專利名稱：鮸魚est微衛(wèi)星標記的特異引物及篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學DNA標記技術(shù)與應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及海洋經(jīng)濟魚類鯢魚(.Miichthys miiuy) EST (Express Sequence Tag,表達序列標簽)微衛(wèi)星標記的特異引物及鯢魚EST微衛(wèi)星標記的篩選方法。
背景技術(shù)：
鯢魚(Miichthysmiiuy),屬脊索動物門(Phylum Chordata)、硬骨魚綱(Osteichyes)、S盧形目(Perciformes)、石首魚科(Sciaenidae )、鏡魚屬(Miichthys) 稱米魚、黑鯢，主要分布于西太平洋西部，包括中國的黃海及東海，朝鮮和日本南部，為近海暖溫水性中下層魚類。鯢魚肉鮮嫩似黃魚，無腥味，肉質(zhì)可和野生大黃魚相媲美，是海產(chǎn)經(jīng)濟魚類之一，也是經(jīng)濟價值較高的魚類，又具有個體大、生長快、食性廣等諸多優(yōu)點，是近海網(wǎng)箱養(yǎng)魚優(yōu)良品種。遺傳改良或品種培育是鯢魚養(yǎng)殖發(fā)展的動力，研究表明，遺傳變異水平與生物的生長速度、抗病能力與生產(chǎn)性狀密切相關(guān)，因此，開發(fā)鯢魚的分子遺傳標記，檢測鯢魚遺傳多樣性、研究其遺傳結(jié)構(gòu)，進而實施分子輔助育種，對于鯢魚的育種和養(yǎng)殖都具有十分重要的意義。EST是通過對cDNA文庫的克隆子隨機測序得到的DNA序列，能反映mRNA的信息，是功能基因的一部分。與gSSR標記相比，從EST序列中篩選微衛(wèi)星序列(EST-SSR)更經(jīng)濟、更有特點一方面具有了基因組微衛(wèi)星標記的優(yōu)點，同時又因EST是功能基因的表達片段，在其中發(fā)現(xiàn)的微衛(wèi)星標記具備直接標記功能基因的優(yōu)勢，并可能同一些生產(chǎn)性狀相關(guān)聯(lián)，這些特點對遺傳圖譜構(gòu)建以及標記輔助育種都有很高的應(yīng)用價值。利用EST-SSR，可能把鯢魚重要經(jīng)濟性狀與之關(guān)聯(lián)，達到分子輔助育種的目的，并可進一步進行鯢魚功能基因的研究。目前還未見鯢魚EST微衛(wèi)星標記的研究報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供鯢魚EST微衛(wèi)星標記的特異引物，以及利用該特異引物進行鯢魚EST微衛(wèi)星標記篩選的方法。為實現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，發(fā)明人提供如下技術(shù)方案
發(fā)明人首先提供了鯢魚EST微衛(wèi)星標記的特異引物，分別為
Mimi-5-B04
F:CTACCGCTGCTCTTCG (SEQ ID NO. I), R:GATGGCTGGTCTACTTCG (SEQ ID NO. 2)；Mimi-13-G10
F:GCGACAACGCAGACAGGA (SEQ ID NO. 3), R:CTTGGGCGGATGGTAGGA (SEQ ID NO. 4)；Mimi-16-E10 F:GTTCTTTCACTGGCATCT (SEQ ID NO. 5), R:GCTGTTTCCACCTGTTTT (SEQ ID NO. 6)；Mimi-33-G06
F:GGTAGGAGACTGGGTGGT (SEQ ID NO. 7), R:CAATGTTTCAGGCAAATGTA (SEQ ID NO. 8)；Mimi-43-H04:
F:GCTTCCTGTCCCGTTTAT (SEQ ID NO. 9), R:TTTGCTCCCGTGGGTTAT (SEQ ID NO. 10)；Mimi-40-H12
F:TCATCAGCACCAGCCTCTCSEQ ID NO. 11),R:CACATCCTCTTACCTCCTATCTCSEQ ID NO. 12)；Mimi-41-Ell:
F:CCTCCTTCACCTCACCTT (SEQ ID NO. 13), R:ACATCTGTCCAGCCTCT (SEQ ID NO. 14)； Mimi-42-G06:
F:TTGTTGTCTCGGTGATGG (SEQ ID NO. 15)，R:GACTCCTGCTGTTGCTCC (SEQ ID NO. 16)；Mimi-54-All
F:AACCAAAGGGACCAAACG (SEQ ID NO. 17)，R:GGAGCAGGCAGGTAAACG (SEQ ID NO. 18)；Mimi-56-G05
F:AGACACCCGACCAGAACC (SEQ ID NO. 19), R:ACAGCCTCCATCCACAAA (SEQ ID NO. 20)。從鯢魚ESTs序列進行微衛(wèi)星分析的步驟是從發(fā)明人實驗室測序獲得的EST序列中，利用Tandem Repeat Finder (TRF)軟件,參數(shù)設(shè)計如下按A、T、G、C排列組合的重復(fù)單元為2-6個核苷酸，且其最低重復(fù)次數(shù)分別為7、5、4、3、3，微衛(wèi)星核心序列的最小長度為14bp，以此標準查找分析所得的序列，獲得含有微衛(wèi)星重復(fù)的EST序列；利用引物設(shè)計軟件Primer Premier5. O在微衛(wèi)星兩端的側(cè)翼序列設(shè)計特異引物。對于鯢魚的ESTs設(shè)計引物，其引物設(shè)計參數(shù)為⑴引物長度為18_25bp;⑵GC含量大于40%;⑶退火溫度大于40° C，且正反引物退火溫度相差不超過5° C;⑷預(yù)期的PCR產(chǎn)物長度為100-300bp ;(5)盡量避免二級結(jié)構(gòu)。本發(fā)明還提供了一種鯢魚EST微衛(wèi)星標記的篩選方法，首先利用從鯢魚CDNA文庫中測序獲得的EST序列，利用微衛(wèi)星檢索軟件Tandem Repeat Finder (TRF)進行微衛(wèi)星位點的查找，對于2-6個堿基重復(fù)單元重復(fù)次數(shù)依次大于7，5，4，3，3次的微衛(wèi)星片段進行篩選分離，從而得到含有微衛(wèi)星重復(fù)的ESTs序列；然后在微衛(wèi)星重復(fù)序列兩端的側(cè)翼序列設(shè)計特異引物，并進一步檢測優(yōu)化引物成為微衛(wèi)星標記；最后對微衛(wèi)星標記的重復(fù)性、穩(wěn)定性和多態(tài)性進行綜合評價，得到EST微衛(wèi)星標記，其中，所述的篩選到的EST微衛(wèi)星標記的特異引物分別為
Mimi-5-B04
F:CTACCGCTGCTCTTCG (SEQ ID NO. I), R:GATGGCTGGTCTACTTCG (SEQ ID NO. 2)；Mimi-13-G10
F:GCGACAACGCAGACAGGA (SEQ ID NO. 3), R:CTTGGGCGGATGGTAGGA (SEQ ID NO. 4)；Mimi-16-E10
F:GTTCTTTCACTGGCATCT (SEQ ID NO. 5), R:GCTGTTTCCACCTGTTTT (SEQ ID NO. 6)；Mimi-33-G06
F:GGTAGGAGACTGGGTGGT (SEQ ID NO. 7), R:CAATGTTTCAGGCAAATGTA (SEQ ID NO. 8)；Mimi-43-H04:F:GCTTCCTGTCCCGTTTAT (SEQ ID NO. 9), R:TTTGCTCCCGTGGGTTAT (SEQ ID NO. 10)；Mimi-40-H12
F:TCATCAGCACCAGCCTCTCSEQ ID NO. 11),R:CACATCCTCTTACCTCCTATCTCSEQ ID NO. 12)；Mimi-41-Ell:
F:CCTCCTTCACCTCACCTT (SEQ ID NO. 13), R:ACATCTGTCCAGCCTCT (SEQ ID NO. 14)；Mimi-42-G06:
F:TTGTTGTCTCGGTGATGG (SEQ ID NO. 15)，R:GACTCCTGCTGTTGCTCC (SEQ ID NO. 16)；Mimi-54-All
F:AACCAAAGGGACCAAACG (SEQ ID NO. 17)，R:GGAGCAGGCAGGTAAACG (SEQ ID NO. 18)；Mimi-56-G05 F:AGACACCCGACCAGAACC (SEQ ID NO. 19), R:ACAGCCTCCATCCACAAA (SEQ ID NO. 20)。作為優(yōu)選方案，根據(jù)本發(fā)明所述的一種鯢魚EST微衛(wèi)星標記的篩選方法，其中，所述的特異引物對鯢魚進行PCR擴增，其中擴增體系為總體積20 μ 1，其中含有內(nèi)含I. 5mMMg2+的 IXPCR buffer,O. 2μΜ dNTP, IU Taq 聚合酶，模板量為 50_100ng ;PCR 反應(yīng)程序為95° C變性5分鐘之后進入循環(huán)，95° C變性30秒，退火溫度退火30秒，72° C延伸30秒，進行30個循環(huán)，最終72° C延伸5分鐘，各個引物的最佳退火溫度在預(yù)期退火溫度上下浮動10° C之間進行優(yōu)化，直至預(yù)期產(chǎn)物清晰單一。作為優(yōu)選方案，根據(jù)本發(fā)明所述的一種鯢魚EST微衛(wèi)星標記的篩選方法，其中，所述的特異引物對鯢魚進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物的檢測方法如下擴增得到的產(chǎn)物在用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳(電壓5-lOV/cm，15-20分鐘)檢測擴增特異性后，再用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離，然后再用硝酸銀染色系統(tǒng)進行檢測，分析確定多態(tài)性。作為更優(yōu)選，所述的變性聚丙烯凝膠電泳主要工藝參數(shù)為恒壓1000-1500V、功率200W，電泳1_2個小時。作為優(yōu)選方案，根據(jù)本發(fā)明所述的一種鯢魚EST微衛(wèi)星標記的篩選方法，其中，篩選獲得重復(fù)性好，穩(wěn)定的多態(tài)豐富的微衛(wèi)星標記，其步驟是根據(jù)上述篩選方法中要求的利用至少兩個體分析得到的多態(tài)引物，繼續(xù)用大量個體檢測其重復(fù)性和穩(wěn)定性，同時得到其多態(tài)特征。本發(fā)明的優(yōu)點是
本發(fā)明可方便快捷的用于做鯢魚種質(zhì)資源和遺傳多樣性的分析，分子種群遺傳學、種質(zhì)資源鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建和功能基因的研究，進一步用于鯢魚的分子設(shè)計育種和資源調(diào)查。
圖I是Mimi-40-H12 EST-SSR標記變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的結(jié)果；
圖2是Mimi-43-H04 EST-SSR標記變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的結(jié)果；
圖3是Mimi-33-G06 EST-SSR標記變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的結(jié)果；
圖4是Mimi-5-B04 EST-SSR標記變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的結(jié)果；
圖5是Mimi-16-E10 EST-SSR標記變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的結(jié)果；
圖6是Mimi-42-G06 EST-SSR標記變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的結(jié)果；圖7是Mimi-13-G10 EST-SSR標記變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的結(jié)果；
圖8是Mimi-54-All EST-SSR標記變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的結(jié)果；
圖9是Mimi-56-G05 EST-SSR標記變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的結(jié)果；
圖10是Mimi-41-Ell EST-SSR標記變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例和說明書附圖，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)當理解，本發(fā)明的實施并不局限于下面的實施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護范圍。 在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設(shè)備和原料等均可從市場購得或是本行業(yè)常用的。若無特別指明，實施例采用的方法為本領(lǐng)域通用技術(shù)。主要材料、試劑和儀器設(shè)備眼科剪，鑷子，1.5ml離心管，微量移液器、微量移液器槍頭。脫氧核糖核苷酸dNTP，熱聚合Taq酶，小型離心機(Qspin ，BAYGENE),渦旋振蕩器(QL-866 型，QILINEBEIER)，pH 計(Mettler Toledo 320PH Meter)、高壓蒸氣滅菌鍋(SANYO)、電泳儀(DYY-6C型，北京六一)、電泳儀(DYY-12C型，北京六一)、DNA序列分析電泳儀(DYCZ-20C型，北京六一)、調(diào)速多用振蕩器(HY-2型，上海國華)、水浴鍋(上海精宏)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad GD2000)、PCR 儀(ABI Veriti 96well Thermal Cycler)。實驗樣本鯢魚采集于浙江省海洋水產(chǎn)研究所。本發(fā)明實施例所用的常規(guī)藥品苯酚氯仿抽提液(25:24:1)，甲醛，氫氧化鈉(分析純)，硝酸銀，氯化鈉(分析純)，尿素，丙烯酰胺，甲叉，Tris-堿，硼酸，乙二胺四乙酸(EDTA)，過硫酸銨，十二烷基硫酸鈉(SDS)，無水乙醇購自國藥集團瓊脂糖，溴化乙錠，去離子甲酰胺，TEMED，蛋白酶K等購自Takara公司，脫氧核糖核苷酸dNTP，熱聚合Taq酶購自TIANGEN公司，質(zhì)粒文庫測序由華大基因公司完成，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；
本發(fā)明實施例所用主要儀器包括小型離心機(Qspin ，BAYGENE),渦旋振蕩器(QL-866 型，QILINEBEIER), pH 計(Mettler Toledo 320PH Meter)、高壓蒸氣滅菌鍋(SANYO)、電泳儀(DYY-6C型，北京六一)、電泳儀(DYY-12C型，北京六一)、DNA序列分析電泳儀(DYCZ-20C型，北京六一)、調(diào)速多用振蕩器(HY-2型，上海國華)、水浴鍋(上海精宏)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad GD2000)、PCR 儀(ABI Veriti 96well Thermal Cycler)。實施例中未注明具體條件的實驗方法，是按照常規(guī)條件，例如Sambrook等作者的分子克隆實驗室手冊(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商說明書建議的條件。實施例I
I、微衛(wèi)星位點的來源和微衛(wèi)星序列的篩選
從發(fā)明人實驗室測序獲得的EST序列，利用微衛(wèi)星檢測軟件Tandem Repeat Finder(TRF)進行微衛(wèi)星位點的查找，對于2-6個堿基重復(fù)單元重復(fù)次數(shù)依次大于7，5，4，3，3次的微衛(wèi)星片段進行篩選分離，從而得到含有微衛(wèi)星重復(fù)的ESTs序列。利用引物設(shè)計軟件Primer Premier5. O在微衛(wèi)星兩端的側(cè)翼序列設(shè)計特異引物。2、微衛(wèi)星標記引物的設(shè)計在微衛(wèi)星重復(fù)區(qū)的側(cè)翼序列利用軟件Primer Premier5. O設(shè)計引物，引物要求滿足以下條件(1)引物長度為18_25bp;⑵GC含量大于40% ;(3)退火溫度大于40° C，且正反引物退火溫度相差不超過5° C ；(4)預(yù)期的PCR產(chǎn)物長度為100-300bp ;(5)盡量避免二級結(jié)構(gòu)。3、引物的優(yōu)化
各引物的最佳退火溫度在預(yù)期退火溫度上下浮動10° C之間進行優(yōu)化，直至預(yù)期目的產(chǎn)物能被清晰穩(wěn)定的擴增。PCR擴增的反應(yīng)程序為95° C變性5分鐘之后進入循環(huán)，95° C變性30秒，退火溫度退火30秒，72° C延伸30秒，進行30個循環(huán)，最終72° C延伸5分鐘。反應(yīng)體系為:總體積20 μ 1，其中含有IXPCR buffer (內(nèi)含I. 5mMMg2+)，O. 2 μ M dNTP,IU Taq聚合酶，模板量為50_100ng。模板是隨機的兩個鯢魚個體的DNA混合池。擴增得到的產(chǎn)物用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳-EB染色系統(tǒng)進行檢測，選擇單一或雜帶少、特異性產(chǎn)物較高的溫度作為最佳退火溫度。4、微衛(wèi)星位點的確定
根據(jù)步驟3中優(yōu)化的退火溫度選取30個個體檢測這些微衛(wèi)星標記的多態(tài)性。PCR反應(yīng)程序為95° C變性5分鐘之后進入循環(huán)，95° C變性30秒，退火溫度退火30秒，72° C延伸30秒，進行30個循環(huán)，最終72° C延伸5分鐘。反應(yīng)體系為總體積20 μ 1，其中含有IXPCR buffer (內(nèi)含 I. 5mMMg2+)，0. 2μΜ dNTP，IUTaq 聚合酶，模板量為 50_100ng。PCR 擴增產(chǎn)物用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，恒壓1000-1500V，功率200W，電泳1_2個小時，硝酸銀染色系統(tǒng)進行檢測，干燥后分析確定多態(tài)性，最后篩選出10個鯢魚微衛(wèi)星標記，這些標記的具體信息如表I。表I.開發(fā)獲得的10個鯢魚(Miichthys miiuy)的EST-SSR標記
權(quán)利要求
1.鯢魚EST微衛(wèi)星標記的特異引物，其特征是所述的特異引物為Mimi-13-G10 F:GCGACAACGCAGACAGGA, R:CTTGGGCGGATGGTAGGA
2.一種鯢魚EST微衛(wèi)星標記的篩選方法，其特征是首先利用從鯢魚cDNA文庫中測序獲得的EST序列，利用微衛(wèi)星檢索軟件Tandem Repeat Finder進行微衛(wèi)星位點的查找，對于2-6個堿基重復(fù)單元重復(fù)次數(shù)依次大于7，5，4，3，3次的微衛(wèi)星片段進行篩選分離，從而得到含有微衛(wèi)星重復(fù)的ESTs序列；然后在微衛(wèi)星重復(fù)序列兩端的側(cè)翼序列設(shè)計特異引物，并進一步檢測優(yōu)化引物成為微衛(wèi)星標記；最后對微衛(wèi)星標記的重復(fù)性、穩(wěn)定性和多態(tài)性進行綜合評價，得到EST微衛(wèi)星標記，其中，所述的篩選到的EST微衛(wèi)星標記的特異引物為Mimi-13-G10 F:GCGACAACGCAGACAGGA, R:CTTGGGCGGATGGTAGGA。
3.如權(quán)利要求2所述的一種鯢魚EST微衛(wèi)星標記的篩選方法，其特征是所述的特異弓I物對鯢魚進行PCR擴增，其中擴增體系為總體積20 μ ，其中含有內(nèi)含I. 5mMMg2+的IXPCR buffer,0. 2μΜ dNTP, IU Taq 聚合酶，模板量為 50_100ng ;PCR 反應(yīng)程序為95° C變性5分鐘之后進入循環(huán)，95° C變性30秒，退火溫度退火30秒，72° C延伸30秒，進行30個循環(huán)，最終72° C延伸5分鐘，各個引物的最佳退火溫度在預(yù)期退火溫度上下浮動10° C之間進行優(yōu)化，直至預(yù)期產(chǎn)物清晰單一。
4.如權(quán)利要求2或3所述的一種鯢魚EST微衛(wèi)星標記的篩選方法，其特征是所述的特異引物對鯢魚進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物的檢測方法如下擴增得到的產(chǎn)物在用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增特異性后，再用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后再用硝酸銀染色系統(tǒng)進行檢測，分析確定多態(tài)性。
5.如權(quán)利要求4所述的一種鯢魚EST微衛(wèi)星標記的篩選方法，其特征是所述的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳主要工藝參數(shù)為恒壓1000-1500V、功率200W，電泳1_2個小時。
全文摘要
本發(fā)明是申請?zhí)枮?01110192093.9的分案申請。屬于分子生物學DNA標記技術(shù)與應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及鮸魚EST微衛(wèi)星標記的特異引物及篩選方法。所述微衛(wèi)星標記的特異引物的核苷酸序列分別為SEQIDNO.1至SEQIDNO.20所示。本發(fā)明建立了一種篩選方式，可方便快捷的用于做鮸魚種質(zhì)資源和遺傳多樣性的分析，分子種群遺傳學、種質(zhì)資源鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建和功能基因的研究，進一步用于鮸魚的分子設(shè)計育種和資源調(diào)查。
文檔編號C12N15/10GK102876777SQ20121032569
公開日2013年1月16日 申請日期2011年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月11日
發(fā)明者徐田軍, 王日昕, 孫典巧, 孫悅娜 申請人:浙江海洋學院