專利名稱：一種選育快速發(fā)酵黃酒釀酒酵母的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種對黃酒釀酒酵母進(jìn)行選育，提高篩選效率，獲得快速發(fā)酵黃酒釀酒酵母菌的方法，屬于微生物育種領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
黃酒是我國民族特色酒精飲料的典型代表，與啤酒和葡萄酒并稱世界三大古酒。麥曲糖化，酒母發(fā)酵的獨特釀造方式使得黃酒釀造技術(shù)成為中華民族智慧的杰出代表(曲被譽(yù)為中國的第五大發(fā)明)。隨著現(xiàn)代黃酒釀造技術(shù)的發(fā)展，傳統(tǒng)的缸壇發(fā)酵的操作方式逐步被以大罐發(fā)酵為代表的現(xiàn)代化、機(jī)械化黃酒生產(chǎn)技術(shù)所取代。黃酒釀造機(jī)理的明晰也逐 步確立了黃酒酵母在黃酒發(fā)酵過程中的關(guān)鍵作用。黃酒酵母菌株的性能往往成為影響黃酒發(fā)酵效率，黃酒品質(zhì)的重要因素，因此優(yōu)良黃酒酵母的開發(fā)對于提升黃酒生產(chǎn)效率，促進(jìn)黃酒品質(zhì)具有重要意義。當(dāng)前國際與我國政策的規(guī)定，對于食品生產(chǎn)用菌的改造僅限于用傳統(tǒng)手段，如菌種誘變，細(xì)胞融合等。雖然細(xì)胞融合能突破種間甚至屬間進(jìn)行育種，但就單一提高菌株某方面特性，誘變方式具有細(xì)胞融合無法比擬的優(yōu)點，如高效簡單，成本低。目前我國對于黃酒酵母菌種的研究工作相對滯后，對黃酒酵母的選育多采用自然分離篩選，傳統(tǒng)誘變，TTC篩選等操作方式[[I]謝廣發(fā)，鄭志強(qiáng)快速發(fā)酵黃酒酵母的篩選[J].中國釀造，2010，221 (8) :12-14. [2]王梅，張彭湃，帥桂蘭等.TTC在黃酒酵母選育中的應(yīng)用[J].釀酒，2001，28(5) :62-64. [3]王曉娟.低產(chǎn)尿素黃酒酵母的選育及黃酒發(fā)酵工藝研究[D].新疆新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009. [4]張建煒，肖冬光，張翠英等.優(yōu)良黃酒酵母單倍體的分離篩選[J]. 2010，191 (5) :36-41.]，缺少一種有效的篩選指標(biāo)，故存在技術(shù)手段單一，盲目性大，過程繁瑣，篩選工作量大，效率低下等缺點，這也造成我國黃酒酵母菌種的改良選育成果較少。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于克服我國現(xiàn)階段對于黃酒釀酒酵母育種中存在的手段單一，盲目性大，過程繁瑣，篩選工作量大，效率低下等缺點，提供一種篩選快速發(fā)酵優(yōu)良黃酒釀酒酵母的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案一種選育快速發(fā)酵黃酒釀酒酵母iSaccharomycescerevisiae)的方法，由以下步驟組成
(I)將被篩選的黃酒釀酒酵母接種至含有對酵母致死劑量克霉唑的藥物篩選培養(yǎng)基
中；
(2 )挑取可在篩選培養(yǎng)基中生長的菌落后進(jìn)行發(fā)酵試驗(還原糖利用能力、發(fā)酵力、發(fā)酵速率的測定)，發(fā)酵速率提升的黃酒釀酒酵母即為所選育的菌株。藥物篩選培養(yǎng)基成分為2%葡萄糖，2%瓊脂，0. 67%YNB，致死劑量克霉唑(不同酵母致死劑量不一致)，用去離子水定容至100% ;其中被篩選的酵母包括經(jīng)過基因修飾的黃酒釀酒酵母或未經(jīng)基因修飾的黃酒釀酒酵母。所述方法所獲得的快速發(fā)酵黃酒釀酒酵母菌株cerevisiae)XY-3，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為=CGMCC No.6329，該菌株具有克霉唑藥物抗性的特點，也具有發(fā)酵速率提升的特點。所述方法所獲得的黃酒釀酒酵母具有I種以上藥物抗性即多藥物抗性，或藥物抗性增強(qiáng)的特性。本發(fā)明的有益效果利用藥物抗性作為篩選指標(biāo)，能有效提高篩選效率。因此藥物抗性釀酒酵母是快速發(fā)酵釀酒酵母篩選的新方法，提高了篩選效率，對優(yōu)良酵母的篩選具有一定的指導(dǎo)意義，為我國釀酒酵母的育種提供了重要資料。生物材料樣品保藏一種釀酒酵母菌株cererisiae) XY-3,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia :北京市朝陽區(qū)北 辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為=CGMCC No. 6329，保藏日期2012年7月12日。
圖I實施例所獲得優(yōu)良酵母XY-3與原始酵母XY發(fā)酵速率比較。圖2實施例所獲得優(yōu)良酵母XY-3與原始酵母XY釀酒小試中乙醇與甘油變化曲線。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，具體實施例應(yīng)理解為僅為舉例說明，而非限定性，不能以下述舉例說明來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的技術(shù)路線為對原始黃酒釀酒酵母菌株XY (某浙江地區(qū)某黃酒廠生產(chǎn)所用酵母)進(jìn)行UV誘變，篩選克霉唑抗性(CTT)酵母菌，并對CTT酵母進(jìn)行兩級篩選，最終篩選出高效發(fā)酵速率酵母。實施此方法具體步驟如下
(I)糖液培養(yǎng)基制備稱取糯米500g浸泡3d后蒸熟，依次加水1L，糖化酶、液化酶、酸性蛋白酶各200ii L，麥曲45g后混勻，60°C水浴IOh后取清液，_20°C保存待用。(2)不同濃度梯度CTZ平板配制濃度分別為0, 5mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L,30mg/L，40mg/L的CTZ平板，其它物質(zhì)濃度為2%葡萄糖，2%瓊脂，0. 67%YNB(Yeast NitrogenBase without amino acids)。(3) XY生長曲線測定將活化后的黃酒釀酒酵母XY以5%的接種量接種至IOOmLYPD, 30°C搖床培養(yǎng)，定時測量OD600,繪制細(xì)胞生長曲線，以確定XY對數(shù)生長期時間。(4)CTZ致死濃度試驗將活化后的黃酒釀酒酵母XY培養(yǎng)至對數(shù)期，涂布不同濃度梯度的CTZ平板，30°C培養(yǎng)，觀察酵母生長情況。(5 )UV誘變時間試驗用UV燈對數(shù)期黃酒釀酒酵母XY照射不同時間，計算不同時間的死亡率。取細(xì)胞致死率70%左右所對應(yīng)UV照射時間為誘變條
件。(6)CTZr酵母獲得及抗性穩(wěn)定性檢測以上述確定的UV照射時間對XY進(jìn)行誘變，誘變后的酵母涂布于含致死濃度CTZ平板，避光培養(yǎng)。將CTT菌傳代后種點種CTZ平板上，以原始菌株為對照，比較菌落大小，淘汰抗性不穩(wěn)定菌株，共獲28株CTT菌。此步驟能淘汰大量負(fù)突變株。(7)經(jīng)糖液發(fā)酵后篩選出XY-3，XY-16，XY-18，XY-28進(jìn)入下一輪發(fā)酵篩選。(8)快速發(fā)酵酵母二級篩選及發(fā)酵力穩(wěn)定性檢測測量各菌株發(fā)酵力及發(fā)酵速率，確定快速發(fā)酵黃酒釀酒酵母。將獲得的酵母傳20代，檢測各代酵母與原始菌XY發(fā)酵力并比較。最終獲得優(yōu)良菌XY-3。(9)黃酒釀造小試取IOOOg糯米浸泡后蒸熟后加入水IOOOmL,麥曲125g，液化酶與糖化酶各300iiL，酵母200mL后拌勻。30°C前酵4d，17°C后酵10d。定時取樣，測量乙醇濃度及甘油濃度。(10)乙醇及甘油濃度測量方法利用HPLC檢測，液相條件為柱Bio-Rad AminexHPX-87H，柱溫60°C，流動相3mmol/L H2SO4,流量0. 6mL/min,檢測器為示差折光檢測器 (RID)0(11)其它藥物抗性測試結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種選育快速發(fā)酵黃酒釀酒酵母cererisiae)的方法,其特征在于包括以下步驟 (I)將被篩選的黃酒釀酒酵母接種至含有對酵母致死劑量克霉唑的藥物篩選培養(yǎng)基中； 藥物篩選培養(yǎng)基成分為2%葡萄糖，2%瓊脂，O. 67%YNB，致死劑量克霉唑，不同酵母致死劑量不一致，用去離子水定容至100% ;其中被篩選的酵母包括經(jīng)過基因修飾的黃酒釀酒酵母或未經(jīng)基因修飾的黃酒釀酒酵母； (2 )挑取可在篩選培養(yǎng)基中生長的菌落進(jìn)行發(fā)酵試驗，進(jìn)行還原糖利用能力、發(fā)酵力、發(fā)酵速率的測定，發(fā)酵速率提升的黃酒釀酒酵母即為所選育的菌株。
2.用權(quán)利要求I所述方法所獲得的快速發(fā)酵黃酒釀酒酵母菌株cerevisiae) XY_3,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏編號為CGMCC No. 6329，該菌株具有克霉唑藥物抗性的特點，也具有發(fā)酵速率提升的特點。
3.用權(quán)利要求I所述方法所獲得的黃酒釀酒酵母，其特征在于具有I種以上藥物抗性即多藥物抗性，或藥物抗性增強(qiáng)的特性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種選育快速發(fā)酵黃酒釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的方法。屬于微生物育種領(lǐng)域。其主要步驟是通過前處理得到穩(wěn)定的藥物(真菌抑制劑)抗性酵母菌，再從抗性酵母中篩選獲得快速發(fā)酵黃酒釀酒酵母。本發(fā)明是篩選穩(wěn)定的藥物抗性黃酒釀酒酵母的方法，此方法能減少普通篩選工作時帶來的盲目性，提高篩選效率，對優(yōu)良酵母的篩選具有一定的指導(dǎo)意義，為我國黃酒釀酒酵母的育種提供了重要資料。
文檔編號C12N1/18GK102827783SQ20121036016
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月25日
發(fā)明者徐巖, 黃篤厚, 陳雙 申請人:江南大學(xué)