專利名稱：固相-數(shù)字pcr芯片及其制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物芯片研究領(lǐng)域，特別涉及一種固相-數(shù)字PCR芯片及其制作方法。
背景技術(shù)：
在進(jìn)行生物研究和實(shí)際檢測時(shí)，有時(shí)待測DNA樣品的量較少或者從樣品中提取的待測DNA分子濃度較低時(shí)，為了得到較好的結(jié)果，通常需要先對(duì)樣品分子的量進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)。雖然常規(guī)的PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究及相關(guān)領(lǐng)域，并且在應(yīng)用過程中不斷得到改進(jìn)，但目前仍然存在著耗時(shí)太長，操作繁瑣，試劑消耗量大，擴(kuò)增結(jié)果不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。因此人們一直在尋求更快速更簡便的PCR方法。固相PCR是將特定的引物寡核苷酸通過不同的方法固定在固相支持物上來擴(kuò)增目的DNA。固相支持物有瓊脂糖小珠，聚丙烯酰胺小珠，乳膠小珠，磁珠，普通玻片以及硅片 等。固相PCR可以將核酸擴(kuò)增、核酸分離和核酸檢測三個(gè)相互獨(dú)立的步驟整合在一起，避免常規(guī)PCR擴(kuò)增的一些干擾因素，PCR反應(yīng)產(chǎn)物易于分離純化，同時(shí)可實(shí)現(xiàn)多個(gè)不同擴(kuò)增反應(yīng)的同步進(jìn)行。固相PCR在快速基因分型、藥學(xué)基因組學(xué)以及基于基因組學(xué)的藥物發(fā)展中有廣泛的用途。數(shù)字PCR是最新的DNA定量技術(shù)，其基于單分子PCR并采用計(jì)數(shù)的方法對(duì)DNA進(jìn)行定量，因此是一種絕對(duì)定量的工具。將大量的稀釋后的DNA溶液分散至芯片的微量反應(yīng)體系中，每個(gè)反應(yīng)體系的DNA模板數(shù)少于I個(gè)。在PCR循環(huán)反應(yīng)之后，可根據(jù)發(fā)出熒光信號(hào)的微量反應(yīng)體系所占有的比例來判定原始DNA濃度。固相-數(shù)字PCR兩者的結(jié)合，利用了數(shù)字PCR的特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了在微量體系中低濃度待測DNA的定量檢測，同時(shí)亦可通過固相PCR將待測DNA片段多重拷貝固定在蓋片表面，可用于后續(xù)全基因組測序、單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、多重基因表達(dá)分析。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種固相-數(shù)字PCR芯片及其制作方法，其制作簡單，易操作，成本低廉。并且綜合了固相PCR高通量、低干擾的優(yōu)勢同時(shí)兼具數(shù)字PCR低濃度定量檢測的特點(diǎn)，為低濃度、稀有樣品DNA定量檢測及其后續(xù)全基因組測序、單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、多重基因表達(dá)分析等提供良好的操作平臺(tái)。本發(fā)明提供一種固相-數(shù)字PCR芯片的制作方法，包括如下步驟步驟I :取一基片，去除表面有機(jī)及無機(jī)雜質(zhì)，并進(jìn)行真空干燥；步驟2 :在基片正面生長犧牲層；步驟3 :通過光刻工藝和刻蝕工藝將掩模圖形轉(zhuǎn)移到犧牲層上；步驟4 :以犧牲層為掩膜，通過刻蝕工藝，在基片上形成微孔陣列；步驟5 :取一蓋片，去除表面有機(jī)及無機(jī)雜質(zhì)，并進(jìn)行真空干燥；步驟6 :在蓋片正面旋涂PDMS膜，并加熱使PDMS膜固化；
步驟7 :對(duì)PDMS膜進(jìn)行表面處理，并將DNA探針結(jié)合在PDMS膜的表面；步驟8 :將基片與蓋片鍵合，使基片上微孔陣列中的每個(gè)微孔形成獨(dú)立反應(yīng)池，形成固相-數(shù)字PCR芯片。本發(fā)明還提供一種固相-數(shù)字PCR芯片，包括一基片；一微孔陣列，該微孔陣列通過光刻工藝和兩步刻蝕工藝制作在基片上；一蓋片；一 PDMS膜，該P(yáng)DMS膜通過旋涂、加熱固化在蓋片表面；
該基片，微孔陣列，蓋片與PDMS膜形成了固相-數(shù)字PCR芯片。
為了進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容和特點(diǎn)，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做一詳細(xì)描述，其中圖I為本發(fā)明流程圖；圖2為固相-數(shù)字PCR芯片制作的步驟示意圖。
具體實(shí)施例方式請(qǐng)參閱圖I結(jié)合參閱圖2所示，本發(fā)明為一種固相-數(shù)字PCR芯片的制作方法，包括如下步驟步驟I :取一基片10，去除表面有機(jī)及無機(jī)雜質(zhì)，并進(jìn)行真空干燥，所述基片10材料為硅片、石英片、光纖面板或有機(jī)薄片，清洗是依次使用超聲波在分析純?nèi)纫蚁⒈?、無水乙醇、去離子水中清洗，去除基片10表面的有機(jī)雜質(zhì)，隨后使用氨水和雙氧水的混合液，鹽酸和雙氧水的混合液，硫酸和雙氧水的混合液加熱煮沸基片10,并使用去離子水沖洗，去除基片10表面的無機(jī)雜質(zhì)，此種清洗方式可除去基片10表面的有機(jī)附著物和無機(jī)顆粒物，將清洗后的基片10用氮?dú)獯蹈珊笱b入培養(yǎng)皿中，之后放入真空干燥箱內(nèi)前烘，前烘的溫度一般高于100攝氏度，前烘操作目的是去除基片10本身附帶的水蒸氣；步驟2 :在基片10正面生長犧牲層，所述犧牲層材料和生長厚度依據(jù)后續(xù)刻蝕工藝以及刻蝕的深度而定；步驟3 :通過光刻工藝和刻蝕工藝將掩模板上的圖形轉(zhuǎn)移到犧牲層上；所述光刻工藝包括勻膠、前烘、曝光、顯影等步驟，刻蝕工藝包括干法刻蝕和濕法刻蝕兩種；步驟4 :以犧牲層為掩膜，通過刻蝕工藝，在基片10上形成微孔陣列11 ;根據(jù)需要選擇物理干法刻蝕或化學(xué)濕法腐蝕的方式來制作微孔陣列11，其作用機(jī)理是利用氣體等離子或化學(xué)試劑對(duì)基片10的腐蝕作用，在基片10無犧牲層覆蓋區(qū)域形成微孔陣列11。微孔陣列11中的每個(gè)微孔形成一個(gè)皮升到納升量級(jí)的獨(dú)立反應(yīng)池，用于數(shù)字化PCR反應(yīng)，微孔陣列11以矩形、環(huán)形、鏡像或密排等形式陣列排布，微孔陣列11數(shù)目大于5000，其深度大于5微米，微孔陣列11中的微孔形狀為正多邊形或圓形，正多邊形或圓形大小取決于后續(xù)生物反應(yīng)所需要的體量，正多邊形的外接圓的直徑或圓形的直徑大于5微米，微孔陣列11中的各個(gè)微孔之間通過孔壁的隔離形成的獨(dú)立反應(yīng)池?？妆诘暮穸热Q于后續(xù)生物反應(yīng)的檢測方式，孔壁厚度大于2微米。
步驟5 :另取一蓋片12，去除表面有機(jī)及無機(jī)雜質(zhì)，并進(jìn)行真空干燥；所述蓋片材料為為石英片或硅片，清洗是依次使用超聲波在分析純?nèi)纫蚁?、丙酮、無水乙醇、去離子水中清洗，去除蓋片12表面的有機(jī)雜質(zhì)，隨后使用氨水和雙氧水的混合液，鹽酸和雙氧水的混合液，硫酸和雙氧水的混合液加熱煮沸蓋片12，并使用去離子水沖洗，去除蓋片12表面的無機(jī)雜質(zhì)，此種清洗方式可除去蓋片12表面的有機(jī)附著物和無機(jī)顆粒物，將清洗后的蓋片12用氮?dú)獯蹈珊笱b入培養(yǎng)皿中，之后放入真空干燥箱內(nèi)前烘，前烘的溫度一般高于100攝氏度，前烘操作目的是去除蓋片12本身附帶的水蒸氣；步驟6 :在蓋片12正面旋涂PDMS膜13，并加熱使PDMS膜13固化；蓋片12上旋涂的PDMS膜13的厚度為5微米到500微米，可通過調(diào)整勻膠機(jī)的轉(zhuǎn)速和勻膠時(shí)間來對(duì)PDMS膜13的厚度進(jìn)行調(diào)整，旋涂結(jié)束后將覆蓋有PDMS膜13的蓋片12放入真空烘箱中烘烤，力口速PDMS膜13的固化；步驟7 :對(duì)PDMS膜13進(jìn)行表面處理，并將探針結(jié)合在PDMS膜13表面；用氧等離子體或是表面活性劑處理活化PDMS膜13的表面，使之可高密度結(jié)合DNA探針；
步驟8 :將步驟1、2、3、4得到的基片與步驟5、6、7得到的蓋片緊密貼合，使基片10上微孔陣列11中的每個(gè)微孔形成獨(dú)立反應(yīng)池，形成固相-數(shù)字PCR芯片；所述步驟1、2、3、4、5、6、7、8制備的固相-數(shù)字PCR芯片可在微孔陣列11中實(shí)現(xiàn)體量為皮升到納升量級(jí)的高通量數(shù)字PCR，同時(shí)可通過蓋片表面的探針有效的回收數(shù)字PCR產(chǎn)物，在同一芯片上實(shí)現(xiàn)兩種功能。并為后續(xù)全基因組測序、單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、多重基因表達(dá)分析提供了操作平臺(tái)。請(qǐng)?jiān)趨㈤唸D2,并結(jié)合參閱圖I所示,本發(fā)明為一種固相-數(shù)字PCR芯片,包括—基片10 ;基片10材料為娃片、石英片、光纖面板或有機(jī)薄片；一微孔陣列11，該微孔陣列11通過光刻工藝和兩步刻蝕工藝制作在基片10上，微孔陣列11以矩形、環(huán)形、鏡像或密排等形式陣列排布，微孔陣列11數(shù)目大于5000，其深度大于5微米，微孔陣列11中的微孔形狀為正多邊形或圓形，正多邊形或圓形大小取決于后續(xù)生物反應(yīng)所需要的體量，正多邊形的外接圓的直徑或圓形的直徑大于5微米，微孔陣列11中的各個(gè)微孔之間通過孔壁的隔離形成的獨(dú)立反應(yīng)池。孔壁的厚度取決于后續(xù)生物反應(yīng)的檢測方式，孔壁厚度大于2微米；一蓋片12 ;蓋片12材料為石英片或硅片；一 PDMS膜13，該P(yáng)DMS膜13通過旋涂、加熱固化在蓋片12表面；蓋片12上旋涂的PDMS膜13的厚度為5微米到500微米，該基片10，微孔陣列11，蓋片12與PDMS膜13形成了固相-數(shù)字PCR芯片。綜上所述，固相-數(shù)字PCR芯片及其制作方法至少有以下優(yōu)點(diǎn)I.本發(fā)明固相-數(shù)字PCR芯片提出了一種結(jié)合固相PCR及數(shù)字PCR的雙層芯片結(jié)構(gòu)。2.本發(fā)明固相-數(shù)字PCR芯片制作工藝簡單，操作簡便，同時(shí)兼具可靠性高、成本低廉等特點(diǎn)。3.本發(fā)明固相-數(shù)字PCR芯片微孔深度、孔徑大小、孔壁厚度均有很大的調(diào)節(jié)范圍，適合多種應(yīng)用需求。4.本發(fā)明固相-數(shù)字PCR芯片綜合了固相PCR高通量、低干擾、易純化的優(yōu)勢同時(shí)兼具數(shù)字PCR低濃度定量檢測的特點(diǎn)，適用于低濃度、稀有樣品DNA定量檢測。5.本發(fā)明固相-數(shù)字PCR芯片可逆鍵和為后續(xù)使用蓋片固相PCR產(chǎn)物做全基因組測序、單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、多重基因表達(dá)分析等提供良好的操作平臺(tái)。
以上所述，僅是本發(fā)明的實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，凡是依據(jù)本發(fā)明技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所做的任何簡單修改、等同變化與修飾，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種固相-數(shù)字PCR芯片的制作方法，包括如下步驟 步驟I:取一基片，去除表面有機(jī)及無機(jī)雜質(zhì)，并進(jìn)行真空干燥； 步驟2 :在基片正面生長犧牲層； 步驟3 :通過光刻工藝和刻蝕工藝將掩模圖形轉(zhuǎn)移到犧牲層上； 步驟4 :以犧牲層為掩膜，通過刻蝕工藝，在基片上形成微孔陣列； 步驟5 :取一蓋片，去除表面有機(jī)及無機(jī)雜質(zhì)，并進(jìn)行真空干燥； 步驟6 :在蓋片正面旋涂PDMS膜，并加熱使PDMS膜固化； 步驟7 :對(duì)PDMS膜進(jìn)行表面處理，并將DNA探針結(jié)合在PDMS膜的表面； 步驟8 :將基片與蓋片鍵合，使基片上微孔陣列中的每個(gè)微孔形成獨(dú)立反應(yīng)池，形成固相-數(shù)字PCR芯片。
2.如權(quán)利要求I所述的固相-數(shù)字PCR芯片的制作方法，其中所述基片上微孔陣列以矩形、環(huán)形、鏡像或密排的形式排布，且微孔數(shù)目大于5000，其微孔深度大于5微米。
3.如權(quán)利要求2所述的固相-數(shù)字PCR芯片的制作方法，其中所述基片上微孔陣列中的微孔形狀為正多邊形或圓形，正多邊形的外接圓的直徑或圓形的直徑大于5微米，微孔的孔壁厚度大于2微米。
4.如權(quán)利要求I所述的固相-數(shù)字PCR芯片的制作方法，其中所述基片的材料為硅片、石英片、光纖面板或有機(jī)薄片。
5.如權(quán)利要求I所述的固相-數(shù)字PCR芯片的制作方法，其中所述蓋片上旋涂的PDMS膜的厚度為5微米到500微米。
6.如權(quán)利要求5所述的固相-數(shù)字PCR芯片的制作方法，其中所述蓋片上PDMS膜表面處理方式為氧等離子體處理或表面活性劑處理。
7.如權(quán)利要求6所述的固相-數(shù)字PCR芯片的制作方法，其中所述蓋片的材料為石英片或硅片。
8.一種固相-數(shù)字PCR芯片，包括 一基片; 一微孔陣列，該微孔陣列通過光刻工藝和兩步刻蝕工藝制作在基片上； 一蓋片; 一 PDMS膜，該P(yáng)DMS膜通過旋涂、加熱固化在蓋片表面； 該基片，微孔陣列，蓋片與PDMS膜形成了固相-數(shù)字PCR芯片。
9.如權(quán)利要求8所述的固相-數(shù)字PCR芯片，其中所述基片的材料為硅片、石英片、光纖面板或有機(jī)薄片。
10.如權(quán)利要求8所述的固相-數(shù)字PCR芯片，其中所述蓋片的材料為石英片或硅片。
11.如權(quán)利要求10所述的固相-數(shù)字PCR芯片，其中所述蓋片上旋涂的PDMS膜的厚度為5微米到500微米。
12.如權(quán)利要求8所述的固相-數(shù)字PCR芯片，其中所述基片上微孔陣列以矩形、環(huán)形、鏡像或密排的形式排布，且微孔數(shù)目大于5000，其微孔深度大于5微米。
13.如權(quán)利要求12所述的固相-數(shù)字PCR芯片，其中所述基片上微孔陣列中的微孔形狀為正多邊形或圓形，正多邊形的外接圓的直徑或圓形的直徑大于5微米，微孔的孔壁厚度大于2微米。
全文摘要
一種固相-數(shù)字PCR芯片的制作方法，包括如下步驟步驟1取一基片，去除表面有機(jī)及無機(jī)雜質(zhì)，并進(jìn)行真空干燥；步驟2在基片正面生長犧牲層；步驟3通過光刻工藝和刻蝕工藝將掩模圖形轉(zhuǎn)移到犧牲層上；步驟4以犧牲層為掩膜，通過刻蝕工藝，在基片上形成微孔陣列；步驟5取一蓋片，去除表面有機(jī)及無機(jī)雜質(zhì)，并進(jìn)行真空干燥；步驟6在蓋片正面旋涂PDMS膜，并加熱使PDMS膜固化；步驟7對(duì)PDMS膜進(jìn)行表面處理，并將DNA探針結(jié)合在PDMS膜的表面；步驟8將基片與蓋片鍵合，使基片上微孔陣列中的每個(gè)微孔形成獨(dú)立反應(yīng)池，形成固相-數(shù)字PCR芯片。本發(fā)明具有制作簡單，易操作，成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12M1/34GK102899244SQ201210369310
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月27日
發(fā)明者韓偉靜, 魏清泉, 孫英男, 李運(yùn)濤, 俞育德, 周曉光 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院半導(dǎo)體研究所