專利名稱：菊苣轉(zhuǎn)基因植株的擴繁方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及的是一種菊苣轉(zhuǎn)基因植株的擴繁方法。
背景技術(shù)：
菊苣(Cichorium intybus )為菊科菊苣屬多年生草本植物。菊苣不僅是高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的飼用作物，又具藥用、食用和蜜源用等多方面的開發(fā)潛力。菊苣根系含有豐富倍半萜內(nèi)酯、糖苷、香豆素、黃酮類、花青甙、細胞激肽類和有機酸等物質(zhì)，具有清肝利膽，防病抗癌的功效。根中提取的苦味物質(zhì)可作為咖啡的代用品，肉質(zhì)根上長出的嫩芽可作為蔬菜食用，其肉質(zhì)根加工而成的保健食品出口韓國、日本等地很受歡迎，藍色的花冠具有一定的觀賞價值，是一種大力推廣的新興多用途經(jīng)濟植物，倍受國內(nèi)外學(xué)者的重視。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種菊苣轉(zhuǎn)基因植株的擴繁方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種菊苣轉(zhuǎn)基因植株的擴繁方法，包括以下步驟:Al、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)zeolin基因的菊苣植株的檢測采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因菊苣基因組DNA，以含有外源目的基因zeolin的質(zhì)粒DNA做陽性對照，未轉(zhuǎn)化菊苣植株DNA及ddH20做陰性對照,利用設(shè)計的引物進行PCR擴增和Southern雜交檢測，選取陽性的菊苣轉(zhuǎn)基因植株，再用改良SDS法提取RNA,進行RT-PCR檢測，選取都為陽性的轉(zhuǎn)基因菊苣作為后續(xù)材料；A2、轉(zhuǎn)基因植株葉片滅菌選取步驟Al檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因菊苣葉片，先采用自來水沖洗，在超凈工作臺上用O. IffigCl2浸泡葉片8-10min，期間不停搖動，無菌水反復(fù)沖洗4-5遍，無菌濾紙吸干多余水分；A3、轉(zhuǎn)基因菊苣芽的誘導(dǎo)與增殖用無菌刀片將滅菌后的菊苣葉片切成O. 5X0. 5cm，葉片近軸面向下，接種在含25mg/L潮霉素、2. Omg/L 6_BA、0. 2mg/L IBA、O. O lmg/L TDZ的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化出不定芽綠點，將小芽點接種到含有15mg/L潮霉素、2. Omg/L 6-BA、0. 2mg/L IBA的芽增殖培養(yǎng)基上形成大量叢生芽；所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基+25mg/LHyg+2. 0mg/L 6-BA+O. 2mg/LΙΒΑ+0. 0lmg/L TDZ+30g/L 蔗糖 +8g/L 瓊脂，pH 5. 8 6. 0 ;芽增殖培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基 +15mg/L Hyg+2. Omg/L 6-BA+O. 2mg/L IBA+30g/L鹿糖+8g/L瓊脂，pH 5. 8 6. 0 ;A4、轉(zhuǎn)基因菊苣芽生根待叢生芽長到2-3cm時，小心將芽剝離葉片基部，接種到含有10mg/LHyg和0. lmg/L NAA的生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)；所述生根培養(yǎng)基1/2MS培養(yǎng)基+10mg/LHyg+0·lmg/L NAA+15g/L蔗糖+8g/L瓊脂，pH 值 5· 8 6· O ;Α5、轉(zhuǎn)基因菊苣再生植株的PCR檢測在無菌操作臺上，從玻璃瓶中取出生根20天左右的轉(zhuǎn)基因擴繁菊苣，剪取葉片1-2片，放于PCR管，液氮保存，小量提取DNA，進行PCR檢測，將陽性的再生植株重新轉(zhuǎn)入新的1/2MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至煉苗；A6、轉(zhuǎn)基因菊苣擴繁植株的煉苗和移栽對步驟A5檢測為陽性的再生植株進行煉苗和移栽，具體煉苗方法為首先在培養(yǎng)室中將封口膜或瓶蓋打開，適應(yīng)1-2天，在培養(yǎng)容器內(nèi)注入清水，溫室中煉苗2-3d，然后取出小植株，小心洗凈根部的培養(yǎng)基，移栽到裝有滅菌基質(zhì)的花盆中，于溫室煉苗5d后移到室外常規(guī)培養(yǎng)，每2天噴施1/2MS鹽溶液；植株煉苗后移栽到田間，成活的植株即為擴繁的帶有外源目的基因的轉(zhuǎn)基因植株。菊苣常規(guī)農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化效率較低，最高的達到百分之十幾，最低的只有百分之幾，通過常規(guī)遺傳轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)基因菊苣植株的量很少，且假陽性率高，轉(zhuǎn)化的工作量很大，利用轉(zhuǎn)基因菊苣葉片作為外植體進行擴殖，省去了遺傳轉(zhuǎn)化的繁瑣步驟，可以在短時間內(nèi)得到大量含有目的外源基因的陽性轉(zhuǎn)基因菊苣植株。本發(fā)明以轉(zhuǎn)基因菊苣葉片為外植體進行擴繁，分化率達90%以上，每個幼葉外植 體平均可分化出18. 69個不定芽，不定芽易于生根，生根率到90%以上，在芽分化、芽繁殖和生根階段，都通過不同濃度的潮霉素篩選，PCR檢測再生植株陽性率高達85. 54%，是常規(guī)遺傳轉(zhuǎn)化率的7-8倍，煉苗移栽后平均成活率達97%以上。通過該技術(shù)，一株轉(zhuǎn)基因菊苣，經(jīng)離體擴繁2個月可產(chǎn)生上千株轉(zhuǎn)基因陽性組培苗。與常規(guī)遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株相比，該技術(shù)培養(yǎng)周期短，程序簡單，擴繁系數(shù)高，成本低，對菊苣重要農(nóng)藝性狀影響小，產(chǎn)生的后代目的基因遺傳穩(wěn)定，可實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因菊苣的快速和大規(guī)模培育，也為菊苣基因工程和菊苣遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。
圖I為轉(zhuǎn)基因菊苣在篩選培養(yǎng)基上分化形成的芽點；圖2為轉(zhuǎn)基因菊苣擴繁中芽的增殖；圖3為轉(zhuǎn)基因菊苣擴繁植株生根培養(yǎng)；圖4為轉(zhuǎn)基因菊苣擴繁生根后的試管苗；圖5為轉(zhuǎn)zeolin基因菊苣再生擴繁后的PCR電泳檢測；注M: DL 2000 DNAmarker;P: pCB-zeolin (陽性對照的質(zhì)粒)；CK:陰性對照(非轉(zhuǎn)基因菊苣)；I 6轉(zhuǎn)基因
菊苣；圖6為轉(zhuǎn)基因菊苣擴繁植株煉苗后成活的植株；圖7為轉(zhuǎn)基因菊苣擴繁植株田間表現(xiàn)。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。轉(zhuǎn)zeolin基因菊苣植株獲得的方法為常規(guī)方法，簡述如下采用菊苣葉片為外植體，外植體預(yù)培養(yǎng)2d，用0D600=0. 4Abs的農(nóng)桿菌菌液侵染IOmin,，過2- 3d的共培養(yǎng)和1_2d的恢復(fù)培養(yǎng)后將轉(zhuǎn)化后的外植體接種在含適量抑菌劑頭孢和篩選劑潮霉素的培養(yǎng)基上進行篩選、抗性芽的再生和增殖，再進行生根培養(yǎng)、煉苗、移栽和檢測，最后得到轉(zhuǎn)zeolin基因的菊苣植株。菊苣轉(zhuǎn)基因植株的擴繁方法
(I)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)zeolin基因的菊苣植株的檢測。采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因菊苣基因組DNA，以含有外源目的基因zeolin的質(zhì)粒DNA做陽性對照，未轉(zhuǎn)化菊苣植株DNA及ddH20做陰性對照，利用設(shè)計的弓I物進行PCR擴增和Southern雜交檢測，選取陽性的菊苣轉(zhuǎn)基因植株，再用改良SDS法提取RNA，進行RT-PCR檢測，選取都為陽性的轉(zhuǎn)基因菊苣作為后續(xù)材料。(2)轉(zhuǎn)基因植株葉片滅菌。選取第一步檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因菊苣葉片，先采用自來水沖洗，在超凈工作臺上用O. IffigCl2浸泡葉片8-10min，期間不停搖動，無菌水反復(fù)沖洗4-5遍，無菌濾紙吸干多余水分。(3)轉(zhuǎn)基因菊苣芽的誘導(dǎo)與增殖。用無菌刀片將滅菌后的菊苣葉片切成O. 5X0. 5cm，葉片近軸面向下，接種在含25mg/L潮霉素、2. Omg/L 6_BA、0. 2mg/L IBA、 O. O lmg/L TDZ的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化出不定芽綠點，如圖I所示，由圖I可以看出，轉(zhuǎn)基因菊苣的一個外植體能分化形成許多不定芽的綠點，統(tǒng)計分析其分化率達到90%以上。將小芽點接種到含有151^/1潮霉素、2.011^/1 6-BA.0. 2mg/L IBA的芽增殖培養(yǎng)基上形成大量叢生芽，如圖2所示，由圖2看出一個外植體可以形成大量叢生芽，統(tǒng)計得出每個外植體平均可以形成18. 69個不定芽，最多的可以形成41個叢生芽。所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基+25mg/LHyg+2. Omg/L 6-BA+O. 2mg/LΙΒΑ+0. 0lmg/L TDZ+30g/L 蔗糖 +8g/L 瓊脂，pH 5. 8 6. 0。芽增殖培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基 +15mg/LHyg+2. 0mg/L 6-BA+O. 2mg/L IBA+30g/L 蔗糖+8g/L 瓊脂，pH 5.8 6.0。(4)轉(zhuǎn)基因菊苣芽生根。待叢生芽長到2-3cm時，小心將芽剝離葉片基部，接種到含有10mg/LHyg和0. lmg/L NAA的生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，2周后產(chǎn)生大量根，如圖3所示，從圖3可以看出不定芽易于生根，長勢良好，統(tǒng)計分析生根率到90%以上。所述生根培養(yǎng)基1/2MS培養(yǎng)基+lOmg/LHyg+O.lmg/L NAA+15g/L蔗糖+8g/L瓊脂，pH 值 5· 8 6· O。(5)轉(zhuǎn)基因菊苣再生植株的PCR檢測。在無菌操作臺上，從玻璃瓶中取出生根20天左右的轉(zhuǎn)基因擴繁菊苣(圖4所示)，剪取葉片1-2片，放于PCR管，液氮保存，小量提取DNA，進行PCR檢測，如圖5所示，圖5可以看出，PCR檢測的大部分擴繁植株都為陽性，統(tǒng)計分析PCR檢測再生植株陽性率高達85. 54%，是常規(guī)遺傳轉(zhuǎn)化率的7-8倍。將陽性的再生植株重新轉(zhuǎn)入新的1/2MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至煉苗。(6)轉(zhuǎn)基因菊苣擴繁植株的煉苗和移栽。對第5步檢測為陽性的再生植株進行煉苗和移栽，具體煉苗方法為首先在培養(yǎng)室中將封口膜或瓶蓋打開，適應(yīng)1-2天，在培養(yǎng)容器內(nèi)注入清水，溫室中煉苗2-3d，然后取出小植株，小心洗凈根部的培養(yǎng)基，移栽到裝有滅菌基質(zhì)(沙、土壤和蛭石)的花盆中，于溫室煉苗5d后移到室外常規(guī)培養(yǎng)，每2天噴施1/2MS鹽溶液，如圖6所示，圖6可以看出，植株煉苗后成活率高，長勢良好。植株煉苗后移栽到田間，成活的植株即為擴繁的帶有外源目的基因的轉(zhuǎn)基因植株，如圖7所示，圖7看出，擴繁的植株在田間移栽成活后長勢良好，植株平均成活率達到97%以上。應(yīng)當(dāng)理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍。
權(quán)利要求
1.ー種菊苣轉(zhuǎn)基因植株的擴繁方法，其特征在于，包括以下步驟A1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)zeolin基因的菊苣植株的檢測采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因菊苣基因組DNA，以含有外源目的基因zeolin的質(zhì)粒DNA做陽性對照，未轉(zhuǎn)化菊苣植株DNA及ddH20做陰性對照，利用設(shè)計的引物進行PCR擴增和Southern雜交檢測，選取陽性的菊苣轉(zhuǎn)基因植株，再用改良SDS法提取RNA，進行RT-PCR檢測，選取都為陽性的轉(zhuǎn)基因菊苣作為后續(xù)材料； A2、轉(zhuǎn)基因植株葉片滅菌選取步驟Al檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因菊苣葉片，先采用自來水沖洗，在超凈工作臺上用0. l%HgC12浸泡葉片8-10min，期間不停搖動，無菌水反復(fù)沖洗4_5遍，無菌濾紙吸干多余水分； A3、轉(zhuǎn)基因菊苣芽的誘導(dǎo)與増殖用無菌刀片將滅菌后的菊苣葉片切成0. 5X0. 5cm,葉片近軸面向下，接種在含25mg/L潮霉素、2. Omg/L 6_BA、0. 2mg/L IBA、0. Olmg/L TDZ的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化出不定芽綠點，將小芽點接種到含有15mg/L潮霉素、2. Omg/L6-BA、0. 2mg/L IBA的芽增殖培養(yǎng)基上形成大量叢生芽； 所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS 基本培養(yǎng)基+25mg/LHyg+2. Omg/L 6-BA+O. 2mg/L IBA+0. Olmg/L TDZ+30g/L 蔗糖 +8g/L 瓊脂，pH 5. 8 6. 0 ; 芽增殖培養(yǎng)基MS 基本培養(yǎng)基+15mg/L Hyg+2. Omg/L 6-BA+O. 2mg/L IBA+30g/L 蔗糖+8g/L 瓊脂，pH 5. 8 6. 0 ; A4、轉(zhuǎn)基因菊苣芽生根待叢生芽長到2-3cm吋，小心將芽剝離葉片基部，接種到含有10mg/LHyg和0. lmg/L NAA的生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)； 所述生根培養(yǎng)基1/2MS培養(yǎng)基+10mg/LHyg+0. lmg/L NAA+15g/L蔗糖+8g/L瓊脂，pH值 5. 8 6. 0 ; A5、轉(zhuǎn)基因菊苣再生植株的PCR檢測在無菌操作臺上，從玻璃瓶中取出生根20天左右的轉(zhuǎn)基因擴繁菊苣，剪取葉片1-2片，放于PCR管，液氮保存，小量提取DNA，進行PCR檢測，將陽性的再生植株重新轉(zhuǎn)入新的1/2MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至煉苗； A6、轉(zhuǎn)基因菊苣擴繁植株的煉苗和移栽對步驟A5檢測為陽性的再生植株進行煉苗和移栽，具體煉苗方法為首先在培養(yǎng)室中將封ロ膜或瓶蓋打開，適應(yīng)1-2天，在培養(yǎng)容器內(nèi)注入清水，溫室中煉苗2-3d，然后取出小植株，小心洗凈根部的培養(yǎng)基，移栽到裝有滅菌基質(zhì)的花盆中，于溫室煉苗5d后移到室外常規(guī)培養(yǎng)，每2天噴施1/2MS鹽溶液；植株煉苗后移栽到田間，成活的植株即為擴繁的帶有外源目的基因的轉(zhuǎn)基因植株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種菊苣轉(zhuǎn)基因植株的擴繁方法，包括以下步驟A1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)zeolin基因的菊苣植株的檢測； A2、 轉(zhuǎn)基因植株葉片滅菌；A3、轉(zhuǎn)基因菊苣芽的誘導(dǎo)與增殖；A4、轉(zhuǎn)基因菊苣芽生根； A5、轉(zhuǎn)基因菊苣再生植株的PCR檢測；A6、轉(zhuǎn)基因菊苣擴繁植株的煉苗和移栽。本發(fā)明以轉(zhuǎn)基因菊苣葉片為外植體進行擴繁，分化率達90%以上，每個幼葉外植體平均可分化出18.69個不定芽，不定芽易于生根，生根率到90%以上，在芽分化、芽繁殖和生根階段，都通過不同濃度的潮霉素篩選，PCR檢測再生植株陽性率高達85.54%，是常規(guī)遺傳轉(zhuǎn)化率的7-8倍，煉苗移栽后平均成活率達97%以上。
文檔編號C12Q1/68GK102771396SQ20121028875
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月14日
發(fā)明者張玉, 方鵬飛, 李達旭, 白史且, 鄧永昌 申請人:四川省草原科學(xué)研究院