一種黑曲霉菌株及其應(yīng)用的制作方法

專利名稱：一種黑曲霉菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵工程與生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種高產(chǎn)阿魏酸酯酶的黑曲霉菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
阿魏酸酯酶，包括肉桂酸酯酶和肉桂酸水解酶，是羧酸酯酶的一個亞類，指能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯鍵，將阿魏酸游離出來的酶，有利于植物細胞壁的降解和多糖的釋放。MackenzieC R等于1987年在培養(yǎng)橄欖色鏈霉菌(Streptomyces olivochromogenes)時第一次觀測到阿魏酸酯酶可以使麥麩釋放阿魏酸。從那以后，人們認(rèn)識到阿魏酸酯酶是半纖維素水解酶。研究表明真菌和細菌都能分泌阿魏酸酯酶，但到現(xiàn)在為止，大多數(shù)的阿魏酸酯酶都是從真菌而不是細菌中分離的。包含大量酯化阿魏酸的復(fù)合碳源如去淀粉麥麩、玉米皮、啤酒糟和甜菜渣等最適合用來產(chǎn)生阿魏酸酯 酶。在哺乳類動物的細胞中也檢測到阿魏酸酯酶的活性，但這些酶還沒有被分離純化，蛋白序列需要與微生物酶進一步的比較。用阿魏酸酯酶處理植物性原料在食品、飼料和造紙等工業(yè)中有著光明的前景。植物細胞壁是一個由多糖網(wǎng)絡(luò)組成的三維結(jié)構(gòu)圖，這些多糖包括纖維素，半纖維素，木質(zhì)素等，它們之間通過羥基肉桂酸類酯鍵相連，所以在植物細胞壁中存在大量的酚酸化合物。在食品工業(yè)通過阿魏酸酯酶降解植物細胞壁，可以得到大量酚酸化合物。酚酸化合物由于具有強大的抗氧化功能，已愈發(fā)的受到人們的關(guān)注，尤其是阿魏酸，它不僅可以作為抗氧化劑，還具有一些生理作用，如抗血栓，抗癌等，同時它還可以作為合成香蘭素的前體。在飼料工業(yè)中阿魏酸酯酶可以打破半纖維素和木質(zhì)素之間相互的交聯(lián)，從而使細胞壁的機構(gòu)變得疏松，可以作為添加劑加快動物對食物的降解速度，同時還能加深動物對飼料的利用程度，減少營養(yǎng)物質(zhì)的流失。在造紙工業(yè)可以部分地去除木質(zhì)素，減少化學(xué)漂白齊U的使用量，增加了紙漿的白度，使紙的質(zhì)量進一步提高。目前國內(nèi)也有利用微生物發(fā)酵產(chǎn)阿魏酸酯酶的報道，CN102286442A公開了利用煙曲霉發(fā)酵生產(chǎn)阿魏酸酯酶，并取得了一定效果，但總體來說現(xiàn)有工藝產(chǎn)酶水平較低，發(fā)酵原料需要經(jīng)過特殊的前處理，對產(chǎn)酶微生物的發(fā)酵特性、營養(yǎng)特性和發(fā)酵技術(shù)并未進行系統(tǒng)的研究，這也就限制了阿魏酸酯酶在實際工業(yè)中的應(yīng)用。因此探索酶活高、安全的阿魏酸酯酶產(chǎn)生菌顯得很有必要，具有極大的研究和開發(fā)價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種黑曲霉菌株，解決現(xiàn)有工藝產(chǎn)酶水平低，發(fā)酵原料需經(jīng)特殊前處理的問題。一種黑曲霉菌株，命名為黑曲霉(Aspergillus niger) ZJUQH2012147，該菌株已于2012年05月23日保藏在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱為CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 6152。
該菌株屬半知菌亞門，絲孢綱，絲孢目，曲霉屬，在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(MEA)上生長較快，25 °C黑暗條件下培養(yǎng)7天，菌落直徑58-61mm，質(zhì)地絨狀；分生孢子頭黑褐色，初期球形，后期開裂，菌落背面無任何色素；菌株具有足細胞，分生孢子梗高大，寬7. 5-12. 8 u m，壁光滑，頂囊球形，大部分表面可育，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層，分生孢子近球形，淺到褐色，具小刺，3. 0-5. 5 iim。未見有性孢子。本發(fā)明還提供了所述黑曲霉ZJUQH2012147在生產(chǎn)阿魏酸酯酶中的應(yīng)用。具體可以包括以下步驟 (I)將黑曲霉ZJUQH2012147接入種子培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng)，獲得種子液；(2)將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)條件影響菌株的繁殖能力以及產(chǎn)酶能力，所述增殖培養(yǎng)條件選擇為溫度25 30°C，時間100 200小時；更優(yōu)選為，溫度28°C，時間144小時。所述發(fā)酵培養(yǎng)條件可以為溫度25 30°C，時間100 200小時；更優(yōu)選為，溫度28。。，時間120小時。發(fā)酵完成后，阿魏酸酯酶存在發(fā)酵液中，通過常規(guī)酶分離方法即可實現(xiàn)分離純化。所述發(fā)酵培養(yǎng)可以是搖床培養(yǎng)，也可以是利用發(fā)酵罐工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)，當(dāng)采用搖床培養(yǎng)時，搖床轉(zhuǎn)速優(yōu)選為100 200r/min。以IL體積計,所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括碳源20 40g,無機鹽5 IOg,氮源5 20g,所述碳源為豆柏、麥麩、玉米棒和玉米桿中的至少一種，優(yōu)選為豆柏、麥麩或它們的混合物。該些復(fù)合碳源含有大量酯化阿魏酸，適于生產(chǎn)阿魏酸酯酶。所述的氮源可以是有機氮源、無機氮源或它們的混合物，有機氮源可以選擇蛋白胨、酵母粉或它們的混合物，無機氮源可以選用銨鹽，如硫酸銨、氯化銨、硝酸鈉等。無機鹽主要包括細菌細胞生長所需的各種元素，如P、Na、K、Mg、Ca等，其用量可參考常規(guī)細菌培養(yǎng)基的配方。最優(yōu)選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基選用如下任一培養(yǎng)基培養(yǎng)基I :豆柏 35. 0g, Na2HPO4 7H20 4g，NaCl 0. 2g，蛋白胨 15g，MgSO4 7H200. 3g, CaCl2O. 05g,蒸懼水 1000ml, pH 自然;培養(yǎng)基2 :豆柏 20. Og, KH2PO4 3g, Na2HPO4 7H20 6g, NaCl 0. lg, (NH4)2SO4 8g,MgSO4 7H20 0. 2g, CaCl2 0. 05g，蒸餾水 1000ml, pH 自然;培養(yǎng)基3 :豆柏 20. Og,麥麩 20. 0g, KH2PO4 3g，Na2HPO4 7H20 6g，NaCl 0. lg,酵母粉 8g，MgSO4 7H20 0. 2g，CaCl2 0. 05g，蒸餾水 1000ml, pH 自然。與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明有益效果為(I)本發(fā)明黑曲霉菌株產(chǎn)阿魏酸酯酶活性高，易于實現(xiàn)阿魏酸酯酶的工業(yè)化生產(chǎn)。(2)本發(fā)明生產(chǎn)阿魏酸酯酶的工藝采用豆柏、麥麩等粗原料作為發(fā)酵原料，該粗原料無需進行前處理，生產(chǎn)成本低。(3)本發(fā)明對發(fā)酵工藝進行了系統(tǒng)優(yōu)化，取得了較理想的產(chǎn)酶效果。
具體實施例方式一、培養(yǎng)基種子斜面培養(yǎng)基馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，pH自然。
初篩培養(yǎng)基KH2PO43g，Na2HPO4 7H20 6g，NaCl 0. lg，蛋白胨 8g，MgSO4 7H200. 2g, CaCl2 0.05g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，無菌的含阿魏酸甲酯的二甲基甲酰胺溶液(質(zhì)量體積比為10% )0.3ml，pH自然。復(fù)篩培養(yǎng)基豆柏20g, KH2PO4 3g，Na2HPO4 7H20 6g，NaCl 0. lg,蛋白胨 8g，MgSO4 7H20 0. 2g, CaCl2 0. 05g，蒸餾水 1000ml, pH 自然。種子培養(yǎng)基馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20，蒸餾水1000ml，pH自然。發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)基I :豆柏 35. 0g, Na2HPO4 7H20 4g，NaCl 0. 2g，蛋白胨 15g，MgSO4 7H200. 3g, CaCl2 0. 05g,蒸懼水 1000ml, pH 自然;培養(yǎng)基2 :豆柏 20. Og, KH2PO4 3g, Na2HPO4 7H20 6g, NaCl 0. lg, (NH4)2S048g, MgSO4 7H20 0. 2g, CaCl2 0. 05g，蒸餾水 1000ml, pH 自然;培養(yǎng)基3 :豆柏 20. Og,麥麩 20. 0g, KH2PO4 3g，Na2HPO4 7H20 6g，NaCl 0. lg,酵母粉 8g，MgSO4 7H20 0. 2g，CaCl2 0. 05g，蒸餾水 1000ml, pH 自然。二、菌株的分離純化從造紙廠、豆柏加工廠、小麥地和酒廠的土壤樣品中采集到50份樣品先經(jīng)增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)120h,稀釋涂布于察氏培養(yǎng)基平板形成單菌落,再挑選50個菌落點種于初篩培養(yǎng)基上，選擇顯示白色透明圈的菌落進行搖瓶復(fù)篩，得到一株產(chǎn)酶活最高的菌株為W1，測定發(fā)酵液阿魏酸酯酶活力(此菌種28°C培養(yǎng)120小時酶活達到162. 84U/L)。經(jīng)Y _射線誘變(劑量700Gy)，分別稀釋菌液10倍、IO2倍、IO3倍，IO4倍、IO5倍、IO6倍，然后涂布菌液于初篩培養(yǎng)基，培養(yǎng)適當(dāng)時間，挑選產(chǎn)生白色透明圈的菌落于搖瓶復(fù)篩(采用復(fù)篩培養(yǎng)基培養(yǎng))，培養(yǎng)168小時后測定阿魏酸酯酶酶活，獲得一株酶活最高菌株，命名為ZJUQH2012147，其酶活達到 213. 07U/L。三、菌株的鑒定上述分離的菌株為曲霉屬，自麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(MEA)上生長較快，25°C黑暗條件下培養(yǎng)7天，菌落直徑58-61_，質(zhì)地絨狀；分生孢子頭黑褐色，初期球形，后期開裂，菌落背面無任何色素；菌株具有足細胞，分生孢子梗高大，寬7. 5-12. 8 u m，壁光滑，頂囊球形，大部分表面可育，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層，分生孢子近球形，淺到褐色，具小刺，3. 0-5. 5 u m。未見有性孢子。測定的28SrRNA D1D2區(qū)序列如序列表SEQ ID NO. I所示。綜合其菌落形態(tài)、顯微特征以及rRNA基因序列等實驗數(shù)據(jù)綜合分析，可以鑒定為黑曲霉，并命名為黑曲霉(Aspergillus niger)ZJUQH2012147。該菌株已于2012年05月23日保藏在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱為CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 6152。四、菌株的發(fā)酵培養(yǎng)及阿魏酸酯酶酶活測定將黑曲霉ZJUQH2012147接種到種子培養(yǎng)基進行在28°C下增殖培養(yǎng)144h，獲取孢子。將發(fā)酵培養(yǎng)基(培養(yǎng)基I、培養(yǎng)2或培養(yǎng)基3) 30ml盛于250ml三角瓶中，接種生理鹽水沖洗的孢子Iml (孢子數(shù)約為IO6個/ml)，28°C在旋轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)120h，轉(zhuǎn)速為140r/min0上述實施例中，酶的提取及活性測定方法如下將發(fā)酵步驟后所得的菌懸液置于低速離心機中3000rpm離心30min，取上清液即為粗酶液。用PH6. O檸檬酸鹽緩沖液稀釋一定倍數(shù)以測定酶活。用二次鹽析的方法對粗酶液進行初步純化，第一次加入硫酸銨濃度為40%，4°C過夜后于5000rpm離心30min，取上清，再加入硫酸銨至70%, 4°C過夜后再次于5000rpm離心30min,所得沉淀即為初步純化的阿魏酸酯酶，然后用PH6. 0的檸檬酸鹽緩沖液稀釋，4°C保存待用。阿魏酸酯酶的測定如下因底物阿魏酸甲酯不溶于水,故用一級色譜純甲醇溶解并配制成50mM。將其用90ml、0. IM的pH6. 0檸檬酸鹽緩沖液稀釋。取2mL稀釋后的阿魏酸甲酯溶液重新加熱至40°C，加入ImL稀釋10倍的酶液?；旌衔镉?0°C下反應(yīng)30min，再加熱至100°C，IOmin后終止反應(yīng)。反應(yīng)混合物于室溫冷卻。以蒸餾水代替底物溶液體系為空白對照。酶解反應(yīng)后的阿魏酸產(chǎn)物采用HPLC法定量分析，并在本試驗中加以修改。實驗中所采用的高效液相色譜條件為采用乙腈和0. 5%甲酸作為流動相，使用前用0. 45iim微膜過濾，將過濾好的溶劑常溫下超聲波處理半小時脫氣。經(jīng)前期試驗摸索確定色譜條件為流動相為乙腈和0. 5%甲酸(體積比30 70)，C18反相柱(250X4. 6mm，4 y m)，檢測溫度30 0C，進樣量10 u L，檢測波長317nm?！ぐ⑽核狨ッ傅拿富疃x為在40°C、pH6. 0條件下，每分鐘水解底物阿魏酸甲酯產(chǎn)生I ii mol阿魏酸所需要的酶量為一個酶活力單位。培養(yǎng)基I培養(yǎng)獲得阿魏酸酯酶酶活為138. 3U/L，培養(yǎng)基2培養(yǎng)獲得阿魏酸酯酶酶活為116. 9U/L，培養(yǎng)基3培養(yǎng)獲得阿魏酸酯酶酶活為173. 9U/L。李夏蘭等(一株產(chǎn)阿魏酸酯酶青霉菌株的篩選、鑒定及生產(chǎn)特征.微生物學(xué)通報，2010,37(11) :1588-1593.)從腐爛的木質(zhì)纖維中取樣，通過富集培養(yǎng)，初篩和復(fù)篩得到一株橘青霉，其阿魏酸酯酶酶活最高達到20. 75U/L，本發(fā)明專利所獲得酶活要遠遠高于報道的產(chǎn)酶菌株。
權(quán)利要求
1.一種黑曲霉菌株，其特征在于，命名為黑曲霉(Aspergillus niger)ZJUQH2012147,保藏編號為CGMCC No. 6152。
2.如權(quán)利要求I所述的黑曲霉ZJUQH2012147在生產(chǎn)阿魏酸酯酶中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟 (1)將黑曲霉ZJUQH2012147接入種子培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng)，獲得種子液； (2)將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述增殖培養(yǎng)的條件為溫度為25 30°C，時間100 200小時。
5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為溫度為25 30°C，時間為100 200小時。
6.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)為搖床振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為100 200r/min。
7.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，以IL體積計，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括碳源20 40g,無機鹽5 IOg,氮源5 20g,所述碳源為豆柏、麥麩、玉米棒和玉米桿中的至少一種。
8.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的氮源為蛋白胨、硫酸銨、酵母粉、氯化銨或硝酸鈉。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黑曲霉菌株及其應(yīng)用，該菌株命名為黑曲霉(Aspergillus niger)ZJUQH2012147，已于2012年05月23日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No.6152。本發(fā)明還公開了所述菌株生產(chǎn)阿魏酸酯酶的方法，包括(1)將黑曲霉ZJUQH201217接入種子培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng)，獲得種子液；(2)將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)。本發(fā)明黑曲霉菌株產(chǎn)阿魏酸酯酶活性高，易于實現(xiàn)阿魏酸酯酶的工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明生產(chǎn)阿魏酸酯酶的工藝采用豆粕、麥麩等粗原料作為發(fā)酵原料，該粗原料無需進行前處理，生產(chǎn)成本低。
文檔編號C12R1/685GK102796670SQ20121025974
公開日2012年11月28日 申請日期2012年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月25日
發(fā)明者陳啟和, 徐騰洋, 董亞晨, 方若思, 何國慶 申請人:浙江大學(xué)