專利名稱：淡紫醌霉素及其甲酯的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗腫瘤試劑制備領(lǐng)域，尤其涉及一種抗腫瘤試劑淡紫醌霉素Iavendamycin及其甲酯的生產(chǎn)工程菌株構(gòu)建方法及它們的制備方法。
背景技術(shù)：
鏈黑菌素是一個(gè)由絨毛鏈霉菌(Streptomyces flocculus)產(chǎn)生的具有獨(dú)特喹啉環(huán)結(jié)構(gòu)的抗腫瘤抗生素。其抗腫瘤活性良好，是一種廣譜抗腫瘤抗生素，對(duì)腦癌、頸癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌，特別是對(duì)白血病、淋巴瘤和黑素瘤具有很好的療效。鏈黑菌素的藥理作用是可選擇性地抑DNA合成，主要作用于S期，一個(gè)分子的鏈黑菌素可與2000個(gè)分子的脫氧核苷酸穩(wěn)定地結(jié)合，并能使瘤細(xì)胞染色體斷裂，使已形成的DNA降解.由于具有較大的骨 髓毒性，因此很少單獨(dú)用藥用于臨床。鏈黑菌素含有四個(gè)環(huán)，其中三個(gè)環(huán)幾乎處于同一個(gè)平面，而第四個(gè)環(huán)與這個(gè)平面幾乎呈垂直狀態(tài)。淡紫醌霉素(Iavendamycin)是從鏈霉菌(S.1avendulea strain C22030)分離鑒定的氨基醌類化合物，具有與鏈黑菌素相類似的結(jié)構(gòu)，但是其化學(xué)結(jié)構(gòu)含有五個(gè)環(huán)，這五個(gè)環(huán)幾乎處于同一平面。淡紫醌霉素具有與鏈黑菌素相近的抗腫瘤活性和抗腫瘤譜，但是比鏈黑菌素低得多的毒性。自1981年淡紫醌霉素被報(bào)道以來(lái)，僅僅只有一例關(guān)于其產(chǎn)生菌的報(bào)道，目前該產(chǎn)生菌被國(guó)外公司保存，且產(chǎn)量低，文獻(xiàn)報(bào)道在8升發(fā)酵培養(yǎng)基中僅獲得O. 3mg淡紫醌霉素。而淡紫醌霉素甲酯則是淡紫醌霉素利用化學(xué)合成手段通過(guò)與甲醇發(fā)生酯化反應(yīng)獲得的抗生素，目前并沒(méi)有天然微生物產(chǎn)生淡紫醌霉素甲酯的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供利用鏈黑菌素產(chǎn)生菌通過(guò)生物技術(shù)操作制備淡紫醌霉素Iavendamycin及其甲酯的方法。鏈黑菌素產(chǎn)生菌Streptomyces flocculusCGMCC4. 1223的菌種來(lái)源于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，寄存來(lái)源是上海醫(yī)藥工業(yè)研究院。參考文獻(xiàn)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所放線菌分類組，《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》，1975，P202-205，科學(xué)出版社，北京。本發(fā)明通過(guò)對(duì)柔毛鏈霉菌Streptomyces flocculus CGMCC4. 1223進(jìn)行針對(duì)鏈黑菌素生物合成基因簇中雙氧化酶的選擇性失活突變，得到相應(yīng)的雙氧化酶失活突變菌株，從該突變株的發(fā)酵液中分離到淡紫醌霉素(Iavendamycin)及其甲酯化合物。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的第一方面，本發(fā)明涉及一種淡紫醌霉素的制備方法，包括如下步驟A、以鏈黑菌素原始產(chǎn)生菌柔毛鏈霉菌Streptomyces flocculus CGMCC4. 1223為出發(fā)菌株，克隆得到鏈黑菌素生物合成基因簇；B、對(duì)所述鏈黑菌素生物合成基因簇中的雙氧化酶StnBl基因進(jìn)行選擇性失活，獲得StnBl基因失活突變菌株Λ stnBl ；C、對(duì)所述突變菌株Λ stnBl進(jìn)行發(fā)酵，將發(fā)酵液離心，離心后的濾液調(diào)整pH值至9 10，用不溶于水的中等極性有機(jī)溶劑A反復(fù)萃取，取水相濾液；
D、調(diào)整所述水相濾液pH值至4 5，用所述不溶于水的中等極性有機(jī)溶劑反復(fù)萃取，收集中等極性有機(jī)溶劑相B，濃縮得到粗提物B，對(duì)所述粗提物B進(jìn)行純化，即得。該淡紫醌霉素，其結(jié)構(gòu)式如式(I )所示
權(quán)利要求
1.一種淡紫醌霉素的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 A、以鏈黑菌素原始產(chǎn)生菌柔毛鏈霉菌Str印tomycesflocculus CGMCC4. 1223為出發(fā)菌株，克隆得到鏈黑菌素生物合成基因簇； B、對(duì)所述鏈黑菌素生物合成基因簇中的雙氧化酶StnBl基因進(jìn)行選擇性失活，獲得StnBl基因失活突變菌株AstnBl ； C、對(duì)所述突變菌株AstnBl進(jìn)行發(fā)酵，將發(fā)酵液離心，離心后的濾液調(diào)整pH值至9 10，用不溶于水的中等極性有機(jī)溶劑A反復(fù)萃取，取水相濾液； D、調(diào)整所述水相濾液pH值至4 5，用所述不溶于水的中等極性有機(jī)溶劑A反復(fù)萃取，收集中等極性有機(jī)溶劑相B，濃縮得到粗提物B，對(duì)所述粗提物B進(jìn)行純化，即得。
2.如權(quán)利要求1所述的淡紫醌霉素的制備方法，其特征在于，所述不溶于水的中等極性有機(jī)溶劑A為乙酸乙酯、乙醚、氯仿或正丁醇。
3.如權(quán)利要求1所述的淡紫醌霉素的制備方法，其特征在于，步驟C中，所述不溶于水的中等極性有機(jī)溶劑A與離心后的濾液的體積比為1:3 2:1。
4.如權(quán)利要求1所述的淡紫醌霉素的制備方法，其特征在于，步驟D中，所述不溶于水的中等極性有機(jī)溶劑A與水相濾液的體積比為1:3 2:1。
5.如權(quán)利要求1所述的淡紫醌霉素的制備方法，其特征在于，步驟D中，所述純化為用PH值為11 13的堿性水溶液溶解所述粗提物B并離心，收集上清液；向上清液中滴加鹽酸至出現(xiàn)沉淀；離心棄去上清，沉淀凍干后加入乙腈溶解，經(jīng)半制備性PHLC，以乙腈水溶液洗脫，接收對(duì)應(yīng)的吸收峰，合并餾分后放置_20°C以下，待有沉淀析出后低溫離心，棄去上清，凍干沉淀，即得所述淡紫醌霉素。
6.如權(quán)利要求5所述的淡紫醌霉素的制備方法，其特征在于，所述乙腈水溶液中乙腈的體積濃度為20% 100%。
7.如權(quán)利要求5所述的淡紫醌霉素的制備方法，其特征在于，所述堿性水溶液為O.1 IM NaOH 溶液。
8.一種淡紫醌霉素甲酯的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 A、以鏈黑菌素原始產(chǎn)生菌柔毛鏈霉菌Str印tomycesflocculus CGMCC4. 1223為出發(fā)菌株，克隆得到鏈黑菌素生物合成基因簇； B、對(duì)所述鏈黑菌素生物合成基因簇中的雙氧化酶StnBl基因進(jìn)行選擇性失活，獲得StnBl基因失活突變菌株AstnBl ； C、對(duì)所述突變菌株AstnBl進(jìn)行發(fā)酵，將發(fā)酵液離心，離心后的濾液調(diào)整pH值至9 10，用不溶于水的中等極性有機(jī)溶劑A反復(fù)萃取，保留中等極性有機(jī)溶劑相A，濃縮得到粗提物A，對(duì)所述粗提物A進(jìn)行純化，即得。
9.如權(quán)利要求8所述的淡紫醌霉素甲酯的制備方法，其特征在于，步驟C中，所述不溶于水的中等極性有機(jī)溶劑A為乙酸乙酯、乙醚、氯仿或正丁醇。
10.如權(quán)利要求8所述的淡紫醌霉素甲酯的制備方法，其特征在于，步驟C中，所述不溶于水的中等極性有機(jī)溶劑A與離心后的濾液的體積比為1:3 2:1。
11.如權(quán)利要求8所述的淡紫醌霉素甲酯的制備方法，其特征在于，步驟C中，所述純化為將粗提物A用正相硅膠柱層析，以石油醚和中等極性有機(jī)溶劑B的混合物作為流動(dòng)相洗脫，經(jīng)HPLC分析檢測(cè)，合并含有淡紫醌霉素甲酯的餾分并濃縮，然后用反相硅膠進(jìn)行柱層析，用甲醇水溶液洗脫，將所得到的餾分經(jīng)HPLC檢測(cè)后合并餾分，濃縮干燥，得淡紫醌霉素甲酯。
12.如權(quán)利要求11所述的淡紫醌霉素甲酯的制備方法，其特征在于，所述作為流動(dòng)相的石油醚和中等極性有機(jī)溶劑B的體積比為1:3 10:1。
13.如權(quán)利要求11或12所述的淡紫醌霉素甲酯的制備方法，其特征在于，所述中等極性有機(jī)溶劑B為乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、氯仿、丙酮或異丙醇。
14.如權(quán)利要求11所述的淡紫醌霉素甲酯的制備方法，其特征在于，所述甲醇水溶液中甲醇的體積濃度為60% 100%。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種淡紫醌霉素及其甲酯的制備方法。以鏈黑菌素產(chǎn)生菌-柔毛鏈霉菌Streptomyces.flocculus CGMCC4.1223作為出發(fā)菌株，對(duì)該鏈黑菌素生物合成基因簇中的雙氧化酶基因stnBl實(shí)行選擇性敲除，獲得相應(yīng)的stnBl基因失活突變株ΔstnBl；對(duì)突變株發(fā)酵產(chǎn)物粗提物采用反相硅膠、凝膠等柱層析和半制備HPLC等色譜分析技術(shù)，制得淡紫醌霉素及其甲酯。本發(fā)明建立了利用鏈黑菌素產(chǎn)生菌通過(guò)基因工程手段制備淡紫醌霉素的方法，提高了淡紫醌霉素和淡紫醌霉素甲酯的產(chǎn)量，分別達(dá)到每5升培養(yǎng)基可以獲得約1mg淡紫醌霉素和20mg淡紫醌霉素甲酯，并且經(jīng)過(guò)菌種優(yōu)化和發(fā)酵優(yōu)化還有進(jìn)一步提升的空間。
文檔編號(hào)C12P17/18GK102994585SQ20121037635
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月28日
發(fā)明者林雙君, 鄧子新, 徐飛 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)