專(zhuān)利名稱：食蟹猴抗利尿激素受體v1a拮抗劑篩選平臺(tái)的建立的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種藥物篩選方法，尤其涉及ー種食蟹猴抗利尿激素受體VlA拮抗劑篩選平臺(tái)的建立。
背景技術(shù)：
最近一段時(shí)間，抗利尿激素受體選擇性拮抗劑的研發(fā)成為熱點(diǎn)，已經(jīng)證明有著廣闊的臨床應(yīng)用前景。抗利尿激素是由下丘腦的視上核和室旁核的神經(jīng)細(xì)胞分泌的9肽激素，經(jīng)下丘腦-垂體束到達(dá)神經(jīng)垂體后釋放出來(lái)。其主要作用是提高遠(yuǎn)曲小管和集合管對(duì)水的通透性，促進(jìn)水的吸收，是尿液濃縮和稀釋的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)激素。當(dāng)給藥劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其發(fā)揮抗利尿激素效應(yīng)時(shí)，它將作為ー種非腎上腺素能樣的周?chē)苁湛s藥發(fā)揮作用。此外，該激素還能增強(qiáng)內(nèi)髓部集合管對(duì)尿素的通透性。血管加壓素AVP受體是G蛋白偶聯(lián)受體，包括血管緊張性受體(Via)、血小板聚集性受體(Vlb)、刺激同性離子和心肌蛋白合成受體(Vla)和下丘腦ACTH分泌受體(Vlb)。在最近的臨床研究中，Vla受體的拮抗劑最近發(fā)現(xiàn)可以有效地抑制攻擊性行為，這些結(jié)果意味著這些拮抗劑可以應(yīng)用在針對(duì)自閉癥，雙重人格以及吸毒者的暴力行為的控制上。作為ー種重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，食蟹猴Vla受體細(xì)胞系的建立能夠?qū)la受體拮抗劑的研發(fā)提供有效的篩選平臺(tái)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，就是為了解決上述問(wèn)題，提供ー種食蟹猴抗利尿激素受體VlA拮抗劑篩選平臺(tái)的建立。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案ー種食蟹猴抗利尿激素受體VlA拮抗劑篩選平臺(tái)的建立，其特征在于，包括以下步驟A、在384孔板里每孔植入I. 5萬(wàn)個(gè)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的陽(yáng)性克隆細(xì)胞，在37°C、5%ニ氧化碳氛圍的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)16-24小時(shí)；B、棄去培養(yǎng)基，200轉(zhuǎn)/分離心10秒去除殘留培養(yǎng)基，每孔加入30微升鈣離子檢測(cè)染料，在37°C、5%ニ氧化碳氛圍的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)90分鐘；C、用鈣離子檢測(cè)緩沖液配制4X的激動(dòng)劑d [Cha4] -AVP和IX的待測(cè)藥物；D、細(xì)胞孵育90分鐘后，棄去鈣離子檢測(cè)染料，200轉(zhuǎn)/分離心10秒去除殘留染料；E、每孔加入30微升IX的待測(cè)藥物，25°C孵育15分鐘，然后每孔再加入10微升4X的激動(dòng)劑d[Cha4]-AVP ；F、在室溫下用酶標(biāo)儀檢測(cè)，能夠抑制激動(dòng)劑引起的鈣離子釋放的藥物為食蟹猴抗利尿激素受體VlA拮抗劑。2、根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I所述的食蟹猴抗利尿激素受體VlA拮抗劑篩選平臺(tái)的建立，其特征在于所述的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的陽(yáng)性克隆細(xì)胞按以下步驟制備一、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A、在6孔板里，每孔植入兩百萬(wàn)個(gè)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞，用F12/10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)16-24小時(shí)；B、稀釋5微升脂質(zhì)體到125微升OptiMEM I低血清培養(yǎng)基，溫和混勻，室溫放置5分鐘；稀釋2微克食蟹猴抗利尿激素受體克隆質(zhì)粒到125微升OptiMEM I低血清培養(yǎng)基中，溫和混勻，室溫放置5分鐘；將上述兩者溫和混勻，室溫放置30分鐘后，加入6孔板中，輕輕混勻；C、在37で、5%ニ氧化碳氛圍的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24小時(shí)后，形成轉(zhuǎn)染體以備篩選；ニ、克隆篩選D、將F12/10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，將轉(zhuǎn)染體分別稀釋成I : 20、1 40和I : 80濃度，分別加入含有潮霉素400微克/毫升的上述培養(yǎng)過(guò)夜的培養(yǎng)基培養(yǎng)；E、接下來(lái)2周內(nèi)每天更換培養(yǎng)基，直到?jīng)]有轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞全部死亡后，進(jìn)行克 隆挑選，挑選出克隆的穩(wěn)定表達(dá)食蟹猴抗利尿激素受體細(xì)胞進(jìn)行下ー步驟；三、用酶標(biāo)儀篩選陽(yáng)性克隆細(xì)胞F、將挑選出的克隆細(xì)胞以5萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/孔的濃度植入96孔板中，在37°C、5%ニ氧化碳氛圍的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)過(guò)夜，然后棄去培養(yǎng)基，每孔加入100微升鈣離子檢測(cè)染料，在37で、5%ニ氧化碳氛圍的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)90分鐘；G、準(zhǔn)備濃度為I. 5微摩的激動(dòng)劑d[Cha4]_AVP，每孔加入25微升激動(dòng)劑；H、用酶標(biāo)儀檢測(cè)克隆細(xì)胞的鈣離子水平，激動(dòng)劑能夠有效刺激鈣離子水平提高的克隆細(xì)胞為陽(yáng)性克隆細(xì)胞。本發(fā)明食蟹猴抗利尿激素受體VlA拮抗劑篩選平臺(tái)的建立，以細(xì)胞水平的鈣流水平為主要檢測(cè)方法，建立了ー套對(duì)篩選食蟹猴抗利尿激素受體VlA拮抗劑藥物的方法。首次實(shí)現(xiàn)了在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)食蟹猴抗利尿激素受體，首次建立并優(yōu)化了對(duì)食蟹猴抗利尿激素受體藥物高通量篩選的平臺(tái)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I穩(wěn)定表達(dá)食蟹猴抗利尿激素的受體克隆中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系的建立一、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A、在6孔板里，每孔植入兩百萬(wàn)個(gè)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞，用F12/10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)16-24小時(shí)；B、稀釋5微升脂質(zhì)體到125微升OptiMEM I低血清培養(yǎng)基，溫和混勻，室溫放置5分鐘；稀釋2微克食蟹猴抗利尿激素受體克隆質(zhì)粒到125微升OptiMEMI低血清培養(yǎng)基中，溫和混勻，室溫放置5分鐘；將上述兩者溫和混勻，室溫放置30分鐘后，加入6孔板中，輕輕混勻；C、在37で、5%ニ氧化碳氛圍的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24小時(shí)后，形成轉(zhuǎn)染體以備篩選；ニ、克隆篩選D、將F12/10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，將轉(zhuǎn)染體分別稀釋成I : 20、1 40和I : 80濃度，分別加入含有潮霉素400微克/毫升的上述培養(yǎng)過(guò)夜的培養(yǎng)基培養(yǎng)；E、接下來(lái)2周內(nèi)每天更換培養(yǎng)基，直到?jīng)]有轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞全部死亡后，進(jìn)行克隆挑選，挑選出克隆的穩(wěn)定表達(dá)食蟹猴抗利尿激素受體細(xì)胞進(jìn)行下ー步驟；三、用酶標(biāo)儀篩選陽(yáng)性克隆細(xì)胞
F、將挑選出的克隆細(xì)胞以5萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/孔的濃度植入96孔板中，在37°C、5%ニ氧化碳氛圍的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)過(guò)夜，然后棄去培養(yǎng)基，每孔加入100微升鈣離子檢測(cè)染料，在37で、5%ニ氧化碳氛圍的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)90分鐘；G、準(zhǔn)備濃度為I. 5微摩的激動(dòng)劑d[Cha4]_AVP，每孔加入25微升激動(dòng)劑；H、用酶標(biāo)儀檢測(cè)克隆細(xì)胞的鈣離子水平，激動(dòng)劑能夠有效刺激鈣離子水平提高的克隆細(xì)胞為陽(yáng)性克隆細(xì)胞。用酶標(biāo)儀檢測(cè)時(shí),各項(xiàng)參數(shù)設(shè)置如表I所示表I
權(quán)利要求
1.一種食蟹猴抗利尿激素受體VIA拮抗劑篩選平臺(tái)的建立，其特征在于，包括以下步驟 A、在384孔板里每孔植入I.5萬(wàn)個(gè)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的陽(yáng)性克隆細(xì)胞，在37°C、5%二氧化碳氛圍的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)16-24小時(shí)； B、棄去培養(yǎng)基，200轉(zhuǎn)/分離心10秒去除殘留培養(yǎng)基，每孔加入30微升鈣離子檢測(cè)染料，在37°C、5%二氧化碳氛圍的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)90分鐘； C、用鈣離子檢測(cè)緩沖液配制4X的激動(dòng)劑d[Cha4]-AVP和IX的待測(cè)藥物； D、細(xì)胞孵育90分鐘后，棄去鈣離子檢測(cè)染料，200轉(zhuǎn)/分離心10秒去除殘留染料； E、每孔加入30微升IX的待測(cè)藥物，25°C孵育15分鐘，然后每孔再加入10微升4X的激動(dòng)劑 d[Cha4]-AVP ； F、在室溫下用酶標(biāo)儀檢測(cè)，能夠抑制激動(dòng)劑引起的鈣離子釋放的藥物為食蟹猴抗利尿激素受體VlA拮抗劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)I所述的食蟹猴抗利尿激素受體VlA拮抗劑篩選平臺(tái)的建立，其特征在于所述的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的陽(yáng)性克隆細(xì)胞按以下步驟制備 一、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 A、在6孔板里，每孔植入兩百萬(wàn)個(gè)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞，用F12/10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)16-24小時(shí)； B、稀釋5微升脂質(zhì)體到125微升OptiMEMI低血清培養(yǎng)基，溫和混勻，室溫放置5分鐘；稀釋2微克食蟹猴抗利尿激素受體克隆質(zhì)粒到125微升OptiMEM I低血清培養(yǎng)基中，溫和混勻，室溫放置5分鐘；將上述兩者溫和混勻，室溫放置30分鐘后，加入6孔板中，輕輕混勻； C、在37°C、5%二氧化碳氛圍的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24小時(shí)后，形成轉(zhuǎn)染體以備篩選； 二、克隆篩選 D、將F12/10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，將轉(zhuǎn)染體分別稀釋成I: 20、1 40和I 80濃度，分別加入含有潮霉素400微克/毫升的上述培養(yǎng)過(guò)夜的培養(yǎng)基培養(yǎng)； E、接下來(lái)2周內(nèi)每天更換培養(yǎng)基，直到?jīng)]有轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞全部死亡后，進(jìn)行克隆挑選，挑選出克隆的穩(wěn)定表達(dá)食蟹猴抗利尿激素受體細(xì)胞進(jìn)行下一步驟； 三、用酶標(biāo)儀篩選陽(yáng)性克隆細(xì)胞 F、將挑選出的克隆細(xì)胞以5萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/孔的濃度植入96孔板中，在37°C、5%二氧化碳氛圍的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)過(guò)夜，然后棄去培養(yǎng)基，每孔加入100微升鈣離子檢測(cè)染料，在37°C、5% 二氧化碳氛圍的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)90分鐘； G、準(zhǔn)備濃度為I.5微摩的激動(dòng)劑d[Cha4]-AVP，每孔加入25微升激動(dòng)劑； H、用酶標(biāo)儀檢測(cè)克隆細(xì)胞的鈣離子水平，激動(dòng)劑能夠有效刺激鈣離子水平提高的克隆細(xì)胞為陽(yáng)性克隆細(xì)胞。
全文摘要
一種食蟹猴抗利尿激素受體V1A拮抗劑篩選平臺(tái)的建立，方法是，首先培養(yǎng)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的陽(yáng)性克隆細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基后加入鈣離子檢測(cè)染料繼續(xù)培養(yǎng)，棄去鈣離子檢測(cè)染料后加入待測(cè)藥物孵育，然后再加入激動(dòng)劑d[Cha4]-AVP，用酶標(biāo)儀檢測(cè)，能夠抑制激動(dòng)劑引起的鈣離子釋放的藥物為食蟹猴抗利尿激素受體V1A拮抗劑。本發(fā)明以細(xì)胞水平的鈣流水平為主要檢測(cè)方法，建立了一套對(duì)篩選食蟹猴抗利尿激素受體V1A拮抗劑藥物的方法。首次實(shí)現(xiàn)了在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)食蟹猴抗利尿激素受體，首次建立并優(yōu)化了對(duì)食蟹猴抗利尿激素受體藥物高通量篩選的平臺(tái)。
文檔編號(hào)C12N15/85GK102766674SQ201210260320
公開(kāi)日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2012年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月25日
發(fā)明者夏遠(yuǎn)峰, 張玉珂, 秦旭釗, 陳景才 申請(qǐng)人:輝源生物科技(上海)有限公司