一種發(fā)酵產(chǎn)低溫脂肪酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種發(fā)酵產(chǎn)低溫脂肪酶的方法，是以自己篩選的野生菌株為出發(fā)菌種，采用優(yōu)化的種子培養(yǎng)基、產(chǎn)酶培養(yǎng)基及發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)方法來制備低溫脂肪酶的，發(fā)酵液最高酶活可達(dá)6000U/L以上，所產(chǎn)低溫脂肪酶最適溫度為30℃，在0℃仍具有65％的相對(duì)酶活，可廣泛應(yīng)用于洗滌劑、食品工業(yè)、造紙、醫(yī)藥、皮革、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【專利說明】ー種發(fā)酵產(chǎn)低溫脂肪酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供的ー種發(fā)酵產(chǎn)低溫脂肪酶的方法，是以自己篩選的野生菌株為出發(fā)菌種，采用優(yōu)化的種子培養(yǎng)基、產(chǎn)酶培養(yǎng)基及發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)方法來制備低溫脂肪酶的，發(fā)酵制備的低溫脂肪酶最高酶活可達(dá)6000U/L以上，所產(chǎn)低溫脂肪酶最適溫度為30°C，在(TC仍具有65%的相對(duì)酶活，可廣泛應(yīng)用于洗滌劑、食品エ業(yè)、造紙、醫(yī)藥、皮革、環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]脂肪酶(lipase, EC3.1.1.3)又稱甘油三酰酯甘油水解酶(triacylglycerolacylhyrolase),能在油-水界面上催化其水不溶性的天然底物甘油三酰酯水解為脂肪酸和甘油[I]。在微水環(huán)境下，脂肪酶具有獨(dú)特的性能，其催化反應(yīng)具有可逆性，包括甘油酯及水不溶性酯類的水解、醇解、酸解以及酯化等反應(yīng)。除了能分解脂肪外，脂肪酶還可催化其它酯水解的能力，因此，脂肪酶是生物技術(shù)中應(yīng)用酶類的重要組成部分，是繼蛋白酶、糖化酶的第三大商業(yè)用酶，已被廣泛應(yīng)用于洗滌劑、食品エ業(yè)、造紙、醫(yī)藥、皮革等方面。
[0003]脂肪酶按其作用pH的不同，可以分為酸性、中性、堿性脂肪酶；而按其作用溫度的高低則可以分為低溫脂肪酶(cold-active lipase)、中溫脂肪酶和高溫脂肪酶，低溫脂肪酶多為低溫微生物產(chǎn)生，此類菌生長條件相對(duì)苛刻，嚴(yán)重制約了低溫脂肪酶的發(fā)展，因而開發(fā)和研究的時(shí)間較短，但由于低溫脂肪酶在低溫環(huán)境下具有高催化活性而其活化能和反應(yīng)最適溫度較低，有利于節(jié)約能源和防止產(chǎn)物結(jié)構(gòu)破壞，對(duì)于環(huán)境保護(hù)和修復(fù)也有極大的意義，因?yàn)榄h(huán)境溫度多數(shù)在40°C以下，在某些領(lǐng)域中應(yīng)用低溫脂肪酶有著中高溫脂肪酶不可比擬的優(yōu)越性，低溫脂肪酶的研究開發(fā)及生產(chǎn)制備技術(shù)開始受到世界各國的重視，我們就是在這樣的形勢(shì)和思想指導(dǎo)下，研究出一種有效的制備低溫脂肪酶的方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
`[0004]本發(fā)明提供了ー種發(fā)酵產(chǎn)低溫脂肪酶的方法，一種優(yōu)化的種子培養(yǎng)基配方和產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方及發(fā)酵生產(chǎn)制備中的參數(shù)，所制備的低溫脂肪酶可廣泛應(yīng)用于洗滌劑、食品エ業(yè)、造紙、醫(yī)藥、皮革、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案:ー種發(fā)酵產(chǎn)低溫脂肪酶的方法，用我們自己篩選的野生菌株為出發(fā)菌種，經(jīng)種子培養(yǎng)和產(chǎn)酶培養(yǎng)發(fā)酵制備低溫脂肪酶，エ藝為:
[0006](I)種子培養(yǎng)
[0007]種子培養(yǎng)基:蛋白胨10g/L，氯化鈉10g/L，酵母浸出汁5g/L，pH 7.0 ；
[0008]取250ml的三角瓶若干個(gè)，每個(gè)裝種子培養(yǎng)基50ml，121°C滅菌30分鐘，冷卻；
[0009]在姆個(gè)裝種子培養(yǎng)基50ml的三角瓶中挑取一環(huán)菌接入，置于搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)條件--溫度30°C，轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)8小時(shí)即為發(fā)酵種子液；
[0010]⑵產(chǎn)酶培養(yǎng)
[0011]產(chǎn)酶培養(yǎng)基:牛肉膏40g/L，橄欖油 10ml/L, Triton X_1005ml/L，初始 PH = 7.0，泡敵3ml/L ；
[0012]取產(chǎn)酶培養(yǎng)基4.5升加入到7升發(fā)酵罐中，121°C滅菌40分鐘，冷卻；
[0013]按10%的接種量，將450ml發(fā)酵種子液加入到含產(chǎn)酶培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，
[0014]設(shè)定發(fā)酵參數(shù)，，溫度30°C，pH 7.0，轉(zhuǎn)速 3501'/1^11，通氣量1.5，17111111/1，發(fā)酵35小時(shí)；
[0015](3)脂肪酶液制備
[0016]將發(fā)酵液用高速冷凍離心機(jī)在4°C 10，800g離心15min的條件下離心，上清液即為脂肪酶粗酶液；
[0017](4)酶活力的測(cè)定
[0018]以對(duì)硝基苯丁酸酯p-NPB為底物，將pH 9.0的3.7mL 0.lmol/L Tris-HCl緩沖液和0.2mL IOmmoI/L p-NPB組成的反應(yīng)體系，30°C保溫15min后加入0.1mL酶液，在405nm下測(cè)吸光值，以Imin內(nèi)催化產(chǎn)生I y mo I的對(duì)硝基酚(e = 1.86 X IO4CnT1 XiT1)所需的酶量為I個(gè)酶活力単位。
[0019]本發(fā)明的有益效果:
[0020]首先提供了ー種發(fā)酵產(chǎn)低溫脂肪酶的方法。鑒于低溫脂肪酶多為低溫微生物產(chǎn)生，此類菌生長條件相對(duì)苛刻，發(fā)酵生產(chǎn)制備低溫脂肪酶的方法較少，嚴(yán)重制約了低溫脂肪酶的發(fā)展，在世界各國開發(fā)和研究的時(shí)間也較短，但低溫脂肪酶在低溫環(huán)境下具有高催化活性而其活化能和反應(yīng)最適溫度較低，有利于節(jié)約能源和防止產(chǎn)物結(jié)構(gòu)破壞，對(duì)于環(huán)境保護(hù)和修復(fù)也有極大的意義，因?yàn)榄h(huán)境溫度多數(shù)在40°C以下，在某些領(lǐng)域中應(yīng)用低溫脂肪酶有著中高溫脂肪酶不可比擬的優(yōu)越性。本發(fā)明ー種發(fā)酵產(chǎn)低溫脂肪酶的方法與其它制備低溫脂肪酶的方法相比較，具有酶活力高、發(fā)酵時(shí)間短、操作簡單、成本低的特點(diǎn)，且所生產(chǎn)出來的低溫脂肪酶可廣泛使用于洗滌劑、食品エ業(yè)、造紙、醫(yī)藥、皮革、環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域，因此本發(fā)明ー種發(fā)酵產(chǎn)低溫脂肪酶的方法有廣泛的エ業(yè)使用價(jià)值和較顯著的經(jīng)濟(jì)效益前景。
【具體實(shí)施方式】
[0021]實(shí)施例1
[0022]1、從斜面上挑取單菌落，劃線于LB平板培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，氯化鈉10g/L，酵母浸出汁5g/L，瓊脂20g/L，pH 7.2)中，將平板置于30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。
[0023]2、從平板上括取I環(huán)菌種接種到含50ml種子培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，氯化鈉IOg/し酵母浸出汁5g/L，pH 7.0)的250ml的三角瓶中，共接種10瓶，置于搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)條件:溫度30°C，轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)8小時(shí)即為發(fā)酵種子液。
[0024]3、按10%的接種量，將發(fā)酵種子液450ml加入到含4.5升產(chǎn)酶培養(yǎng)基(牛肉膏40g/L，橄欖油 10ml/L, Triton X_1005ml/L，初始 PH = 7.0，泡敵 3ml/L)的 7 升發(fā)酵罐中，設(shè)定發(fā)酵參數(shù)，，溫度30°C，pH 7.0，轉(zhuǎn)速350r/min，通氣量1.5L/min/L，發(fā)酵35小時(shí)取出；
[0025]4、脂肪酶液制備
[0026]將發(fā)酵液用高速冷凍離心機(jī)在4°C 10，800g離心15min的條件下離心，上清液即為脂肪酶粗酶液；
[0027]5、酶活力的測(cè)定
[0028]以對(duì)硝基苯丁酸酯p-NPB為底物，將pH 9.0的3.7mL 0.lmol/L Tris-HCl緩沖液和0.2mL I Ommol/L p-NPB組成的反應(yīng)體系，30°C保溫15min后加入0.1mL酶液，在405nm下測(cè)吸光值，以Imin內(nèi)催化產(chǎn)生I y mo I的對(duì)硝基酚(e = 1.86 X IO4CnT1 XiT1)所需的酶量為I個(gè)酶活力単位，測(cè)的 酶活力為6200U/L。
【權(quán)利要求】
1.ー種發(fā)酵產(chǎn)低溫脂肪酶的方法，是以自己篩選的野生菌株為出發(fā)菌種，采用改進(jìn)的種子培養(yǎng)基和產(chǎn)酶培養(yǎng)基及方法發(fā)酵制備低溫脂肪酶，エ藝為: (1)種子培養(yǎng) 種子培養(yǎng)基:蛋白胨10g/L，氯化鈉10g/L，酵母浸出汁5g/L，pH 7.0 ； 取250ml的三角瓶若干個(gè)，每個(gè)裝種子培養(yǎng)基50ml，121°C滅菌30分鐘，冷卻； 在姆個(gè)裝種子培養(yǎng)基50ml的三角瓶中挑取一環(huán)菌接入,置于搖床培養(yǎng),培養(yǎng)條件:溫度30°C，轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)8小時(shí)即為發(fā)酵種子液； (2)產(chǎn)酶培養(yǎng) 產(chǎn)酶培養(yǎng)基:牛肉膏40g/L，橄欖油10ml/L, Triton X_1005ml/L，初始PH = 7.0，泡敵3ml/L ； 取產(chǎn)酶培養(yǎng)基4.5升加入到7升發(fā)酵罐中，121°C滅菌40分鐘，冷卻； 按10%的接種量，將450ml發(fā)酵種子液加入到含產(chǎn)酶培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，設(shè)定發(fā)酵參數(shù)，，溫度 30°C，pH 7.0，轉(zhuǎn)速 350r/min，通氣量 1.5，L/min/L，發(fā)酵 35 小時(shí)； (3)脂肪酶液制備 將發(fā)酵液用高速冷凍離心機(jī)在4°C 10，800g離心15min的條件下離心，上清液即為脂肪酶粗酶液； (4)酶活力的測(cè)定 以對(duì)硝基苯丁酸酯p-NPB為底物，將pH 9.0的3.7mL 0.lmol/L Tris-HCl緩沖液和.0.2mL IOmmoI/L p_NPB組成的反應(yīng)體系，30°C保溫15min后加入0.1mL酶液，在405nm下測(cè)吸光值，以Imin內(nèi)催化產(chǎn)生I u mo I的對(duì)硝基酚，系數(shù)e = 1.86 X IO4CnT1 X M—1，所需的酶量為I個(gè)酶活力単位。
【文檔編號(hào)】C12N9/20GK103571808SQ201210278064
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2012年8月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月7日
【發(fā)明者】李洪兵, 張峰, 張明 申請(qǐng)人:湖南鴻鷹生物科技有限公司