位點。表達(dá)載體還必須含有可拱選擇的標(biāo)記基因，比如提供卡那霉素，氨芐表霉素，氨甲蝶呤等抗生素或其他毒性物質(zhì)的抗性蛋白質(zhì)；互補營養(yǎng)缺陷型蛋白質(zhì)；提供復(fù)合培養(yǎng)基中沒有的必需營養(yǎng)成分的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，術(shù)語宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核細(xì)胞如大腸桿菌、枯草桿菌、鏈霉菌、分支桿菌等。常用的真核細(xì)胞如酵母細(xì)胞、里氏木霉、黑曲霉、米曲霉等，或各種動植物細(xì)胞。本發(fā)明的中堿性纖維素酶基因開放閱讀框序列或其片段通常可以用PCR擴增法，重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列來設(shè)計引物，用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法制備，以Phaeosphaeria sp.全基因組DNA為模板，擴增而得到相關(guān)序列。當(dāng)獲得相關(guān)序列時，就可將其克隆至相關(guān)載體，再轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從擴繁后的宿主細(xì)胞中得到大批量的相關(guān)序列。
具體實施方式
下面通過實施例對本發(fā)明作詳細(xì)描述I)中堿性纖維素酶基因的克隆首先培養(yǎng)Phaeosphaeria sp. LH21,培養(yǎng)方法按PDA的培養(yǎng)基，按Sambrook等的方法提取基因組DNA。根據(jù)P.nodorum SN15基因組測序信息，以其基因登錄號NW_001884559的序列進(jìn)行同源搜索，找出保守的同源片段，設(shè)計簡并性引物5，-TWYTGGGACTGCTGTAAACC-3’ and 5’ -GGACATASRACGCGYTTGAA-3，，擴增中間序列，通過三輪的基因組走讀，擴增兩側(cè)未知序列，拼接全長序列，通過ORFfinder軟件預(yù)測開放閱讀框，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR擴增到了預(yù)計的目的片段，驗證是正確的。2)中堿性纖維素酶的制備上述獲得的中堿性纖維素酶基因通過SignalP3. O軟件預(yù)測信號肽，去除信號肽，在上游引物引入Not I位點，下游引物引入EcoR I，插入到pPIC9K中，再電轉(zhuǎn)到畢赤酵母GS115中，篩選能夠表達(dá)中堿性纖維素酶的基因工程菌。具體操作如下 a、挑取 GSl 15-pPIC9k-cel-l 單克隆，接種至 25mlBMGY 中(250ml 搖瓶)，28 °C，250rpm,大約 18h。b、室溫3000g離心5min，收集細(xì)胞，去除上清，用BMMY重懸細(xì)胞至100ml，進(jìn)行誘
導(dǎo)表達(dá)。C、在IL搖瓶中加入上述培養(yǎng)物，加蓋兩層滅菌紗布或干酪包布，放入搖床繼續(xù)生長。d、每24小時，加甲醇至終濃度為O. 5%以繼續(xù)誘導(dǎo)。e、通過DNS法測定重組中堿性纖維素酶。f、SDS-PAGE鑒定分子量大小。序列表〈110〉華東理工大學(xué)<120>中堿性纖維素酶及其制備方法<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>權(quán)利要求
1.一種中堿性纖維素酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述中堿性纖維素酶基因，其特征在于所述的纖維素酶基因編碼的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求I所述的纖維素酶基因的編碼多肽，其特征在于其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的編碼多肽，其特征在于所述的編碼多肽在中堿性條件下具有纖維素酶活性。
5.一種中堿性纖維素酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)由深海真菌Phaeosphaeriasp. LH21培養(yǎng)分離出中堿性纖維素酶基因，該基因具有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列； 2)將基因克隆到表達(dá)載體PPIC9K中； 3)將構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到宿主細(xì)胞，生產(chǎn)中堿性纖維素酶的基因工程菌； 4)培養(yǎng)基因工程菌，獲得中堿性纖維素酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述中堿性纖維素酶的制備方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，原核細(xì)胞包括大腸桿菌、枯草桿菌、鏈霉菌、或分支桿菌；真核細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、里氏木霉、黑曲霉、米曲霉或各種動植物細(xì)胞。
全文摘要
一種中堿性纖維素酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，上述中堿性纖維素酶基因的編碼多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明以Phaeosphaeria sp.LH21基因組為基礎(chǔ)，通過基因組走讀和反轉(zhuǎn)錄PCR克隆到了中堿性纖維素酶基因。該基因能在含有中堿性纖維素酶的轉(zhuǎn)基因生物中表達(dá)，回收獲得該基因編碼的纖維素酶有生物功能活性。本發(fā)明中的中堿性纖維素酶在中堿性條件下具有纖維素酶活性，可廣泛用于基因克隆，基因診斷，紡織行業(yè)，洗滌行業(yè)，石油工業(yè)等領(lǐng)域。
文檔編號C12N9/42GK102911953SQ201210396178
公開日2013年2月6日 申請日期2012年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月17日
發(fā)明者魏東芝, 趙喜華, 王瑋 申請人:華東理工大學(xué)