專(zhuān)利名稱：快速制備黃單胞菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種快速制備黃單胞菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的方法，用于多種質(zhì)粒的高效轉(zhuǎn)化與染色體基因的敲除。
背景技術(shù)：
黃單胞菌Xcc 8004是一種具有植物致病性的革蘭氏陰性菌，可引起十字花科植物的“黑腐病”，會(huì)對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成極大的影響。黃單胞菌可通過(guò)植物的氣孔、根系或者傷口感染十字花科植物如卷心菜、西蘭花、花菜及擬南芥等。開(kāi)展對(duì)黃單胞菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化與基因改造方法的研究有利于提高其DNA轉(zhuǎn)化、基因敲除及染色體修飾的效率，推進(jìn)其致病機(jī)制的研究和防范策略的開(kāi)發(fā)。
因黃單胞菌可分泌多種胞外酶和胞外多糖，其對(duì)化學(xué)處理十分不敏感，因此電轉(zhuǎn)化方法成為外源DNA進(jìn)入黃單胞菌的首選方法。但是，已報(bào)道的黃單胞菌電轉(zhuǎn)化方法的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于大腸桿菌的電轉(zhuǎn)化效率，主要是黃單胞菌胞外分泌的多種蛋白和多糖的去除效率會(huì)直接影響電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的敏感性，外源DNA難于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，因而降低了電轉(zhuǎn)化效率。另一方面，基因改造是開(kāi)展黃單胞菌致病機(jī)制研究的必經(jīng)步驟?，F(xiàn)有的黃單胞菌基因替換方法是利用不可復(fù)制質(zhì)粒，通過(guò)與特定的大腸桿菌菌株進(jìn)行接合，來(lái)實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒整合與基因重組。這種方法操作復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)，且效率偏低。因此，開(kāi)發(fā)新方法來(lái)提高黃單胞菌的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化與基因改造效率，簡(jiǎn)化黃單胞菌基因修飾過(guò)程，具有重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，是為了提高黃單胞菌的DNA轉(zhuǎn)化和基因替換效率，簡(jiǎn)化操作步驟，提供一種快速制備黃單胞菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的方法及其應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案一種快速制備黃單胞菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的方法，包括如下步驟a、將黃單胞菌8004菌種在LB固體平板上劃線培養(yǎng)，28°C培養(yǎng)48小時(shí)；b、挑取單克隆接種于IOml LB液體培養(yǎng)基中，置于28°C搖床上220rpm/min過(guò)夜培養(yǎng);C、等分過(guò)夜培養(yǎng)物到四個(gè)5ml離心管中，室溫下以8000rpm/min離心5min,收集細(xì)胞；d、用Iml的250mM鹿糖溶液重懸菌體,室溫下以12000rpm/min離心2min,重復(fù)上述重懸-離心步驟三次，收集細(xì)胞；e、每管細(xì)胞中加入25μ I的250mM蔗糖溶液，重懸并合并四管細(xì)胞后，分裝50μ I/管，-80°C凍存，得到細(xì)胞終濃度為109-101(lCFU/ml的黃單胞菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。上述黃單胞菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的高效電轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟A、取50 μ I黃單胞菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，加入相應(yīng)量的質(zhì)粒DNA，混勻后轉(zhuǎn)入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯電擊；
B、電擊后，迅速在電轉(zhuǎn)化杯中加入Iml LB液體培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)移至試管中，28°C搖培I 3小時(shí)；C、將孵育后的培養(yǎng)液涂布于抗性平板上，28°C培養(yǎng)48 72個(gè)小時(shí)后觀察克隆生長(zhǎng)情況與計(jì)算克隆數(shù)目。上述黃單胞菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的高效電轉(zhuǎn)化方法，其中，所述黃單胞菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞濃度0D_為O. 4-1. 2，所述相應(yīng)量的質(zhì)粒DNA的量為50ng I μ g，所述電擊時(shí)的電擊強(qiáng)度為10_20KV/cm。經(jīng)檢測(cè)，上述黃單胞菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的高效電轉(zhuǎn)化方法的最佳條件是，黃單胞菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞濃度0D_為O. 6-1. 0，質(zhì)粒DNA的量為50ng I μ g，電擊時(shí)的電擊強(qiáng)度為14-18KV/cm，28°C搖培時(shí)間為2小時(shí)。上述黃單胞菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的高效電轉(zhuǎn)化方法，其中，所述的質(zhì)粒包括可復(fù)制質(zhì)粒和不可復(fù)制質(zhì)粒，可復(fù)制質(zhì)粒包括pUFR027、pDN19和pRKaraRed ;不可復(fù)制質(zhì)粒包括pK18mobsacB-Xcl075 和 pK18mobsacB_Xc2659 ;可復(fù)制質(zhì)粒 DNA 的量為 50ng I μ g，不可復(fù)制質(zhì)粒DNA的量為500ng I μ g。上述黃單胞菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的高效電轉(zhuǎn)化方法，其中，所述的抗性平板含四環(huán)素10 μ g/ml或卡那霉素10 μ g/ml。上述快速制備黃單胞菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的方法用于可復(fù)制質(zhì)粒與不可復(fù)制質(zhì)粒的高效轉(zhuǎn)化；可復(fù)制質(zhì)粒包括pUFR027、pDN19或pRKaraRed ;不可復(fù)制質(zhì)粒包括pK18mobsacB_Xcl075 或 pK18mobsacB_Xc2659。本發(fā)明利用蔗糖溶液在室溫下經(jīng)重懸-離心方法處理過(guò)夜培養(yǎng)細(xì)胞，來(lái)制備黃單胞菌高效電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，全程僅需十五分鐘。該方法克服了傳統(tǒng)電轉(zhuǎn)化方法的耗時(shí)較長(zhǎng)，效率偏低，操作復(fù)雜等缺點(diǎn)。與現(xiàn)有轉(zhuǎn)化方法相比，本發(fā)明的方法的轉(zhuǎn)化效率提高了約100倍。本方法可用于可復(fù)制質(zhì)粒與不可復(fù)制質(zhì)粒的高效快速轉(zhuǎn)化。在最佳條件下，可復(fù)制質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率可達(dá)IO9CFU/μ g DNA，不可復(fù)制質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率約150CFU/l·! g DNA。因此，本方法簡(jiǎn)化了黃單胞菌電轉(zhuǎn)化操作，推進(jìn)了基因敲除的進(jìn)程。
圖I、圖2、圖3為不同條件下Xcc8004感受態(tài)細(xì)胞的電轉(zhuǎn)化效率。圖中所用質(zhì)粒均為pUFR027，其中圖I為DNA濃度的影響。DNA濃度為50ng至I μ g，其它條件為=OD6tltl = O. 8，電擊強(qiáng)度為14KV/cm，孵育時(shí)間為2小時(shí)。圖2為細(xì)胞濃度的影響。選用處于不同濃度的細(xì)胞制備感受態(tài)，細(xì)胞濃度為0D_=O. 4 I. 2，其它條件為200ng質(zhì)粒DNA，電擊強(qiáng)度為14KV/cm，孵育時(shí)間為2小時(shí)。圖3為電擊強(qiáng)度的影響。電擊強(qiáng)度為12KV/cm 20KV/cm，其它條件為200ng質(zhì)粒DNA，OD600 = O. 8，孵育時(shí)間為2小時(shí)。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，計(jì)算平均值后作圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明的實(shí)施不局限于此。
實(shí)施例I :可復(fù)制質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化和不同條件下的轉(zhuǎn)化效率檢測(cè)一、電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備本例中使用Xcc8004作為目標(biāo)菌株來(lái)制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。將Xcc8004菌種在LB固體平板上劃線培養(yǎng)，28°C培養(yǎng)48小時(shí)。挑取單克隆接種于IOml LB液體培養(yǎng)基中，置于28°C搖床上220rpm/min過(guò)夜培養(yǎng)。等分過(guò)夜培養(yǎng)物到四個(gè)5ml離心管中，室溫下以8000rpm/min離心5min，收集細(xì)胞。用Iml的250mM蔗糖溶液重懸菌體，室溫下以12000rpm/min離心2min。重復(fù)該重懸-離心步驟三次。最后每管細(xì)胞中加入25 μ I的250mM蔗糖溶液，重懸并合并四管細(xì)胞后，分裝50 μ I/管，-80°C凍存。細(xì)胞終濃度為109-101(lCFU/ml。二、電轉(zhuǎn)化質(zhì)粒；本例中使用電轉(zhuǎn)化儀為Bio-Rad GenePulser II,電轉(zhuǎn)化杯為O. Icm電擊杯。測(cè)定 質(zhì)粒大小、質(zhì)粒濃度、細(xì)胞濃度、電場(chǎng)強(qiáng)度及孵育時(shí)間對(duì)黃單胞菌電轉(zhuǎn)化效率的影響。在細(xì)胞生長(zhǎng)至0D_介于O. 4 I. 2時(shí)，按照上述方法制備感受態(tài)細(xì)胞。取50 μ I感受態(tài)細(xì)胞，加入不同濃度質(zhì)粒(50ng Iyg)，混勻后轉(zhuǎn)入預(yù)冷的電擊杯，以不同電場(chǎng)強(qiáng)度電擊(10KV/cm 20KV/cm)。電擊后,迅速在電轉(zhuǎn)化杯中加入Iml LB液體培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)移至試管中，28°C搖培I 3小時(shí)。將孵育后的培養(yǎng)液涂布于抗性平板上，28°C培養(yǎng)48 72個(gè)小時(shí)后觀察克隆生長(zhǎng)情況與計(jì)算克隆數(shù)目。本例中檢測(cè)了三種可在黃單胞菌中復(fù)制的質(zhì)粒pUFR027、pDN19和pRKaraRed，分別對(duì)三種質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，測(cè)定其轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果見(jiàn)圖I、圖2、圖3。我們選擇了以下條件來(lái)進(jìn)行感受態(tài)細(xì)胞的制備與質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化細(xì)胞濃度0D_ = 0. 8，200ng的質(zhì)粒DNA，電擊強(qiáng)度14KV/em，孵育時(shí)間2小時(shí)。結(jié)果顯示，這三種質(zhì)粒均可在黃單胞菌中復(fù)制，轉(zhuǎn)化克隆數(shù)目約為IO9CFUz^g DNA，轉(zhuǎn)化效率比公開(kāi)的報(bào)道高出約100倍。之后，我們選用質(zhì)粒pUFR027來(lái)檢測(cè)DNA濃度、細(xì)胞濃度、電擊強(qiáng)度及復(fù)蘇時(shí)間對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果顯示，增加質(zhì)粒DNA的濃度可顯著提高轉(zhuǎn)化效率。當(dāng)質(zhì)粒DNA濃度從50ng增加到I μ g時(shí)，相同條件下的轉(zhuǎn)化效率可從IO6CFU/ μ g DNA提高到IO8CFU/ μ g DNA (參見(jiàn)圖I)。但50_100ng質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化效率即可滿足大多數(shù)實(shí)驗(yàn)的要求。同時(shí)，選用不同濃度的細(xì)胞來(lái)制備感受態(tài)細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化效率存在差異。以細(xì)胞濃度在0D_ = O. 6 I. O時(shí)，其轉(zhuǎn)化效率最高(參見(jiàn)圖2)。電擊強(qiáng)度也會(huì)影響電轉(zhuǎn)化的效率，過(guò)低或過(guò)高的電擊強(qiáng)度均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。當(dāng)電擊強(qiáng)度為14 18KV/em時(shí)，電轉(zhuǎn)化的效果最好(參見(jiàn)圖3);此時(shí)電擊時(shí)間約為5. 0ms。此外,復(fù)蘇時(shí)間對(duì)電轉(zhuǎn)化效率具有十分顯著的影響。若電擊后細(xì)胞不經(jīng)復(fù)蘇直接涂抗性平板，轉(zhuǎn)化效率僅為IO3CFUz^g DNA。然而，若在電擊后孵育一到兩小時(shí)可顯著地提高轉(zhuǎn)化效率，參見(jiàn)表I。一小時(shí)的復(fù)蘇培養(yǎng)是提高轉(zhuǎn)化效率所必需的條件，兩小時(shí)的孵育培養(yǎng)則可基本達(dá)到最高轉(zhuǎn)化效率。因此，經(jīng)過(guò)優(yōu)化，黃單胞菌Xcc8004的感受態(tài)制備與電轉(zhuǎn)化最佳條件為·》50ng可復(fù)制質(zhì)粒DNA或彡500叩不可復(fù)制質(zhì)粒0嫩，細(xì)胞00_為0.6 1.0，電擊強(qiáng)度為14 18KV/cm,電擊后培養(yǎng)兩小時(shí)。實(shí)施例2 :不可復(fù)制質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和基因XC_1075、XC_2659的敲除不可復(fù)制質(zhì)粒主要用于染色體整合、基因修飾和基因敲除。傳統(tǒng)的黃單胞菌基因改造方法是通過(guò)與大腸桿菌S17-l( λ pir)接合來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本例以本發(fā)明方法來(lái)制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，采用將不可復(fù)制質(zhì)粒直接電擊轉(zhuǎn)化到黃單胞菌Xcc8004的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒的整合與基因的敲除。XC_1075和XC_2659兩個(gè)基因被選為目標(biāo)基因，編碼了黃單胞菌的葡萄糖脫氫酶基因。引物由Invitrogen公司(上海，中國(guó))合成。PCR反應(yīng)使用KOD plus聚合酶(Τ0Υ0Β0,日本)擴(kuò)增。限制性內(nèi)切酶與T4連接酶均購(gòu)自Fermentas公司(加拿大)。質(zhì)粒DNA的提取與PCR產(chǎn)物純化均使用試劑盒(Qiagen，德國(guó))。我們首先利用不可復(fù)制質(zhì)粒pK18mobsacB構(gòu)建了兩個(gè)重組質(zhì)粒pK18mobsacB-Xcl075和pK18mobsaeB_Xc2659。每個(gè)基因使用兩個(gè)引物對(duì)來(lái)擴(kuò)增目標(biāo)基因的上游500bp片段(U500)和下游500bp片段(D500)XC1075-U-F :5，-GTAGGAATTCatgactgatcaatcctetaaacgcggg-3，；XC1075-U-R :5，_ctgaacggcgttgccgcatc_3，XC1075-D-F :5，-gcagcaagaccaagggctacatg-3，；
XC1075-D-R :5，-GTAGAAGCTTttatttggcgctggcggcc-3，。XC2659-U-F :5，-GTAGGAATTCatgtcgacattgcttcgtccctccc-3’ ；XC2659-U-R :5，-gggcgattgaccacacctgcg-3，；XC2659-D-F :5，-gtggcgatgecggtggtgc-3，；XC2659-D-R :5，-GTAGAAGCTTttaccgctgcggcaacgcgtag-3，。同時(shí)，以質(zhì)粒pEX18Gm為模板，分別PCR擴(kuò)增兩側(cè)帶有與XC1075-U500/D500和XC2659-U500/D500片段同源的20bp序列的慶大霉素基因XC1075_accCl和XC2659_accCl，PCR擴(kuò)增所用引物序列為accCl-1075-F :5，-GATGCGGCAACGCCGTTCAGatgttacgcagcagcaacgatgt-3，；accCl-1075-R :5，-GTAGCCCTTGGTCTTGCTGCttaggtggcggtacttgggt_3，；accCl-2659-F :5，-GCAGGTGTGGTCAATCGCCCatgttacgcagcagcaacgatgt-3，；accCl-2659-R :5，-GTGGCGATGCCGGTGGTGCAttaggtggcggtacttgggt-3，。之后，分別以三個(gè)片段XC1075-U500/D500/accCl 和 XC2659_U500/D500/accCl 為模板，利用引物對(duì) XC1075-U-F/XC1075-D-R 和 XC2659-U-F/XC2659-D-R 進(jìn)行重疊 PCR 擴(kuò)增，獲得融合片段。最后，分別將兩個(gè)融合片段與質(zhì)粒pK18mobSacB進(jìn)行EcoR I/Hind III雙酶切，回收酶切片段后用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，獲得質(zhì)粒pK18mObsaCB-XC1075和質(zhì)粒pK18mobsacB_Xc2659。我們按照最優(yōu)的電轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行質(zhì)粒pK18mobsacB_Xcl075和pK18mobsacB-Xc2659的電轉(zhuǎn)化，即:IOOOng質(zhì)粒DNA，細(xì)胞OD600為O. 6 I. 0，電擊強(qiáng)度為14 18KV/cm，電擊后培養(yǎng)兩小時(shí)。在抗性平板上篩選后可獲得約150個(gè)克隆/μ g DNA(參見(jiàn)表2)，遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的接合方法中的約30個(gè)克隆/μ gDNA的轉(zhuǎn)化效率。與可復(fù)制質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化相比，不可復(fù)制的質(zhì)粒的有效轉(zhuǎn)化需要至少500ng的DNA才能實(shí)現(xiàn),質(zhì)粒濃度的增加也可明顯提高轉(zhuǎn)化的效率。由于不可復(fù)制質(zhì)粒不能在黃單胞菌中進(jìn)行復(fù)制，因此轉(zhuǎn)化后的抗性篩選獲得的克隆均為質(zhì)粒整合或重組后的結(jié)果。因此，該方法可有效地實(shí)現(xiàn)不可復(fù)制質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、整合與染色體基因的敲除。表I可復(fù)制質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Xcc8004感受態(tài)細(xì)胞的效率
權(quán)利要求
1.一種快速制備黃單胞菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的方法，其特征在于，包括如下步驟 a、將黃單胞菌8004菌種在LB固體平板上劃線培養(yǎng)，28°C培養(yǎng)48小時(shí)； b、挑取單克隆接種于IOmlLB液體培養(yǎng)基中，置于28°C搖床上220rpm/min過(guò)夜培養(yǎng)； C、等分過(guò)夜培養(yǎng)物到四個(gè)5ml離心管中，室溫下以8000rpm/min離心5min,收集細(xì)胞； d、用Iml的250mM鹿糖溶液重懸菌體,室溫下以12000rpm/min離心2mmin,重復(fù)上述重懸-離心步驟三次，收集細(xì)胞； e、每管細(xì)胞中加入25μI的250mM蔗糖溶液，重懸并合并四管細(xì)胞后，分裝50μ I/管，_80°C凍存，得到細(xì)胞終濃度為109-101(I°C FU/ml的黃單胞菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的黃單胞菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的高效電轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，包括以下步驟 A、取50μ I黃單胞菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，加入相應(yīng)量的質(zhì)粒DNA，混勻后轉(zhuǎn)入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯電擊； B、電擊后，迅速在電轉(zhuǎn)化杯中加入ImlLB液體培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)移至試管中，28°C搖培I 3小時(shí)； C、將孵育后的培養(yǎng)液涂布于抗性平板上，28°C培養(yǎng)48 72個(gè)小時(shí)后觀察克隆生長(zhǎng)情況與計(jì)算克隆數(shù)目。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃單胞菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的高效電轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述黃單胞菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞濃度OD_為O. 4-1. 2，所述相應(yīng)量的質(zhì)粒DNA的量為50ng I μ g，所述電擊時(shí)的電擊強(qiáng)度為10-20KV/cm。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃單胞菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的高效電轉(zhuǎn)化方法，其特征在于；所述黃單胞菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞濃度OD_為O. 6-1. 0，所述相應(yīng)量的質(zhì)粒DNA的量為50ng I μ g，所述電擊時(shí)的電擊強(qiáng)度為14-18KV/cm，所述28°C搖培時(shí)間為2小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃單胞菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的高效電轉(zhuǎn)化方法，其特征在于；所述的質(zhì)粒包括可復(fù)制質(zhì)粒和不可復(fù)制質(zhì)粒，可復(fù)制質(zhì)粒包括PUFR027、pDN19和PRKaraRed ;不可復(fù)制質(zhì)粒包括 pK18mobsacB-xcl075 和 pK18mobsacB_Xc2659 ;可復(fù)制質(zhì)粒DNA的量為50ng I μ g，不可復(fù)制質(zhì)粒DNA的量為500ng I μ g。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃單胞菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的高效電轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的抗性平板含四環(huán)素 ο μ g/ml或卡那霉素10 μ g/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速制備黃單胞菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的方法的應(yīng)用，其特征在于用于可復(fù)制質(zhì)粒與不可復(fù)制質(zhì)粒的高效轉(zhuǎn)化；可復(fù)制質(zhì)粒包括PUFR027、pDN19或PRKaraRed ;不可復(fù)制質(zhì)粒包括 pK18mobsacB_Xcl075 或 pK18mobsacB_Xc2659。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種快速制備黃單胞菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明利用蔗糖溶液在室溫下經(jīng)重懸-離心方法處理過(guò)夜培養(yǎng)細(xì)胞，來(lái)制備黃單胞菌高效電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，全程僅需十五分鐘。該方法克服了傳統(tǒng)電轉(zhuǎn)化方法的耗時(shí)較長(zhǎng)，效率偏低，操作復(fù)雜等缺點(diǎn)。與現(xiàn)有轉(zhuǎn)化方法相比，本發(fā)明方法的轉(zhuǎn)化效率提高了約100倍。本方法可用于可復(fù)制質(zhì)粒與不可復(fù)制質(zhì)粒的高效快速轉(zhuǎn)化。在最佳條件下，可復(fù)制質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率可達(dá)109CFU/μg DNA，不可復(fù)制質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率達(dá)150CFU/μg DNA。因此，本方法簡(jiǎn)化了黃單胞菌電轉(zhuǎn)化操作，推進(jìn)了基因敲除的進(jìn)程。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102876610SQ20121037973
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月8日
發(fā)明者梁如冰, 馬辰, 劉建華 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)