两个人的电影免费视频_国产精品久久久久久久久成人_97视频在线观看播放_久久这里只有精品777_亚洲熟女少妇二三区_4438x8成人网亚洲av_内谢国产内射夫妻免费视频_人妻精品久久久久中国字幕

一種鑒定水稻紋枯病菌Sdh基因核苷酸點突變及其對噻呋酰胺抗藥性的方法

文檔序號:412459閱讀:476來源:國知局
專利名稱:一種鑒定水稻紋枯病菌Sdh基因核苷酸點突變及其對噻呋酰胺抗藥性的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種鑒定水稻紋枯病菌Sdh基因核苷酸點突變及其對噻呋酰胺抗藥性的方法和專用引物。屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)
水稻紋枯病是由立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kiihn)引起的一種世界范圍的水稻病害,該病害引起水稻結(jié)實率和千粒重顯著降低,甚至植株倒伏枯死,是造成水稻減產(chǎn)的主要原因之一。水稻紋枯病菌屬于立枯絲核菌的AG-I融合群,其基因組序列未知,這也為該病原菌的深入研究帶來一定困難。隨著矮桿、早熟、多蘗型品種的大量推廣,以及施肥水平的不斷提高,水稻紋枯病危害逐步加重,近年來已成為我國水稻三大病害之首,嚴(yán)重影響了水稻產(chǎn)量和質(zhì)量。目前對水稻紋枯病的防治以化學(xué)措施為主。噻呋酰胺(thifluzamide)商品名為“滿穗”,是陶氏益農(nóng)公司開發(fā)的噻二唑羧酰苯胺類化合物,是近年來推出的新型、高效防治紋枯病藥劑。噻呋酰胺屬于呼吸抑制劑中作用于復(fù)合物II處的琥珀酸脫氫酶抑制劑(SDHIs),這類藥劑還包括萎銹靈、啶酰菌胺、氟吡菌酰胺、吡噻菌胺等,它們具有相似的作用機制和抗性機制,相互間具有正交互抗藥性,多對擔(dān)子菌或子囊菌特效。使用初期,這類藥劑因其用藥量少,防效顯著而備受青睞,但因其作用位點單一,田間很快就產(chǎn)生了抗藥性。已有研究發(fā)現(xiàn),病原菌對此類藥劑的抗性機制主要是琥珀酸脫氫酶B、C、D亞基(sdhB、sdhC、sdhD)發(fā)生點突變所致,如玉米瘤黑粉病菌、小麥殼針孢葉枯病菌、灰霉菌等均在sdhB第三個半胱氨酸簇的保守組氨酸位點發(fā)生點突變,灰蓋鬼傘病菌、菌核病菌等則在膜錨蛋白sdhC、sdhD位點發(fā)生點突變,脫氮副球菌在sdhB、sdhD發(fā)生點突變,而鏈格孢菌、米曲霉菌、多主棒孢在sdhB、sdhC、sdhD基因均發(fā)生突變。水稻紋枯病菌對噻呋酰胺的抗性機制目前還未明確,明確其具體的抗性基因及抗性檢測方法,可以對抗性菌株進行早期檢測,了解其抗性發(fā)展動態(tài),制定合理的病害管理方案,延緩抗藥性的產(chǎn)生。傳統(tǒng)的抗性檢測方法主要為室內(nèi)生物學(xué)測定,包括菌絲生長速率法、孢子萌發(fā)法、菌絲干重法、水平擴散法等。這些傳統(tǒng)的敏感性測定方法均需要制備含藥培養(yǎng)基,計算抑制中濃度,耗費時間長,工作量大,靈敏度低。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展,分子技術(shù)得以在抗藥性檢測中應(yīng)用,其速度快,效率高,是田間抗性檢測的理想方法。針對單堿基突變引起的抗性,AS-PCR和CAPS方法已成功應(yīng)用于抗性菌株的分子檢測。等位特異PCR(Allele-Specific PCR,AS-PCR)是在引物的3’端設(shè)計一個堿基與突變位點匹配,在PCR擴增時引物只與突變菌株結(jié)合,敏感菌株的DNA則不能擴增,從而將敏感和抗性菌株區(qū)分開來。最近的研究發(fā)現(xiàn),在原引物基礎(chǔ)上,改變倒數(shù)第二個堿基為不同核苷酸后,可以顯著提高引物的特異性,使得AS-PCR技術(shù)應(yīng)用更為廣泛。CAPS (Cleaved amplified polymorphicsequences)是酶切擴增多態(tài)性序列標(biāo)記技術(shù),也稱為PCR-RFLP技術(shù),敏感和抗性菌株由于核苷酸序列的差異可能導(dǎo)致了酶切位點的改變,對PCR擴增的DNA片段進行限制性酶切,經(jīng)電泳分離后敏感和抗性菌株的表型不同,從而加以區(qū)分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供兩種檢測或輔助檢測水稻紋枯病菌中SdhB基因是否存在突變位點的方法及其專用引物。本發(fā)明所提供的第一種檢測或輔助檢測水稻紋枯病菌中sdhB基因是否存在突變位點的方法,包括如下步驟以待測水稻紋枯病菌的基因組DNA為模板,用SEQ ID NO : I和SEQ ID NO 2所示引物對進行PCR擴增,若能擴增出條帶,則所述待測水稻紋枯病菌中sdhB基因存在或候選存在突變位點;所述突變位點指水稻紋枯病菌中sdhB基因的基因組序列自5’末端起第975位核 苷酸為C和T雜合或T純合。上述過程中,所述sdhB基因的基因組序列自5’末端起第975位核苷酸也就是SEQID NO :4中自5’末端起第975位核苷酸。上述過程中,所述PCR擴增中,退火溫度為56°C。本發(fā)明所提供的另一種檢測或輔助檢測水稻紋枯病菌中sdhB基因是否存在突變位點的方法,包括如下步驟以待測水稻紋枯病菌的基因組DNA為模板,擴增得到sdhB基因,再用NlaIV酶切所得sdhB基因,若酶切產(chǎn)物中含有230bp片段,則所述待測水稻紋枯病菌中sdhB基因存在或候選存在突變位點;所述突變位點指水稻紋枯病菌中sdhB基因的基因組序列自5’末端起第975位核苷酸為C和T雜合或T純合。上述過程中,所述sdhB基因的基因組序列自5’末端起第975位核苷酸也就是SEQID NO :4中自5’末端起第975位核苷酸。本發(fā)明所提供的檢測或輔助檢測水稻紋枯病菌中sdhB基因是否存在突變位點的引物對,由SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示DNA分子組成。本發(fā)明的另一個目的是提供水稻紋枯病菌中sdhB基因或蛋白的突變位點。本發(fā)明所提供的水稻紋枯病菌中sdhB基因的一個突變位點,為水稻紋枯病菌中sdhB基因的基因組序列自5’末端起第975位核苷酸為C和T雜合或T純合。其中,所述sdhB基因的基因組序列自5’末端起第975位核苷酸也就是SEQ ID NO :4中自5’末端起第975位核苷酸。本發(fā)明所提供的水稻紋枯病菌中sdhB蛋白的一個突變位點,為水稻紋枯病菌中sdhB蛋白的自N端起第249位氨基酸為組氨酸與酪氨酸雜合或純合的酪氨酸。其中,所述sdhB蛋白的自N端起第249位氨基酸也就是SEQ ID NO :3中自N端起第249位氨基酸。上述任一所述突變位點在鑒定水稻紋枯病菌抗藥性中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍;所述抗藥性為抗噻呋酰胺。上述應(yīng)用中,存在所述突變位點的水稻紋枯病菌具有或候選具有抗藥性。SEQ ID NO :3所示蛋白或SEQ ID NO :4所示基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述中,任一所述水稻紋枯病菌具體是立枯絲核菌。
上述中,所述敏感菌株為噻呋酰胺的平均EC5tl小于O. I μ g/ml,抗性菌株為噻呋酰胺的平均 EC50 為 19. 558 μ g/ml。本發(fā)明提供的檢測水稻紋枯病菌對噻呋酰胺產(chǎn)生抗藥性的點突變的方法,對抗性菌株進行高靈敏度、簡單快速的分子檢測,及時了解抗藥性發(fā)生動態(tài),對制定合理的病害管理方案、有效控制抗藥性病害發(fā)展具有重要意義。本發(fā)明方法具有以下技術(shù)優(yōu)勢和特點結(jié)果可靠用本發(fā)明建立的分子檢測方法檢測菌株DNA,所有的抗性菌株都能與敏感菌株區(qū)分開來,其結(jié)果可靠性有保證。簡單快速傳統(tǒng)的生物學(xué)測定方法從病菌分離,到敏感性檢測,至少需要5天時間,工作量大,周期長。而分子檢測從提DNA到PCR或酶切分析,最多需要I. 5天時間,省時 省工。


圖I為水稻紋枯病菌敏感與抗性菌株的序列比對。A :sdhB、sdhC、sdhD基因的突變情況,B sdhB基因975位的堿基雜合,C :敏感菌株與抗性菌株的sdhB氨基酸比對。圖2為抗性與敏感菌株的NlaIV酶切位點。圖3為CAPS方法酶切檢測結(jié)果。I 4泳道為敏感菌株,5 16泳道為抗性菌株。圖4為AS-PCR方法檢測水稻紋枯病菌抗性突變體。A :四對AS-PCR引物在不同溫度條件下的電泳結(jié)果。B :引物BF975C/BR32在56°C下的擴增結(jié)果。S為敏感菌株,R為抗性雜合菌株,T為抗性純合菌株。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明,均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業(yè)途徑得到。文中“抗性菌株”均指對噻呋酰胺抗性的立枯絲核菌(Rhizoctonia solaniKiihn);“敏感菌株”均指對噻呋酰胺敏感的立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kiihn)。下述實施例中使用的立枯絲核菌為抗性菌株J-I,J-3,J-3-1、J-6、J_10、J-II、J-14、J-16、J-20、J-24、B-U B-I-U B-1-31、T2 ;敏感菌株 FBS-3、B310、D179、JHT158-3,JHM-4 和 E67。上述菌株分別采自FBS-3(福建),B310、B-1、B-1-1、B-1-31 (廣東),D179 (廣西),JHM-4、JHT158-3, J-I、J-3、J-3-1、J-6、J-10、J-II、J-14、J-16、J-20、J-24、T2 (吉林),E67(江蘇)。通過形態(tài)學(xué)并結(jié)合分子生物學(xué)方法鑒定所有菌株為立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani Kiihn)。實施例I、立枯絲核菌對噻呋酰胺的敏感性測定五株立枯絲核菌敏感菌株,菌株編號分別為FBS-3,B310, D179,JHT158-3, E67 ;十株立枯絲核菌抗性菌株,菌株編號分別為J-3,J-3-1,J-24,J-20, B-I, B-1-31, J-14,J-6,J-I 和 T2。馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基馬鈴薯200g,瓊脂粉14g,葡萄糖18g,蒸餾水定容至1L,121°C濕熱滅菌20分鐘。
I、實驗步驟如下I)將噻呋酰胺用二甲基亞砜(DMSO)配成105μ g/ml的母液。對于立枯絲核菌敏感菌株的敏感性測定,將噻呋酰胺逐級稀釋成500 μ g/mL, 100 μ g/mL, 50 μ g/mL, 25 μ g/mL, 10 μ g/mL的濃度梯度;對于立枯絲核菌抗性雜合菌株的敏感性測定,將供試藥劑噻呋酰胺逐級稀釋成 2 X IO4 μ g/mL, 5 X IO3 μ g/mL, I. 5 X IO3 μ g/mL, 500 μ g/mL, 200 μ g/mL 的濃度梯度;對于立枯絲核菌抗性純合菌株的敏感性測定,將供試藥劑噻呋酰胺逐級稀釋成 2 X IO5 μ g/mL, 8 X IO4 μ g/mL, IO4 μ g/mL, 5 X IO3 μ g/mL, 2. 5 X IO3 μ g/mL, IO3 μ g/mL,500 μ g/mL的濃度梯度。2)用移液槍吸取噻呋酰胺藥液60 μ I加入已滅菌的冷卻至45°C的60ml PDA培養(yǎng)基中,使溶劑含量為1%。,混勻,將帶藥的培 養(yǎng)基倒入直徑為9cm的培養(yǎng)皿中,設(shè)只加60 μ I二甲基亞砜的處理為空白對照,每個比例藥劑設(shè)3次重復(fù)。3)立枯絲核菌在PDA平板上培養(yǎng)3天后,沿菌落邊緣用打孔器打取直徑為O. 5cm的菌餅,菌絲面向下接種于步驟2)中的帶藥和對照培養(yǎng)基中,置于28°C培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng),I. 5d后測量菌落直徑。4)十字交叉法測量菌落直徑,根據(jù)菌落平均直徑值計算出各濃度藥劑對供試菌株菌絲生長的抑制率。然后將抑制率轉(zhuǎn)化成機率值(Y),藥劑濃度轉(zhuǎn)換成以10為底的對數(shù)值(X),在Microsoft Excel中作回歸直線,求出噻呋酰胺對立枯絲核菌的毒力回歸曲線方程Y=a+bX,以及相關(guān)系數(shù)r和有效抑制中濃度EC5tl值,并計算抗性倍數(shù)。
i ^ til ......·■■*■■■- * s ^ -
抗性感菌株的ECso
抗件倍數(shù)= ____
■4/ u I >..!.< 11—I
敏慼菌株I 平均EC502.結(jié)果表I.立枯絲核菌對噻呋酰胺的敏感性
權(quán)利要求
1.一種檢測或輔助檢測水稻紋枯病菌中SdhB基因是否存在突變位點的方法,包括如下步驟 以待測水稻紋枯病菌的基因組DNA為模板,用SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示引物對進行PCR擴增,若能擴增出條帶,則所述待測水稻紋枯病菌中sdhB基因存在或候選存在突變位點; 所述突變位點指水稻紋枯病菌中sdhB基因的基因組序列自5’末端起第975位核苷酸為C和T雜合或T純合。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法,其特征在于所述PCR擴增中,退火溫度為56°C。
3.—種檢測或輔助檢測水稻紋枯病菌中sdhB基因是否存在突變位點的方法,包括如下步驟 以待測水稻紋枯病菌的基因組DNA為模板,擴增得到sdhB基因,再用NlaIV酶切所得sdhB基因,若酶切產(chǎn)物中含有230bp片段,則所述待測水稻紋枯病菌中sdhB基因存在或候選存在突變位點; 所述突變位點指水稻紋枯病菌中sdhB基因的基因組序列自5’末端起第975位核苷酸為C和T雜合或T純合。
4.一種檢測或輔助檢測水稻紋枯病菌中sdhB基因是否存在突變位點的引物對,由SEQID NO 1和SEQ ID NO 2所示DNA分子組成。
5.水稻紋枯病菌中sdhB基因的一個突變位點,為水稻紋枯病菌中sdhB基因的基因組序列自5’末端起第975位核苷酸為C和T雜合或T純合。
6.水稻紋枯病菌中sdhB蛋白的一個突變位點,為水稻紋枯病菌中sdhB蛋白的自N端起第249位氨基酸為組氨酸與酪氨酸雜合或純合的酪氨酸。
7.權(quán)利要求5或6所述突變位點在鑒定水稻紋枯病菌抗藥性中的應(yīng)用;所述抗藥性為抗噻呋酰胺。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用,其特征在于存在所述突變位點的水稻紋枯病菌具有或候選具有抗藥性。
9.SEQ ID NO 3所示蛋白。
10.SEQ ID NO 4 所示基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及及一種鑒定水稻紋枯病菌Sdh基因核苷酸點突變及其對噻呋酰胺抗藥性的分子檢測方法和專用引物。屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。該引物對,由SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示核苷酸序列組成。本發(fā)明提供的檢測水稻紋枯病菌對噻呋酰胺產(chǎn)生抗藥性的點突變的方法,具有高靈敏度、簡單快速、穩(wěn)定性好的特點,可以有效地區(qū)分敏感菌株和抗藥性菌株,用于檢測田間水稻紋枯病菌對噻呋酰胺的抗性發(fā)生發(fā)展動態(tài)。本發(fā)明對于抗性病害的早期預(yù)警,以及制定合理的病害管理方案、有效控制抗藥性病害發(fā)展具有重要意義。
文檔編號C12Q1/02GK102864220SQ201210281520
公開日2013年1月9日 申請日期2012年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月9日
發(fā)明者劉西莉, 牟文君, 李波濤, 劉鵬飛, 李健強, 王厚涵, 林東 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1
一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲人成网站高清观看| 脱女人内裤的视频| 日本成人三级电影网站| 宅男免费午夜| 午夜免费激情av| 成熟少妇高潮喷水视频| 色老头精品视频在线观看| 麻豆成人av在线观看| 大型黄色视频在线免费观看| 美女免费视频网站| 亚洲,欧美精品.| 变态另类丝袜制服| 叶爱在线成人免费视频播放| 在线观看午夜福利视频| 一级黄片播放器| 亚洲国产精品久久男人天堂| www.999成人在线观看| 级片在线观看| 色综合婷婷激情| 精品福利观看| 精品电影一区二区在线| 老熟妇仑乱视频hdxx| 色在线成人网| 有码 亚洲区| 午夜亚洲福利在线播放| 俄罗斯特黄特色一大片| 99国产精品一区二区蜜桃av| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 内地一区二区视频在线| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 一本精品99久久精品77| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日本熟妇午夜| 欧美三级亚洲精品| 男人舔奶头视频| 色噜噜av男人的天堂激情| 国产精品一区二区三区四区久久| or卡值多少钱| 亚洲av熟女| 国产欧美日韩一区二区精品| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲中文字幕日韩| 床上黄色一级片| 久久久色成人| 脱女人内裤的视频| 久久人人精品亚洲av| av在线天堂中文字幕| 免费在线观看成人毛片| 欧美+日韩+精品| 欧美日本亚洲视频在线播放| 一个人观看的视频www高清免费观看| 精品日产1卡2卡| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 精品国产美女av久久久久小说| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲不卡免费看| 国产乱人伦免费视频| 久久精品国产自在天天线| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产单亲对白刺激| 国产黄片美女视频| 久久中文看片网| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产亚洲欧美98| 成人性生交大片免费视频hd| 老鸭窝网址在线观看| 国产真实乱freesex| aaaaa片日本免费| 欧美3d第一页| 99热这里只有是精品50| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 2021天堂中文幕一二区在线观| 美女黄网站色视频| 午夜亚洲福利在线播放| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 午夜精品一区二区三区免费看| 在线播放无遮挡| 在线天堂最新版资源| 91av网一区二区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 极品教师在线免费播放| 女人被狂操c到高潮| 欧美乱色亚洲激情| 欧美午夜高清在线| 日韩有码中文字幕| 无限看片的www在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲七黄色美女视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 欧美日韩黄片免| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 美女 人体艺术 gogo| 韩国av一区二区三区四区| 丁香欧美五月| 久久久久国内视频| 麻豆一二三区av精品| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 欧美性感艳星| 免费人成在线观看视频色| 成人鲁丝片一二三区免费| 精品一区二区三区视频在线 | 99热精品在线国产| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 在线观看免费视频日本深夜| 午夜福利欧美成人| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲人成电影免费在线| 国产 一区 欧美 日韩| 一个人看的www免费观看视频| 午夜福利18| 久久久久久久午夜电影| 十八禁人妻一区二区| 午夜福利成人在线免费观看| 国产午夜精品论理片| 91字幕亚洲| 黄片小视频在线播放| 天天躁日日操中文字幕| 中出人妻视频一区二区| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲精品成人久久久久久| 成人特级av手机在线观看| 免费观看的影片在线观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 看免费av毛片| 国产老妇女一区| 日本 av在线| 俄罗斯特黄特色一大片| 三级毛片av免费| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 一a级毛片在线观看| 成人特级av手机在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲在线观看片| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国内揄拍国产精品人妻在线| 搡老妇女老女人老熟妇| av片东京热男人的天堂| 国产精品野战在线观看| 日本黄大片高清| 一区福利在线观看| 免费观看人在逋| 99热6这里只有精品| 欧美最黄视频在线播放免费| 动漫黄色视频在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产黄色小视频在线观看| 一级作爱视频免费观看| 校园春色视频在线观看| 国产精品亚洲美女久久久| 国产高潮美女av| 亚洲av免费在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 两人在一起打扑克的视频| 美女被艹到高潮喷水动态| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产91精品成人一区二区三区| 最近最新中文字幕大全免费视频| 桃色一区二区三区在线观看| 看片在线看免费视频| av在线蜜桃| 久久精品国产清高在天天线| 18禁美女被吸乳视频| 精品无人区乱码1区二区| 午夜精品一区二区三区免费看| 欧美区成人在线视频| 亚洲国产精品999在线| 亚洲av电影在线进入| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲在线自拍视频| 国产老妇女一区| 一级a爱片免费观看的视频| 嫩草影院精品99| 无人区码免费观看不卡| 亚洲在线自拍视频| 网址你懂的国产日韩在线| 免费看a级黄色片| 九九热线精品视视频播放| 99精品久久久久人妻精品| 99热这里只有是精品50| 久久国产精品影院| 少妇丰满av| 国产黄色小视频在线观看| 日本黄色片子视频| 中文字幕高清在线视频| 精品电影一区二区在线| 麻豆国产97在线/欧美| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲天堂国产精品一区在线| 一个人看的www免费观看视频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 91在线精品国自产拍蜜月 | 老汉色∧v一级毛片| 黄片小视频在线播放| 男人的好看免费观看在线视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 99久久无色码亚洲精品果冻| 精品午夜福利视频在线观看一区| 老司机深夜福利视频在线观看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲av一区综合| 国产69精品久久久久777片| 中文字幕av在线有码专区| 日本免费一区二区三区高清不卡| 亚洲国产欧美人成| 99精品久久久久人妻精品| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产一级毛片七仙女欲春2| 久久久成人免费电影| 国产精品久久视频播放| 色尼玛亚洲综合影院| 又黄又爽又免费观看的视频| 一级a爱片免费观看的视频| 免费大片18禁| 国产单亲对白刺激| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 国产色婷婷99| 亚洲电影在线观看av| 男女床上黄色一级片免费看| 久9热在线精品视频| 久久精品国产综合久久久| 啦啦啦免费观看视频1| 91在线精品国自产拍蜜月 | 国产真人三级小视频在线观看| 午夜亚洲福利在线播放| 久久草成人影院| 天天一区二区日本电影三级| 日本与韩国留学比较| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产美女午夜福利| 欧美一级a爱片免费观看看| 久久精品91蜜桃| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 久久草成人影院| 色老头精品视频在线观看| 男女午夜视频在线观看| 香蕉丝袜av| 国产单亲对白刺激| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲国产精品999在线| 欧美成人性av电影在线观看| 久久草成人影院| 少妇熟女aⅴ在线视频| 在线观看一区二区三区| 欧美黑人巨大hd| 最近最新中文字幕大全电影3| 动漫黄色视频在线观看| 国产国拍精品亚洲av在线观看 | 国产精品野战在线观看| 嫩草影视91久久| 亚洲性夜色夜夜综合| 色av中文字幕| 99久久99久久久精品蜜桃| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 香蕉av资源在线| 亚洲欧美日韩高清专用| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 好男人电影高清在线观看| 极品教师在线免费播放| 中出人妻视频一区二区| 欧美激情久久久久久爽电影| 热99在线观看视频| 桃红色精品国产亚洲av| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产成人福利小说| 99热6这里只有精品| 少妇高潮的动态图| 国产不卡一卡二| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 色老头精品视频在线观看| 黄色女人牲交| 高清毛片免费观看视频网站| 国产精品永久免费网站| 亚洲专区国产一区二区| 免费高清视频大片| 一进一出抽搐动态| 看黄色毛片网站| 五月伊人婷婷丁香| 天天躁日日操中文字幕| 日日夜夜操网爽| 午夜福利18| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产成人av激情在线播放| 日韩人妻高清精品专区| 听说在线观看完整版免费高清| 老司机午夜福利在线观看视频| 日韩国内少妇激情av| 久久久成人免费电影| 久久久国产成人免费| 久久精品国产综合久久久| 3wmmmm亚洲av在线观看| 最后的刺客免费高清国语| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 成人特级av手机在线观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 欧美最新免费一区二区三区 | 欧美+亚洲+日韩+国产| 午夜亚洲福利在线播放| 日韩欧美在线二视频| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲av成人av| 国产69精品久久久久777片| 婷婷精品国产亚洲av| 免费av毛片视频| 国内精品久久久久久久电影| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产精品av视频在线免费观看| 日本一二三区视频观看| 午夜日韩欧美国产| 在线视频色国产色| 久久精品91无色码中文字幕| 国产探花在线观看一区二区| 男女午夜视频在线观看| 嫩草影院入口| 美女被艹到高潮喷水动态| 一级a爱片免费观看的视频| 久久九九热精品免费| 亚洲无线观看免费| 国产主播在线观看一区二区| 亚洲最大成人手机在线| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 1024手机看黄色片| 欧美日韩国产亚洲二区| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产美女午夜福利| 成人国产综合亚洲| 变态另类丝袜制服| 亚洲av不卡在线观看| 国产一区二区三区视频了| 国产精品爽爽va在线观看网站| 校园春色视频在线观看| 成人av一区二区三区在线看| av视频在线观看入口| 麻豆一二三区av精品| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 可以在线观看毛片的网站| 国产一区二区在线观看日韩 | 一级毛片高清免费大全| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 日韩有码中文字幕| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产精品一及| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 天堂动漫精品| 又粗又爽又猛毛片免费看| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 精品久久久久久久久久久久久| 人人妻人人澡欧美一区二区| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 观看免费一级毛片| 午夜福利在线在线| 欧美zozozo另类| 少妇的逼水好多| 国产精品久久久久久精品电影| 国产亚洲欧美98| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 精品免费久久久久久久清纯| 精品国内亚洲2022精品成人| eeuss影院久久| 成人av在线播放网站| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产黄a三级三级三级人| 国产精品久久久久久久久免 | 一个人看视频在线观看www免费 | 欧美一级a爱片免费观看看| 啦啦啦免费观看视频1| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 免费看日本二区| 我的老师免费观看完整版| 成人午夜高清在线视频| 真人做人爱边吃奶动态| 热99在线观看视频| 色视频www国产| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 18禁美女被吸乳视频| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 久久亚洲精品不卡| xxxwww97欧美| 午夜两性在线视频| 欧美日韩乱码在线| 啦啦啦韩国在线观看视频| 一区福利在线观看| 一级黄片播放器| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲av熟女| 欧美高清成人免费视频www| 色综合亚洲欧美另类图片| av片东京热男人的天堂| 国产黄片美女视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 精品日产1卡2卡| 男人舔奶头视频| 精品欧美国产一区二区三| 少妇高潮的动态图| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产成人a区在线观看| avwww免费| 免费在线观看亚洲国产| 日本黄色视频三级网站网址| а√天堂www在线а√下载| 99热精品在线国产| 一进一出好大好爽视频| 久久久久性生活片| 亚洲成人久久性| 狠狠狠狠99中文字幕| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 日本黄色片子视频| 国产乱人视频| 日本一二三区视频观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 一级黄片播放器| 欧美另类亚洲清纯唯美| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| av福利片在线观看| 91av网一区二区| 香蕉丝袜av| 99久久精品国产亚洲精品| 级片在线观看| 欧美三级亚洲精品| av国产免费在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 天美传媒精品一区二区| 中文字幕av在线有码专区| 宅男免费午夜| 亚洲人成网站在线播| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产真实乱freesex| 国产一区二区三区视频了| 俺也久久电影网| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产一区二区在线av高清观看| 中文在线观看免费www的网站| 成年女人永久免费观看视频| 久久久国产成人精品二区| 麻豆成人av在线观看| 国产高清有码在线观看视频| 久久久久久久久中文| 国产精品免费一区二区三区在线| 人妻久久中文字幕网| 国产三级在线视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 欧美三级亚洲精品| 中国美女看黄片| 国语自产精品视频在线第100页| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 美女高潮的动态| 国产精品影院久久| 一级作爱视频免费观看| 亚洲精品在线美女| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 99久久精品一区二区三区| www.999成人在线观看| 亚洲在线自拍视频| 精品乱码久久久久久99久播| 国产成人av教育| 亚洲成人久久性| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产黄片美女视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 一个人看视频在线观看www免费 | 在线播放无遮挡| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 免费人成在线观看视频色| 亚洲18禁久久av| 久久人妻av系列| 久久久久久久久大av| 级片在线观看| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产成人啪精品午夜网站| 国产不卡一卡二| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 国产久久久一区二区三区| 2021天堂中文幕一二区在线观| bbb黄色大片| 在线观看av片永久免费下载| 日本一二三区视频观看| 一级黄色大片毛片| 亚洲av熟女| 欧美精品啪啪一区二区三区| 一个人免费在线观看电影| 无限看片的www在线观看| 我要搜黄色片| 国产午夜精品论理片| 午夜亚洲福利在线播放| 色综合婷婷激情| 色综合站精品国产| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲内射少妇av| 欧美最黄视频在线播放免费| 欧美黑人欧美精品刺激| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 亚洲av美国av| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 国产又黄又爽又无遮挡在线| 久久久久久久久大av| 级片在线观看| 精品国产美女av久久久久小说| 成人18禁在线播放| 久久久久久久久大av| 最新美女视频免费是黄的| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲不卡免费看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 色尼玛亚洲综合影院| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久久久精品国产欧美久久久| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产综合懂色| 国产精品一区二区三区四区久久| 亚洲人成网站高清观看| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产色婷婷99| 99在线人妻在线中文字幕| 欧美最黄视频在线播放免费| 九色成人免费人妻av| 99精品在免费线老司机午夜| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产探花在线观看一区二区| www.999成人在线观看| 国产探花在线观看一区二区| 国产成人福利小说| 一区二区三区国产精品乱码| 乱人视频在线观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 男女之事视频高清在线观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 天天躁日日操中文字幕| 99视频精品全部免费 在线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产淫片久久久久久久久 | 久久精品国产亚洲av涩爱 | 午夜免费观看网址| 99热这里只有是精品50| 天堂动漫精品| 免费一级毛片在线播放高清视频| a级毛片a级免费在线| 色综合婷婷激情| 88av欧美| 精品国内亚洲2022精品成人| 久久久久久久午夜电影| 亚洲成av人片在线播放无| 欧美日韩乱码在线| 亚洲色图av天堂| 日本 欧美在线| 国产午夜福利久久久久久| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产乱人视频| 国产69精品久久久久777片| 少妇丰满av| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲av免费在线观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 舔av片在线| 欧美精品啪啪一区二区三区| 丝袜美腿在线中文| 在线观看免费视频日本深夜| 最近在线观看免费完整版| 中文字幕av成人在线电影| 很黄的视频免费| 91av网一区二区| 日韩欧美国产在线观看| 床上黄色一级片| 国产亚洲精品一区二区www| 欧美激情在线99| 久久国产精品影院| 麻豆国产av国片精品| 欧美又色又爽又黄视频| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| av欧美777| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲无线在线观看| 国产精品亚洲美女久久久| 欧美成人a在线观看| 成年女人看的毛片在线观看| 亚洲国产色片| 午夜福利18| 在线播放国产精品三级| 亚洲18禁久久av| 在线播放无遮挡| 一个人观看的视频www高清免费观看| 全区人妻精品视频| 一级作爱视频免费观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 欧美国产日韩亚洲一区| 老汉色av国产亚洲站长工具| 9191精品国产免费久久| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 午夜两性在线视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产三级在线视频| 亚洲第一电影网av|