專利名稱：激光誘變蛋白核淡水小球藻快速積累油脂突變?cè)逯甑姆椒?br>
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種激光誘變蛋白核淡水小球藻快速積累油脂突變?cè)逯甑姆椒?，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
小球藻(Chlorella)是一種常見(jiàn)的水生單細(xì)胞藻類，是綠藻小球藻科中的一個(gè)重要屬，生態(tài)分布廣泛，在海水和淡水中均有分布，目前包括大約10個(gè)種。小球藻細(xì)胞內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)、必需氨基酸、多糖、脂類、葉綠素、胡蘿卜素和維生素等等，在保健食品、水產(chǎn)養(yǎng)殖、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域內(nèi)應(yīng)用廣泛，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)供不應(yīng)求。與美國(guó)、日本、以色列等國(guó)家相比，我國(guó)的小球藻工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)水平相對(duì)滯后。蛋白核淡水小球藻是一種球形單細(xì)胞淡水藻類，通常生長(zhǎng)在富營(yíng)養(yǎng)化的水體中，但在人工培養(yǎng)條件下能大量生長(zhǎng)繁殖。營(yíng)養(yǎng)鹽、光照、PH值、溫度、微量元素、碳酸氫銨等因素均能影響該藻生長(zhǎng)。目前，小球藻產(chǎn)業(yè)化培·養(yǎng)主要采用傳統(tǒng)的開放式戶外大池培養(yǎng)方式，該方式的培養(yǎng)生物量普遍較低，且具有生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、易污染等缺點(diǎn)。光生物反應(yīng)器培養(yǎng)是進(jìn)行小球藻光合自養(yǎng)的經(jīng)典途徑，但成本高、規(guī)模小等缺點(diǎn)也限制了其發(fā)展。化石能源的短缺和嚴(yán)重的環(huán)境污染使得可再生能源的開發(fā)變得非常迫切。微藻因易培養(yǎng)、含油量高和不與農(nóng)爭(zhēng)地等優(yōu)點(diǎn)被國(guó)內(nèi)外專家視為唯一有可能完全替代化石能源的生物柴油原料。目前，利用微藻生產(chǎn)生物柴油成本還太高，價(jià)格上與化石能源相比沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)力。獲取優(yōu)良產(chǎn)油藻株是降低利用微藻制備生物柴油成本最關(guān)鍵和的最有效一步。激光是一種光量子流，作為一種新型基因突變誘變劑，具有能量密度高、單色性好、方向性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、變異率高、速度快、造價(jià)低、損傷輕、無(wú)污染、安全性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)。我國(guó)的激光誘變育種自上世紀(jì)70年代初起步以來(lái)，在糧食作物、經(jīng)濟(jì)作物、水產(chǎn)及微生物領(lǐng)域都取得了豐碩的成果。微藻是進(jìn)行激光誘變的優(yōu)良材料，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生命周期短、光敏性強(qiáng)、代謝過(guò)程極易受環(huán)境影響，也容易被檢測(cè)。國(guó)內(nèi)有關(guān)激光對(duì)微藻的誘變效應(yīng)研究起步于上世紀(jì)九十年代，僅限于螺旋藻、雨生紅球藻等少數(shù)經(jīng)濟(jì)微藻，但均取得了比較理想的效果。福建師范大學(xué)莊慧如課題組從2000年開始在這方面作了一些有益的探索，利用激光對(duì)微藻進(jìn)行誘變，得到的誘變株生長(zhǎng)速率、色素、蛋白質(zhì)、可溶性多糖含量等均比出發(fā)株有不同程度的提高。福建師范大學(xué)公布了一種激光-微波誘變選育富硒紫球藻變株的方法(200410039822)，涉及利用YAG激光和微波誘變結(jié)合富硒馴化，篩選富硒紫球藻變株的方法。所采用的激光、微波誘變?cè)O(shè)備簡(jiǎn)單、操作安全、誘變效果好，在微藻藻種選育中有較大的推廣價(jià)值。目前，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上已經(jīng)公開了一些刺激小球藻快速生長(zhǎng)的相關(guān)專利技術(shù)，大多數(shù)是針對(duì)培養(yǎng)基成分改良的。如華東理工大學(xué)公布了一種適合于普通小球藻高密度高品質(zhì)培養(yǎng)的培養(yǎng)基組合物(200610024004)，所述培養(yǎng)基基本上由KNO3 (7 11克/升)、葡萄糖(25 35克/升)以及少量無(wú)機(jī)鹽、微量元素和水組成。該發(fā)明的培養(yǎng)基可使普通小球藻達(dá)到高密度培養(yǎng)的前提下，藻體品質(zhì)與異養(yǎng)培養(yǎng)相比有較大幅度提高，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)達(dá)到光自養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)的水平。清華大學(xué)提供了一種高密度培養(yǎng)異養(yǎng)小球藻的方法(200610078003)。該方法是在通氣培養(yǎng)瓶中加入含葡萄糖的培養(yǎng)基和少許添加劑CSL，在異養(yǎng)條件下快速培養(yǎng)小球藻，該技術(shù)解決了異養(yǎng)小球藻對(duì)葡萄糖利用不充分的問(wèn)題，從而簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝、降低了生產(chǎn)成本、有利于異養(yǎng)小球藻的大規(guī)模高濃度培養(yǎng)，缺點(diǎn)是小球藻收獲生物量偏低。還有一些是通過(guò)優(yōu)化光生物反應(yīng)器或發(fā)酵罐培養(yǎng)條件來(lái)實(shí)現(xiàn)小球藻的高密度培養(yǎng)。如華東理工大學(xué)提供了一種高密度高品質(zhì)培養(yǎng)小球藻的方法(200610025618)，該培養(yǎng)方法包括生物反應(yīng)器高密度異養(yǎng)培養(yǎng)、高密度藻液的稀釋和光自養(yǎng)培養(yǎng)三個(gè)階段。可使小球藻在較短的培養(yǎng)周期里細(xì)胞密度達(dá)到高密度培養(yǎng)的水平，還可使小球藻的品質(zhì)與異養(yǎng)培養(yǎng)相比有較大幅度提高，達(dá)到了光自養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)的水平。北京科技大學(xué)提供了一種能夠無(wú)光照異養(yǎng)生長(zhǎng)的小球藻種及培養(yǎng)方法(200510086288)，采用無(wú)光照異養(yǎng)批量和發(fā)酵培養(yǎng)方法，可以在3 6天時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)出小球藻，細(xì)胞干重濃度達(dá)到20 50g / L的小球藻培養(yǎng)物，經(jīng)過(guò)離心、干燥和壓片后可以作為人類健康食品或醫(yī)藥品。缺點(diǎn)是操作流程復(fù)雜，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，并涉及光生物反應(yīng)器和發(fā)酵罐等儀器設(shè)備的使用。清華大學(xué)公開了一種利用異養(yǎng)小球藻高密度發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油的方法(200810100871)。該方法是以在生物反應(yīng)器中高密度發(fā)酵培養(yǎng)的異養(yǎng)小球藻為原料，主要通過(guò)高生長(zhǎng)速率與高油脂含量藻種的篩選、直接接種至搖瓶中作為一級(jí)種子培養(yǎng)和轉(zhuǎn)接至發(fā)酵罐中進(jìn)行二級(jí)高密度發(fā)酵培養(yǎng)，進(jìn)行條件優(yōu)化與過(guò)程控制，收集藻體后經(jīng)過(guò)分離、收集并干燥、抽提藻油，再經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)來(lái)制備生物柴油。清華大學(xué)還同·時(shí)公開了一種從自養(yǎng)到異養(yǎng)兩步培養(yǎng)小球藻生產(chǎn)生物柴油的方法(200810112998)，該專利中除了小球藻的初步培養(yǎng)技術(shù)略有差別，其余生產(chǎn)工藝相似。此外，清華大學(xué)最近公開了一種小球藻及其培養(yǎng)方法和它在生物柴油生產(chǎn)中的應(yīng)用(200910083797)，篩選到一株小球藻YJ1，主要用于構(gòu)建城市污水深度處理工藝，在處理污水的同時(shí)可獲得生物柴油。上述相關(guān)促進(jìn)小球藻生長(zhǎng)和生產(chǎn)生物柴油的專利技術(shù)雖然先進(jìn)，但均未涉及激光輻照誘變高產(chǎn)油微藻育種的內(nèi)容，而且需要光生物反應(yīng)器和發(fā)酵罐等大型專業(yè)設(shè)施，對(duì)設(shè)備要求比較高，技術(shù)工藝相對(duì)復(fù)雜，且費(fèi)用高，這無(wú)疑增加了生產(chǎn)成本和技術(shù)推廣的難度。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有操作簡(jiǎn)單、速度快、造價(jià)低、損傷輕、無(wú)污染、安全性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)且能短期誘變出蛋白核淡水小球藻快速積累油脂突變?cè)逯甑姆椒?。其具體的技術(shù)方案為一種激光誘變蛋白核淡水小球藻快速積累油脂突變?cè)逯甑姆椒?，其特征在于采用如下步驟(I)制備藻液在溫度20_25°C、光強(qiáng)為1800-20001x、光暗比為12h/12h，以日光燈作光源培養(yǎng)蛋白核淡水小球藻細(xì)胞到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，獲得將進(jìn)行激光輻照誘變的藻液；(2)激光輻照誘變?nèi)?0ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期藻液倒于小廣口瓶中，用808nm半導(dǎo)體激光進(jìn)行輻照處理0. 9-1. lmin，輻照過(guò)程中用磁力攪拌保持輻照均勻，獲得突變?cè)逯辏?3)突變?cè)逯昱囵B(yǎng)將輻照誘變后的藻液倒入裝有BGll營(yíng)養(yǎng)鹽的50ml三角瓶?jī)?nèi)，藻液中營(yíng)養(yǎng)鹽的終濃度為1/4倍，在2(T25°C、光強(qiáng)180(T20001x、光暗比為12h/12h條件下培養(yǎng)20天，然后將藻液轉(zhuǎn)接到300ml三角瓶?jī)?nèi)，在上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)20天，再將藻液轉(zhuǎn)接到IOOOml三角瓶?jī)?nèi)，在上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)26天，整個(gè)培養(yǎng)階段每7天添加一次1/4倍濃度的BGll營(yíng)養(yǎng)鹽，每天定時(shí)搖藻3次。
所述的激光誘變蛋白核淡水小球藻快速積累油脂突變?cè)逯甑姆椒ǎ襟E(2)中，半導(dǎo)體激光采用海特光電有限責(zé)任公司生產(chǎn)的L0S-BLD-0808-12W-C- —體化光源激光器，功率6w。所述的激光誘變蛋白核淡水小球藻快速積累油脂突變?cè)逯甑姆椒?，蛋白核淡水小球藻源自中?guó)科學(xué)院水生生物研究所，編號(hào)為31號(hào)的藻株。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)是I、本發(fā)明簡(jiǎn)單易行(短時(shí)間的激光輻照)、造價(jià)低、損傷輕、無(wú)污染、安全性強(qiáng)，原材料蛋白核淡水小球藻細(xì)胞可以按常規(guī)方法自行培養(yǎng)。2、本發(fā)明能誘變出顯著提高總脂含量的蛋白核淡水小球藻突變株，實(shí)驗(yàn)證明，同等條件下培養(yǎng)66天，半導(dǎo)體激光輻照0. 9-1. Imin誘變組突變株與未經(jīng)過(guò)激光輻照處理的出發(fā)株相比，總油脂含量提高到出發(fā)株的3. 64-3. 75倍，總油脂含量分別達(dá)到了藻細(xì)胞干·重的58. 45-59. 67%。具有作為工業(yè)化生物柴油生產(chǎn)用能源微藻藻種的潛力。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中蛋白核淡水小球藻均采用中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所保存的31號(hào)蛋白核淡水小球藻，808nm半導(dǎo)體激光采用海特光電有限責(zé)任公司生產(chǎn)的L0S-BLD-0808-12W-C 一體化光源激光器，功率6w。實(shí)施例I :步驟I、制備藻液在溫度20°C、光強(qiáng)為18001x、光暗比為12h/12h條件下，以日光燈作光源培養(yǎng)蛋白核淡水小球藻細(xì)胞到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使細(xì)胞濃度達(dá)IO8個(gè)/ ml，獲得將進(jìn)行激光輻照誘變的藻液；步驟2、激光輻照誘變?nèi)?0ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期藻液倒于小廣口瓶中，用808nm半導(dǎo)體激光輻照處理0. 9min，輻照過(guò)程中用磁力攪拌保持輻照均勻，獲得突變?cè)逯辏徊襟E3、突變?cè)逯昱囵B(yǎng)將激光輻照細(xì)胞液沖洗入裝有BGll營(yíng)養(yǎng)鹽的50ml三角瓶?jī)?nèi)，藻液中營(yíng)養(yǎng)鹽的終濃度為1/4倍，在溫度20V、光強(qiáng)為18001x、光暗比為12h/12h培養(yǎng)條件下培養(yǎng)20天；然后將上述藻液轉(zhuǎn)接到300ml三角瓶?jī)?nèi)，在上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)20天；再將上述藻液轉(zhuǎn)接到IOOOml三角瓶?jī)?nèi)，在上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)26天。整個(gè)培養(yǎng)階段每7天添加一次1/4倍濃度的BGll營(yíng)養(yǎng)鹽，每天定時(shí)搖藻3次。測(cè)試結(jié)果在上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)66天后，油脂測(cè)試結(jié)果表明半導(dǎo)體激光輻照
0.9min誘變組與未經(jīng)過(guò)激光處理的出發(fā)株相比，總油脂含量提高到出發(fā)株的3. 75倍，達(dá)到細(xì)胞干重的59. 67%。實(shí)施例2:步驟I、制備藻液在溫度23°C、光強(qiáng)為19001x、光暗比為12h/12h條件下，以日光燈作光源培養(yǎng)蛋白核淡水小球藻細(xì)胞到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使細(xì)胞濃度達(dá)IO8個(gè)/ ml，獲得將進(jìn)行激光輻照誘變的藻液；步驟2、激光輻照誘變?nèi)?0ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期藻液倒于小廣口瓶中，用808nm半導(dǎo)體激光輻照處理I. Omin，輻照過(guò)程中用磁力攪拌保持輻照均勻，獲得突變?cè)逯?；步驟3、突變?cè)逯昱囵B(yǎng)將激光輻照細(xì)胞液沖洗入裝有BGll營(yíng)養(yǎng)鹽的50ml三角瓶?jī)?nèi)，藻液中營(yíng)養(yǎng)鹽的終濃度為1/4倍，在溫度23°C、光強(qiáng)為19001x、光暗比為12h/12h培養(yǎng)條件下培養(yǎng)20天；然后將上述藻液轉(zhuǎn)接到300ml三角瓶?jī)?nèi)，在上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)20天；再將上述藻液轉(zhuǎn)接到IOOOml三角瓶?jī)?nèi)，在上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)26天。整個(gè)培養(yǎng)階段每7天添加一次1/4倍濃度的BGll營(yíng)養(yǎng)鹽，每天定時(shí)搖藻3次。測(cè)試結(jié)果在上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)66天后，油脂測(cè)試結(jié)果表明半導(dǎo)體激光輻照I. Omin誘變組與未經(jīng)過(guò)激光處理的出發(fā)株相比，總油脂含量提高到出發(fā)株的3. 72倍，達(dá)到細(xì)胞干重的59. 35%。實(shí)施例3 步驟I、制備藻液在溫度25°C、光強(qiáng)為20001x、光暗比為12h/12h條件下，以日光燈作光源培養(yǎng)蛋白核淡水小球藻細(xì)胞到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使細(xì)胞濃度達(dá)IO8個(gè)/ ml，獲得將進(jìn)行激光輻照誘變的藻液；步驟2、激光輻照誘變?nèi)?0ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期藻液倒于小廣口瓶中，用808nm半導(dǎo)體激光輻照處理I. lmin，獲得突變?cè)逯辏弧げ襟E3、突變?cè)逯昱囵B(yǎng)將激光輻照細(xì)胞液裝有BGll營(yíng)養(yǎng)鹽的50ml三角瓶?jī)?nèi)，藻液中營(yíng)養(yǎng)鹽的終濃度為1/4倍，在溫度25°C、光強(qiáng)為20001x、光暗比為12h/12h培養(yǎng)條件下培養(yǎng)20天；然后將上述藻液轉(zhuǎn)接到300ml三角瓶?jī)?nèi)，在上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)20天；再將上述藻液轉(zhuǎn)接到IOOOml三角瓶?jī)?nèi)，在上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)26天。整個(gè)培養(yǎng)階段每7天添加一次1/4倍濃度的BGll營(yíng)養(yǎng)鹽,每天定時(shí)搖藻3次。測(cè)試結(jié)果在上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)66天后，油脂測(cè)試結(jié)果表明半導(dǎo)體激光輻照I. Imin誘變組與未經(jīng)過(guò)激光處理的出發(fā)株相比，總油脂含量提高到出發(fā)株的3. 64倍，達(dá)到細(xì)胞干重的58. 45%。實(shí)施例的結(jié)果測(cè)試采用以下方法，具體步驟是①將小球藻藻液轉(zhuǎn)移至50ml的離心管中，配平后，在低溫高速離心機(jī)中，于8000rpm下離心IOmin,棄去上清,應(yīng)盡量棄除上清；將收集好的藻泥用于油脂含量測(cè)定；②將準(zhǔn)備好的藻泥置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中100°C干燥過(guò)夜，分別測(cè)量各實(shí)驗(yàn)組干燥粉質(zhì)量Mtl,并記錄數(shù)據(jù)。研磨已稱量的干燥粉，并加入等體積的氯仿和甲醇(1:2，現(xiàn)配現(xiàn)用)在功率40W、周期lmin、破壁15s、間隔5s、3個(gè)循環(huán)的條件下進(jìn)行超聲波破壁，然后將破壁完的藻液分裝于兩個(gè)50mL離心管中，配平后，于低溫高速離心機(jī)中，IOOOOrmp條件下離心IOmin ;④離心完后,取上清液,按3:1 (氯仿上清液)的比例加入氯仿并渦旋混勻。之后再加入與氯仿等體積的水渦旋混勻，靜置待其分層。取下層有機(jī)相轉(zhuǎn)入預(yù)先稱重(M1)的IOml離心管中，用氮吹儀吹干有機(jī)溶劑后稱重M2并記錄數(shù)據(jù)，氮吹儀水浴溫度設(shè)定為61°C ;⑤總脂含量的計(jì)算公式為總脂含量百分比=(M2-M1)ZMciXlOO0/^
權(quán)利要求
1.一種激光誘變蛋白核淡水小球藻快速積累油脂突變?cè)逯甑姆椒ǎ涮卣髟谟诓捎萌缦虏襟E (1)制備藻液在溫度20-25°C、光強(qiáng)為1800-20001X、光暗比為12h/12h，以日光燈作光源培養(yǎng)蛋白核淡水小球藻(Chlorella pyrenoidsa)細(xì)胞到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,獲得將進(jìn)行激光福照誘變的藻液； (2)激光輻照誘變?nèi)?0ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期藻液倒于小廣口瓶中，用808nm半導(dǎo)體激光輻照O. 9-1. lmin，輻照過(guò)程中用磁力攪拌保持輻照均勻，獲得突變?cè)逯辏? (3)突變?cè)逯昱囵B(yǎng)將輻照誘變后的藻液倒入裝有BGll營(yíng)養(yǎng)鹽的50ml三角瓶?jī)?nèi)，藻液中營(yíng)養(yǎng)鹽的終濃度為1/4倍，在20 25°C、光強(qiáng)180(Γ20001χ、光暗比為12h/12h條件下培養(yǎng)20天，然后將藻液轉(zhuǎn)接到300ml三角瓶?jī)?nèi)，在上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)20天，再將藻液轉(zhuǎn)接到IOOOml三角瓶?jī)?nèi)，在上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)26天，培養(yǎng)階段每7天添加一次1/4倍濃度的BGll營(yíng)養(yǎng)鹽，每天定時(shí)搖藻3次。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的激光誘變蛋白核淡水小球藻快速積累油脂突變?cè)逯甑姆椒?，其特征在于步驟(2)中，半導(dǎo)體激光采用海特光電有限責(zé)任公司生產(chǎn)的L0S-BLD-0808-12W-C- 一體化光源激光器，功率6w。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的激光誘變蛋白核淡水小球藻快速積累油脂突變?cè)逯甑姆椒?，其特征在于蛋白核淡水小球藻源自中?guó)科學(xué)院水生生物研究所，編號(hào)為31號(hào)的藻株。
全文摘要
本發(fā)明提供一種激光誘變蛋白核淡水小球藻快速積累油脂突變?cè)逯甑姆椒?，采用如下步驟(1)以日光燈作光源培養(yǎng)蛋白核淡水小球藻細(xì)胞到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；(2)取20ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期藻液倒于小廣口瓶中，用半導(dǎo)體激光光進(jìn)行輻照處理0.9-1.1min，輻照過(guò)程中用磁力攪拌，獲得突變?cè)逯辏?3)將輻照誘變后的藻液倒入裝有BG11營(yíng)養(yǎng)鹽的50ml三角瓶?jī)?nèi)，藻液中營(yíng)養(yǎng)鹽的終濃度為1/4倍，在20~25℃、光強(qiáng)1800~2000lx條件下培養(yǎng)20天，然后將藻液轉(zhuǎn)接到300ml三角瓶?jī)?nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)20天，再將藻液轉(zhuǎn)接到1000ml三角瓶?jī)?nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)26天，培養(yǎng)階段每7天添加一次1/4倍濃度的BG11營(yíng)養(yǎng)鹽，每天定時(shí)搖藻3次。本發(fā)明簡(jiǎn)單易行、成本低廉、高效。
文檔編號(hào)C12R1/89GK102787113SQ20121029660
公開日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2012年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月12日
發(fā)明者付圣貴, 葉乃好, 孟春曉, 王元元, 蘇遠(yuǎn)豐, 趙俞任, 高宏正, 高政權(quán) 申請(qǐng)人:山東理工大學(xué)