專利名稱：一種脫氮副球菌的培養(yǎng)方法及其在養(yǎng)殖水質(zhì)凈化中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種脫氮副球菌的培養(yǎng)方法及其在養(yǎng)殖水質(zhì)凈化中的應用，屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來，我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大。人們?yōu)榱俗非蟾弋a(chǎn)、高效，往往在養(yǎng)殖水體中投入大量的富含氮素等營養(yǎng)物質(zhì)的餌料和肥料，導致養(yǎng)殖水體中無機氮(NH4+-N、NCV-N、N(V-N)的過度積累，影響水體生態(tài)環(huán)境質(zhì)量。無機氮中的亞硝態(tài)氮是致癌物質(zhì)，能導致細胞及組織癌變，而且可以氧化水生動物體內(nèi)的亞鐵血紅蛋白(Fe2+)生成高鐵血紅蛋白(Fe3+)，使其失去攜帶氧分子的能力，從而影響水生動物體內(nèi)氧的運輸，使紅細胞變性，造成生物死亡；硝態(tài)氮過量會使水體中的營養(yǎng)平衡失調(diào)，水環(huán)境質(zhì)量降低，并且 在局部厭氧條件下可轉(zhuǎn)化成亞硝態(tài)氮。而氨氮在有氧條件下可通過亞硝化和硝化作用生成亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮。因此對于養(yǎng)殖水體而言，為了保證養(yǎng)殖生物的質(zhì)量與安全，必須將無機氮素特別是亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮的含量控制在合理的范圍內(nèi)。水體中硝態(tài)氮與亞硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化和去除主要是通過微生物的同化吸收和反硝化作用而實現(xiàn)。一般認為反硝化細菌是異養(yǎng)性兼性厭氧細菌，只有在缺氧條件下才以硝酸鹽或亞硝酸鹽為電子受體，進行反硝化作用。隨著研究的深入，好氧反硝化細菌的發(fā)現(xiàn)，表明在有氧條件下也可進行反硝化作用。好氧反硝化細菌的發(fā)現(xiàn)對養(yǎng)殖水體的環(huán)境控制來說是一個福音，因為養(yǎng)殖水體需要充足的溶氧作保證，而在有氧條件下實現(xiàn)脫氮無疑為養(yǎng)殖水體的氮素控制提供了一條良好的途徑。近年來，國內(nèi)外學者開始在好氧反硝化細菌的分離、鑒定、培養(yǎng)和應用等方面進行了一些研究，證實了脫氮副球菌可以在好氧條件下進行反硝化作用。同時脫氮副球菌又是一種兼性化能無機自養(yǎng)細菌，既能在h2、o2、co2同時存在的情況下進行自養(yǎng)生長，也能利用利用各種糖類、氨基酸等有機物進行異養(yǎng)生長，因此，它是在不同條件(好氧或厭氧，自養(yǎng)或異養(yǎng))下實現(xiàn)氮轉(zhuǎn)化作用的非常好的一種菌株。養(yǎng)殖水體環(huán)境的優(yōu)劣決定了養(yǎng)殖水體的生態(tài)環(huán)境質(zhì)量。養(yǎng)殖水體中濃度過高的三氮(氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮)對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物及環(huán)境危害巨大。目前的養(yǎng)殖水體脫氮改良劑主要分為化學和生物兩大類?；瘜W類改良劑作用快速，效果直觀，用量較小，但作用對象單一，持續(xù)時間短，且往往存在生態(tài)不安全性，治標不治本；生物類環(huán)境改良劑主要以芽孢桿菌、EM菌等微生物制劑為主，安全有效，但起效時間慢、用量較大，且效果受環(huán)境條件影響而不穩(wěn)定。因此在養(yǎng)殖水環(huán)境的氮素污染控制上急需開發(fā)一種生產(chǎn)簡單、成本低、具有脫氮效果不受水體環(huán)境條件影響的新型微生物類環(huán)境改良劑，以滿足產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需要。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種脫氮副球菌的培養(yǎng)及在養(yǎng)殖水質(zhì)凈化中的應用方法，利用糖蜜、味精廢液等作為培養(yǎng)基，經(jīng)液體深層發(fā)酵培養(yǎng)高活性的脫氮副球菌的菌液。菌液直接投入養(yǎng)殖水體，在不同的溶解氧條件下可有針對性地去除或轉(zhuǎn)化氨氮、亞硝態(tài)氮或硝態(tài)氮，控制水體環(huán)境中對養(yǎng)殖生物有害的無機氮素成份，快速修復養(yǎng)殖水體生態(tài)環(huán)境，為水產(chǎn)養(yǎng)殖生物營造一個良好的水體環(huán)境。按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案，一種脫氮副球菌的培養(yǎng)方法，培養(yǎng)步驟如下取脫氮副球菌Paracoccus denitrificans, ACCC10489,來自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；接種到2(Tl00mL滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，于28 35°C、8(Tl50 r .mirT1搖床上培養(yǎng)20 30h ；然后將其接入3飛OL經(jīng)滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，于28 35°C、8(Tl50 r · min—1搖床上培養(yǎng)2(T30h，制成菌種種子液備用；
在O. 5^1. O噸不銹鋼發(fā)酵罐中加入菌種種子液總體積65°/Γ75%的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)115 121°C滅菌15 30min后冷卻備用；將上述菌種種子液接入發(fā)酵罐，在28 35°C、溶氧含量為20% 30%飽和含量的條件下培養(yǎng)24 30h，待菌液濃度> IO9CFU · mL—1時用磷酸調(diào)pH值為4飛后放入經(jīng)滅菌的1 25L桶中備用。所述的LB液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)富集培養(yǎng)基，含蛋白胨5 15 8*171，酵母膏3 8 g · L-1, NaCl 5 15 g.L—1，調(diào)節(jié) pH 6. 5-7. 5，經(jīng) 115 121°C滅菌 15 30min 后冷卻備用。所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，其組份比例按重量份數(shù)計糖分含量> 50%的糖蜜8 15份，味精廢液 4 10 份，MgSO4-7H20 O. ΟΓΟ. I 份，K2HPO4 I. (Tl. 5 份，KH2PO4 O. 2 O. 8 份，水78 88份；
于室溫下在發(fā)酵罐中溶解混合，調(diào)節(jié)糖蜜和味精廢液的比例，使得溶液C/N摩爾比達到10 15 1，并用NaOH或HCl調(diào)節(jié)溶液pH值至7. 2 7. 5，115 121°C滅菌，冷卻后備用。所述味精廢液COD 為 10000^100000 mg · Λ TN 為 5000^20000 mg · L'所述菌種種子液的OD6tltl值為O. 8 I. 2，活菌數(shù)為I X IO8 9 X IOiciCFU · mL—1。一種脫氮副球菌在養(yǎng)殖水質(zhì)凈化中的應用方法，采用以下步驟將菌濃度為I X IO8 9 X IO10CFU · mL—1脫氮副球菌菌液，按500 1500 mL ·畝·米水深―1的用量于上午9^11時加入到待進化的養(yǎng)殖水體中；根據(jù)實際情況，每隔5 10天使用一次。使用效果與無機氮素去除順序與水體溶氧有關(guān)。水體溶氧> 6. Omg · ΙΛ使用后7^8小時開始起作用，氨氮最先開始下降，然后亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮開始下降。使用后12小時氨氮含量降低70%以上，16小時硝態(tài)氮含量降低70%以上,22小時后亞硝態(tài)氮含量降低70%以上；3. O mg · Γ1彡水體溶氧彡6.0 mg* Γ1時，使用后1(Γ 2小時開始起作用，硝態(tài)氮最先開始下降，然后亞硝態(tài)氮和氨氮開始下降。使用后20小時硝態(tài)氮含量降低70%以上，40小時后亞硝態(tài)氮含量降低70%以上，60小時氨氮含量降低70%以上；0 mg · Γ1彡水體溶氧^3.0 mg* Γ1時，使用后24小時開始起作用，硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮同時開始下降，然后氨氮降。使用后60小時硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮含量降低70%以上，120小時后氨氮含量降低70%以上。本發(fā)明具有如下優(yōu)點本發(fā)明采用對水產(chǎn)養(yǎng)殖生物和脫氮副球菌無害的糖蜜、味精廢液等多種低價值材料和生產(chǎn)廢棄物為原料，經(jīng)合理復配成液體培養(yǎng)基并采用液體深層發(fā)酵的方法生產(chǎn)高活性高濃度的脫氮副球菌菌液，并將菌液直接投入養(yǎng)殖水體，在不同的溶氧條件下有序地選擇性地快速降低養(yǎng)殖水環(huán)境中的氨氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮等無機氮素的污染，修復養(yǎng)殖水體生態(tài)環(huán)境，為水產(chǎn)養(yǎng)殖生物營造一個有利于生存和生長的良好水體環(huán)境。本發(fā)明以味精廢液作為液體培養(yǎng)基的主要成分，成本低，使用方便，實現(xiàn)了污水資源化，減少了污染；所生產(chǎn)的脫氮副球菌濃度高，活性強，使用方便，可直接投入養(yǎng)殖水體，使用量小，每畝水面每米水深的用量僅為50(Tl500mL ;使用后見效快且效果穩(wěn)定，可根據(jù)水體溶氧情況選擇所需去除的無機氮素形式和去除速率，顯著降低水體中氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽等有害物質(zhì)的含量，降低藻類密度，改善水質(zhì)和底質(zhì)的環(huán)境質(zhì)量，改善養(yǎng)殖生物生存條件，有效防止養(yǎng)殖生物病害和突發(fā)性死亡，提高養(yǎng)殖生物的產(chǎn)量和質(zhì)量。生物材料樣品所使用的菌株脫氮副球菌，見中國微生物菌種總目錄中農(nóng)業(yè)微生物菌種，其保藏編號為10489，已公開，取自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，見實質(zhì)審查參考資料。
具體實施例方式下面本發(fā)明將結(jié)合實施例作進一步描述其所述的不銹鋼發(fā)酵罐為常規(guī)設(shè)備，在市場上購買，無任何特殊要求，采用通常的加工方法。實施例I 本發(fā)明一種脫氮副球菌的培養(yǎng)及在養(yǎng)殖水質(zhì)凈化中的應用方法，采用以下工藝步驟 (I)脫氮副球菌的培養(yǎng)
從試管斜面上取一環(huán)脫氮副球菌CParacocciAs deni tri fi cans, ACCC10489,由中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供)菌苔，接種到50mL滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，于30 V、100 r · HiirT1搖床上培養(yǎng)24h。然后將其接入5L經(jīng)滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，于30 0CUOOr ^mirT1搖床上培養(yǎng)24h，制成菌種種子液備用。此時菌液的OD6c 值約等于1.0，活菌數(shù)^ IO9CFU · mL'在O. 5噸不銹鋼發(fā)酵罐中加入總體積350L的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)121°C滅菌20min后冷卻備用。將上述菌種種子液接入發(fā)酵罐，在30°C、溶氧含量為20%飽和含量的條件下培養(yǎng)24小時，待菌液濃度彡IO9CFU · ml/1時用磷酸調(diào)pH值為4. 5后放入經(jīng)滅菌的25L桶中備用。所述的LB液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)富集培養(yǎng)基，含蛋白胨10 g·!/1，酵母膏5 g · L_SNaCl 10 g·!/1，調(diào)節(jié)pH 7. O左右，經(jīng)121°C滅菌20min后冷卻備用。所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，其組份比例按重量份數(shù)計糖蜜(糖分含量> 50%)12份，味精廢液(C0D 彡 80000mg · Λ TN 彡 16000mg · L-1) 8 份，MgSO4-7H20 O. 01 份，K2HPO4 I. O份，KH2PO4 O. 5份，水84. 49份，于室溫下在發(fā)酵罐中溶解混合，調(diào)節(jié)糖蜜和味精廢液的比例，使得溶液C/N摩爾比達到10，并用NaOH或HCl調(diào)節(jié)溶液pH值至7. 2，121°C滅菌，冷卻后備用。本發(fā)明中各組分的作用原理如下
I)脫氮副球菌脫氮副球菌deni tri fi cans )屬于變形菌門{Proteobacteria)、甲型變形菌綱(Alphaproteobacterid)、紅細菌目{Rhodobacterales)、紅細菌科{Rhodobacteraceae)、副球菌屬(Peireicoccus),是一種革蘭氏陰性菌，球狀或短桿狀成簇，不運動。菌落直徑大小約2-3_，圓形、邊緣完整、平滑、白色不透明。它可在溫度5^37°C, ρΗ7. (Γ8. 5范圍內(nèi)生長，最適生長溫度為25 35°C，最適pH為7. 5左右。它們生活在好氧或厭氧環(huán)境中，適應性強，常見于土壤以及自然或人工的湖泊或海洋中。脫氮副球菌可以在好氧條件下進行反硝化作用，同時又是一種兼性化能無機自養(yǎng)細菌。既能在H2、02、CO2同時存在的情況下進行自養(yǎng)生長，也能利用各種糖類、氨基酸等有機物進行異養(yǎng)生長。另外對有機污染物具有很高的降解能力。本發(fā)明主要將其作為菌種來生產(chǎn)菌液，利用其具有的異養(yǎng)硝化和好氧反硝化能力，實現(xiàn)在溶氧變化較大的條件下有效治理水產(chǎn)養(yǎng)殖水體的無機氮素污染。2)糖蜜糖蜜是制糖工業(yè)的副產(chǎn)品，是一種粘稠、黑褐色、呈半流動的物體，組成因制糖原料、加工條件的不同而有差異，其中主要含有大量可發(fā)酵糖(主要是蔗糖)，因而是很好的發(fā)酵原料，可用作酵母、味精、有機酸等發(fā)酵制品的底物或基料，可用作某些食品的原料和動物飼料。糖蜜產(chǎn)量較大的有甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、葡萄糖蜜、玉米糖蜜，產(chǎn)量較小的有轉(zhuǎn)化糖蜜和精制糖蜜。糖蜜含有少量粗蛋白質(zhì)，一般為39Γ6%，多屬于非蛋白氮類，如氨、酰胺及硝酸鹽等，而氨基酸態(tài)氮僅占389Γ50%，且非必需氨基酸如天門冬氨酸、谷氨酸含量較多，因此蛋白質(zhì)生物學價值較低，但天門冬氨酸和谷氨酸均為呈味氨基酸，故用于動物飼料中可大大刺激動物食欲。糖蜜的主要成分為糖類，甘蔗糖蜜含蔗糖約249Γ36%，其他糖約12°/Γ24% ;甜菜糖蜜所含糖類幾乎全為蔗糖，約47%之多。此外還含有3°/Γ4%的可溶性膠體，主要為木糖膠、阿拉伯糖膠和果膠等。糖蜜的礦物質(zhì)含量較高，約89TlO%，但鈣、磷含量不高，甘蔗糖蜜又高于甜菜糖蜜。礦物元素中鉀、氯、鈉、鎂含量高，因此糖蜜具有輕瀉性。一般糖蜜維生素含量低，但甘蔗糖蜜中泛酸含量較高，達37mg · kg_\此外生物素含量也很可 觀。將提純的甘蔗汁或甜菜汁蒸濃至帶有晶體的糖膏，用離心機分出結(jié)晶糖后所余的母液，口q“蜜糖”。這種第一糖蜜中還含有多量蔗糖，可重復上法而得是第二、第三糖蜜等。最后得到一種母液，無法再蒸濃結(jié)晶，稱廢糖蜜。一般單稱糖蜜指的就是廢糧蜜，可用作食物或飼料，也可用于發(fā)酵工業(yè)的原料。本發(fā)明利用其所含糖分作為微生物生長的碳源。3)味精廢液味精廢液作為一種食品工業(yè)的廢水，是一種高濃度的有機廢水，具有酸性強、聞C0D、聞B0D、聞硫酸根、聞菌體含量、不含重金屬等有毒物質(zhì)的特點，屬有害無毒廢水。其高C0D、高BOD的主要原因是谷氨酸、殘?zhí)恰S與氨氮所致。廢液中總氮為O. 8%
I.0%，其中優(yōu)質(zhì)氮源氨態(tài)氮占80%，還含殘?zhí)?、有機酸、磷、鎂、鉀等營養(yǎng)物質(zhì)。如不經(jīng)處理直接排放，會引發(fā)環(huán)境問題，破壞生態(tài)平衡。但可用于微生物、藻類的異養(yǎng)培養(yǎng)生產(chǎn)中提供氮源等營養(yǎng)成分。本發(fā)明主要利用其所含碳氮作為微生物生長的碳源和氮源。4)硫酸鎂硫酸鎂或七水硫酸鎂，分子式為MgSO4 (或MgSO4 ·7Η20)，又名硫苦、苦鹽、瀉利鹽、瀉鹽，是一種含鎂的化合物。七水硫酸鎂在空氣(干燥)中易風化為粉狀，加熱時逐漸脫去結(jié)晶水變?yōu)闊o水硫酸鎂。鎂在糖和蛋白質(zhì)的代謝中有極其重要的作用。硫酸鎂在農(nóng)業(yè)中被用于一種肥料，因為鎂是葉綠素的主要成分之一。通常被用于盆栽植物或缺鎂的農(nóng)作物。本發(fā)明主要利用其作為微生物生長所需的營養(yǎng)元素。5)磷酸二氫鉀化學式為KH2PO4，分子量為136. 09，為無色結(jié)晶或白色顆粒狀粉末。空氣中穩(wěn)定，在400°C時失去水，變成偏磷酸鹽。工業(yè)上用作緩沖劑、培養(yǎng)劑；也用作細菌培養(yǎng)劑，合成的調(diào)味劑，制偏磷酸鉀的原料，釀造酵母的培養(yǎng)齊 、強化齊 、膨松齊 、發(fā)酵助齊U。本發(fā)明主要利用其作為微生物培養(yǎng)中的緩沖劑，并提供磷和鉀元素。6)磷酸氫二鉀化學式為K2HPO4，外觀為白色結(jié)晶或無定形白色粉末，易溶于水，水溶液呈微堿性，微溶于醇，有吸濕性，溫度較高時自溶。相對密度為2. 338，2040C時分子內(nèi)部脫水轉(zhuǎn)化為焦磷酸鉀。1%水溶液的PH值為8. 9。用于醫(yī)藥，發(fā)酵，細菌培養(yǎng)及制取焦磷酸鉀等。工業(yè)上用作緩沖劑、培養(yǎng)劑；也用作細菌培養(yǎng)劑，制偏磷酸鉀的原料，釀造酵母的培養(yǎng)劑、強化劑、膨松劑、發(fā)酵助劑。本發(fā)明主要利用其作為微生物培養(yǎng)中的緩沖劑和培養(yǎng)劑，提供磷和鉀元素。(2)脫氮副球菌在養(yǎng)殖水質(zhì)凈化中的應用方法
將上述經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)的菌濃度> IO9CFU · ml/1的脫氮副球菌菌液，按1000 mL ·(畝■米水深)―1的用量于8月某天上午10時左右加入到江蘇鹽城的鯽魚養(yǎng)殖池塘，池塘面積20畝，水深I(lǐng). 5米，使用菌液30Kg。試驗期間溶氧含量在4. 8^5. 2 mg · Γ1間。試驗初始氨氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮分別為I. 55,0. 42,0. 36 mg -L^10使用后1(Γ 2小時開始起作用，硝態(tài)氮最先開始下降，然后亞硝態(tài)氮和氨氮開始下降。使用后20小時硝態(tài)氮含量降為O. 09 mg-Γ1,降低75% ；40小時后亞硝態(tài)氮含量降低為O. 10 mg · L \降低76% ；60小時氨氮含量降低至
O.46 mg · I71,降低了 70%。這樣的水質(zhì)情況一直維持了 7天。實施例2 :本發(fā)明一種脫氮副球菌的培養(yǎng)及在養(yǎng)殖水質(zhì)凈化中的應用方法，采用以下工藝步驟·
(I)脫氮副球菌的培養(yǎng)
從試管斜面上取一環(huán)脫氮副球菌CParacocciAs deni tri fi cans, ACCC10489,由中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供)菌苔，接種到IOOmL滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，于35 °C、150 r · miiT1搖床上培養(yǎng)30h。然后將其接入50L經(jīng)滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，于35 °C、150 r · HiirT1搖床上培養(yǎng)30h，制成菌種種子液備用。此時菌液的0D_值約等于I. O,活菌數(shù)彡 IO9CFU · mL'在O. 5噸不銹鋼發(fā)酵罐中加入總體積350L的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)121°C滅菌30min后冷卻備用。將上述菌種種子液接入發(fā)酵罐，在35°C、溶氧含量為25%飽和含量的條件下培養(yǎng)24小時，待菌液濃度彡IO9CFU · ml/1時用磷酸調(diào)pH值為4. 5后放入經(jīng)滅菌的25L桶中備用。所述的LB液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)富集培養(yǎng)基，含蛋白胨10 g·!/1，酵母膏5 g · L—1，NaCl 10 g·!/1，調(diào)節(jié)pH 7. O左右，經(jīng)121°C滅菌20min后冷卻備用。所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，其組份比例按重量份數(shù)計糖蜜(糖分含量> 50%) 10份，味精廢液(C0D 彡 80000mg · Λ TN 彡 16000mg · L-1) 5 份，
MgSO4-7H20 O. 05份，K2HPO4 I. 25份，KH2PO4 O. 6份，水83. 10份，于室溫下在發(fā)酵罐中溶解混合，調(diào)節(jié)糖蜜和味精廢液的比例，使得溶液C/N摩爾比達到11. 2，并用NaOH或HCl調(diào)節(jié)溶液PH值至7. 2，121°C滅菌，冷卻后備用。上述所述的不銹鋼發(fā)酵罐為常規(guī)設(shè)備，在市場上購買，無任何特殊要求，采用通常的加工方法。本發(fā)明所采用的物料也來源方便，均可在市場上購買。(2)脫氮副球菌在養(yǎng)殖水質(zhì)凈化中的應用方法
將上述經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)的菌濃度> IO9CFU · ml/1的脫氮副球菌菌液，按500mL ·(畝■米水深)1的用量于7月某天上午10時左右加入到江蘇鹽城的鯽魚養(yǎng)殖池塘，池塘面積20畝，水深I(lǐng). 5米，使用菌液15Kg。試驗期間溶氧含量在6. O mg · Γ1以上。試驗初始氨氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮分別為I. 72,0. 38,0. 28 mg · L'使用后7 8小時開始起作用，氨氮最先開始下降，然后亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮開始下降。使用后12小時氨氮含量降為O. 35mg · Γ1,降低80% ; 16小時后硝態(tài)氮含量降低為O. 07 mg -Γ1,降低75% ;22小時亞硝態(tài)氮含量降低至O. 08mg · I71,降低了 79%。這樣的水質(zhì)情況一直維持了 5天。實施例3 :本發(fā)明一種脫氮副球菌的培養(yǎng)及在養(yǎng)殖水質(zhì)凈化中的應用方法，采用以下工藝步驟
(I)脫氮副球菌的培養(yǎng)
從試管斜面上取一環(huán)脫氮副球菌CParacocciAs deni tri fi cans, ACCC10489,由中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供)菌苔，接種到50mL滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，于30 V、100 r · HiirT1搖床上培養(yǎng)24h。然后將其接入5L經(jīng)滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，于30 0CUOOr ^mirT1搖床上培養(yǎng)24h，制成菌種種子液備用。此時菌液的OD6c 值約等于1.0，活菌數(shù)^ IO9CFU · mL'在I. O噸不銹鋼發(fā)酵罐中加入總體積700L的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)121°C滅菌20min后冷卻備用。將上述菌種種子液接入發(fā)酵罐，在30 °C、溶氧含量為30%飽和含量的條件下培養(yǎng)24小時，待菌液濃度彡IO9CFU · ml/1時用磷酸調(diào)pH值為4. 5后放入經(jīng)滅菌的25L桶中備用。
所述的LB液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)富集培養(yǎng)基，含蛋白胨10 g·!/1，酵母膏5 g · L—1，NaCl 10 g·!/1，調(diào)節(jié)pH 7. O左右，經(jīng)121°C滅菌20min后冷卻備用。所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，其組份比例按重量份數(shù)計糖蜜(糖分含量> 50%) 13份，味精廢液(C0D 彡 80000mg · Λ TN 彡 16000mg · L-1) 6 份，
MgSO4-7H20 O. 05份，K2HPO4 I. 05份，KH2PO4 O. 3份，水79. 6份，于室溫下在發(fā)酵罐中溶解混合，調(diào)節(jié)糖蜜和味精廢液的比例，使得溶液C/N摩爾比達到11. 7，并用NaOH或HCl調(diào)節(jié)溶液PH值至7. 2，121°C滅菌，冷卻后備用。上述所述的不銹鋼發(fā)酵罐為常規(guī)設(shè)備，在市場上購買，無任何特殊要求，采用通常的加工方法。本發(fā)明所采用的物料也來源方便，均可在市場上購買。(2)脫氮副球菌在養(yǎng)殖水質(zhì)凈化中的應用方法
將上述經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)的菌濃度> IO9CFU mL—1的脫氮副球菌菌液，按1500 mL ·(畝·米水深)―1的用量于6月某天上午10時左右加入到浙江湖州的黑魚養(yǎng)殖池塘，池塘面積15畝，水深I(lǐng). 5米，使用菌液33. 75Kg。試驗時溶氧含量在2. 8^3. I mg -Γ1間。試驗初始氨氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮分別為2. 08、0. 40、0. 27 mg · L'使用后24小時開始起作用，硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮同時開始下降，然后氨氮降。使用后60小時硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮含量均為O. 08 mg-Γ1,降低了 70%和80% ；120小時后氨氮含量至O. 6Img · Γ1,降低了 71%。這樣的水質(zhì)情況一直維持了 5天。
權(quán)利要求
1.一種脫氮副球菌的培養(yǎng)方法，其特征是培養(yǎng)步驟如下取脫氮副球菌denitrificans, ACCC10489,來自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；接種到20 IOOmL滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，于28 35°C、8(Tl50 r · min—1搖床上培養(yǎng)2(T30h ;然后將其接入3 50L經(jīng)滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，于28 35°C、80 150 r .mirT1搖床上培養(yǎng)2(T30h，制成菌種種子液備用； 在O. 5^1. O噸不銹鋼發(fā)酵罐中加入菌種種子液總體積65°/Γ75%的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)115 121°C滅菌15 30min后冷卻備用 ；將上述菌種種子液接入發(fā)酵罐，在28 35°C、溶氧含量為20% 30%飽和含量的條件下培養(yǎng)24 30h，待菌液濃度> IO9CFU · mL—1時用磷酸調(diào)pH值為4飛后放入經(jīng)滅菌的1 25L桶中備用。
2.如權(quán)利要求I所述脫氮副球菌的培養(yǎng)方法，其特征是所述的LB液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)富集培養(yǎng)基，含蛋白胨5 15 g·!/1，酵母膏T8 g-LiNaCl 5^15 g-Γ1，調(diào)節(jié)pH 6. 5-7. 5,經(jīng)115 121°C滅菌15 30min后冷卻備用。
3.如權(quán)利要求I所述脫氮副球菌的培養(yǎng)方法，其特征是所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，其組份比例按重量份數(shù)計糖分含量> 50%的糖蜜8 15份，味精廢液Γ10份，MgSO4-7Η20O.ΟΓΟ. I 份，K2HPO4 I. (Tl. 5 份，KH2PO4 O. 2 O. 8 份，水 78 88 份； 于室溫下在發(fā)酵罐中溶解混合，調(diào)節(jié)糖蜜和味精廢液的比例，使得溶液C/N摩爾比達到10 15 1，并用NaOH或HCl調(diào)節(jié)溶液pH值至7. 2 7. 5，115 121°C滅菌，冷卻后備用。
4.如權(quán)利要求3所述脫氮副球菌的培養(yǎng)方法，其特征是所述味精廢液COD為10000^100000 mg · Λ TN 為 5000^20000 mg · L'
5.如權(quán)利要求I所述脫氮副球菌的培養(yǎng)方法，其特征是所述菌種種子液的OD6tltl值為 O.8 I. 2，活菌數(shù)為 I X IO8 9 X IOiciCFU · mL'
6.一種脫氮副球菌在養(yǎng)殖水質(zhì)凈化中的應用，其特征是采用以下步驟將菌濃度為I X IO8 9 X IOiciCFU · mL—1脫氮副球菌菌液，按50(Tl500 mL ·畝·米水深―1的用量于上午9^11時加入到待進化的養(yǎng)殖水體中；根據(jù)實際情況，每隔5 10天使用一次。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種脫氮副球菌的培養(yǎng)方法及其在養(yǎng)殖水質(zhì)凈化中的應用，屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域。其采用對水產(chǎn)養(yǎng)殖生物和脫氮副球菌無害的糖蜜、味精廢液等多種低價值材料和生產(chǎn)廢棄物為原料，經(jīng)合理復配成液體培養(yǎng)基并生產(chǎn)高活性高濃度的脫氮副球菌菌液，將菌液直接投入養(yǎng)殖水體，修復養(yǎng)殖水體生態(tài)環(huán)境，為水產(chǎn)養(yǎng)殖生物營造一個有利于生存和生長的良好水體環(huán)境。本發(fā)明使用后見效快且效果穩(wěn)定，可根據(jù)水體溶氧情況選擇所需去除的無機氮素形式和去除速率，顯著降低水體中氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽等有害物質(zhì)的含量，改善水環(huán)境質(zhì)量和養(yǎng)殖生物生存條件，提高養(yǎng)殖生物的產(chǎn)量和質(zhì)量。
文檔編號C12N1/20GK102911897SQ20121038311
公開日2013年2月6日 申請日期2012年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月11日
發(fā)明者吳偉, 劉道玉, 王瓊, 瞿建宏 申請人:中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心