專利名稱：一種施羅氏弧菌的環(huán)介導等溫擴增檢測引物、檢測試劑盒和檢測方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物檢測領域，具體涉及一種基于環(huán)介導等溫擴增(loop-mediatedisothermal ampification,LAMP)技術原理而開發(fā)的施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的環(huán)介導等溫擴增檢測引物、檢測試劑盒和檢測方法。
背景技術：
施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)是一種海洋弧菌,能夠侵染珊瑚，引起珊瑚的細菌性白化。目前，施羅氏弧菌的檢測方法主要是傳統(tǒng)的微生物分類鑒定方法及依賴于PCR技術的檢測方法。傳統(tǒng)的微生物分類和鑒定方法主要足以微生物的形態(tài)學和生理生化等特性作為判斷依據(jù)，雖然結果可信度高，但是繁瑣且費時。聚合酶鏈式反應(PCR)靈敏度高，可達98% 100%，但是特異性較差，而且需要PCR擴增儀、凝膠電泳儀等相關貴重設備，不利于基層實驗站及現(xiàn)場快速檢測。 環(huán)介導等溫擴增(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)技術是Notomi等于2000午報道的一種新型等溫核酸擴增方法，該法針對靶基因的6個區(qū)域設計4條特異引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒溫條件(65°C左右)孵育約60min，即可完成核酸擴增反應，產(chǎn)生肉眼可見的反應副產(chǎn)物一白色焦磷酸鎂沉淀。通過逆轉(zhuǎn)錄酶，還可進行RT-LAMP而完成針對RNA的擴增。該技術具有不需要PCR儀、肉眼可判斷結果及反應時間短等優(yōu)點。擴增結果也可用結合雙鏈DNA的熒光染料SYBRGreen I染色，在紫外燈或日光下通過肉眼進行判定，如果含有擴增產(chǎn)物，反應混合物變綠；反之，則保持SYBR Green I的橙色不變。目前LAMP技術已有成功用于其他病原體檢測的報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測能力強、檢測限高、檢測時間短、特異性高、對儀器設備要求簡單的施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的環(huán)介導等溫擴增(LAMP)檢測引物、檢測試劑盒和檢測方法。本發(fā)明利用環(huán)介導等溫擴增技術，以施羅氏弧菌的toxR基因(Genebank登錄號為EU727208. I)為靶基因設計特異性引物，進行環(huán)介導等溫擴增反應，并優(yōu)化反應條件，在環(huán)介導等溫擴增檢測過程中加入陽性對照質(zhì)控品和陰性對照質(zhì)控品，最后通過電泳分析或SYBR Green I熒光染色顯色法檢測陽性對照質(zhì)控品的擴增產(chǎn)物、陰性對照質(zhì)控品的擴增產(chǎn)物和目標樣品組的擴增產(chǎn)物，從而判斷目標樣品是否含有施羅氏弧菌，達到簡單、經(jīng)濟、快捷和靈敏的效果，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。本發(fā)明的施羅氏弧菌的環(huán)介導等溫擴增檢測引物，其特征在于，所述的檢測引物如下所示前外引物F3 :5、-CAAACGGTTGGCGGTGTC-3,；(如 SEQ ID NO. I 所示)
后外引物B3 :5、-CCGCAAGATGCTGAAGGATC-3、；(如 SEQ ID NO. 2 所示)前內(nèi)引物FIP:5、-CTGCAAGAGCCAAACTCTGCGTCTTITGGAGCTGGTGGGAT-3、；(如SEQ IDNO. 3所示)后內(nèi)引物BIP :5、-GCTTCTGATGAAGCGACAGGCAGTAAAGACGGTGCCTAAGCG-3、；(如 SEQID NO. 4 所示)。本發(fā)明的施羅氏弧菌的環(huán)介導等溫擴增檢測試劑盒，包括環(huán)介導等溫擴增反應液、BstDNA聚合酶、陽性對照質(zhì)控品、陰性對照質(zhì)控品和檢測引物，其特征在于，所述的檢測引物包括前外引物F3 :5、-CAAACGGTTGGCGGTGTC-3,；(如 SEQ ID NO. I 所示)后外引物B3 :5、-CCGCAAGATGCTGAAGGATC-3、；(如 SEQ ID NO. 2 所示)前內(nèi)引物FIP:5、-CTGCAAGAGCCAAACTCTGCGTCTTITGGAGCTGGTGGGAT-3、；(如SEQ IDNO. 3所示)后內(nèi)引物BIP :5、-GCTTCTGATGAAGCGACAGGCAGTAAAGACGGTGCCTAAGCG-3、；(如 SEQIDN0. 4 所示)。所述的陽性對照質(zhì)控品優(yōu)選為含有施羅氏弧菌的toxR基因(Genebank登錄號為EU727208. I)的質(zhì)粒DNA，可以通過人工的方法構建，如PCR的方法從施羅氏弧菌的基因組DNA擴增得到toxR基因。所述的陰性對照質(zhì)控品為不同于施羅氏弧菌的toxR基因(Genebank登錄號為EU727208. I)的DNA序列即可。本發(fā)明的陽性對照質(zhì)控品和陰性對照質(zhì)控品是衡量實驗檢測結果是否有效的重要標志。在每批實驗中，必須引入一個Vibrio shilonii的陽性對照質(zhì)控品的檢測，以保證反應體系不會出現(xiàn)假陰性反應；同樣的，在每批實驗中，必須引入一個陰性對照質(zhì)控品的檢測，以保證反應體系不會出現(xiàn)假陽性結果。本發(fā)明的非診斷目的的施羅氏弧菌的環(huán)介導等溫擴增檢測方法，其特征在于，包括以下步驟(I)對樣品進行增菌培養(yǎng)，提取增菌液中菌體的基因組DNA作為模板；(2)使用上述施羅氏弧菌的環(huán)介導等溫擴增檢測引物，與環(huán)介導等溫擴增反應液、BstDNA聚合酶和樣品菌體的基因組DNA混合形成擴增反應體系，進行環(huán)介導等溫擴增反應，以陽性對照質(zhì)控品和陰性對照質(zhì)控品分別作為陽性對照和陰性對照；(3)擴增反應完成后，通過與陽性對照和陰性對照進行對比，判斷樣品擴增反應體系中是否擴增得到擴增產(chǎn)物，來判斷樣品中是否含有施羅氏弧菌。所述的通過與陽性對照和陰性對照進行對比，判斷樣品擴增反應體系中是否擴增得到擴增產(chǎn)物，來判斷樣品中是否含有施羅氏弧菌具體優(yōu)選為通過電泳分析或SYBR GreenI熒光染色顯色法同時檢測陽性對照、陰性對照和樣品擴增反應體系的擴增產(chǎn)物，根據(jù)是否有梯狀電泳條帶或反應體系的顏色來判斷樣品中是否有施羅氏弧菌。
SYBR Green I染色若反應混合物變綠，說明含有擴增產(chǎn)物，樣品中含有施羅氏弧菌(Vibrio shilonii);反之,反應混合物保持SYBR Green I的橙色不變,則樣品中不含有施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)。瓊脂糖凝膠電泳檢測若樣品擴增反應體系的擴增產(chǎn)物的電泳條帶呈現(xiàn)特異性的梯狀條帶，說明反應混合物中含有目的產(chǎn)物，樣品中含有施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)；若無梯狀條帶產(chǎn)生，說明樣品中不含有施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)。所述步驟(2)的擴增反應體系優(yōu)選為8mmol/LMgS04>I. Ommol/L dNTPs、0. 8mol/Lbetaine (甜菜堿)、1. 2 u mol/L 前內(nèi)引物 FIP、L 2 u mol/L 后內(nèi)引物 BIP、0. 2 u mol/L 前外引物 F3、0. 2iimol/L 后外引物 B3、4X104U/L Bst DNA 聚合酶、I XThermoPol buffer、適量的模板DNA和水。所述步驟(2)的進行環(huán)介導等溫擴增反應，其反應參數(shù)優(yōu)選為65°C溫育I小時，然后80°C滅活lOmin，最后10°C保存。所述的陽性對照質(zhì)控品優(yōu)選為含有施羅氏弧菌的toxR基因(Genebank登錄號為EU727208. I)的質(zhì)粒DNA，可以通過人工的方法構建，如PCR的方法從施羅氏弧菌的基因組DNA擴增得到toxR基因。所述的陰性對照質(zhì)控品為不同于施羅氏弧菌的toxR基因(Genebank登錄號為 EU727208. I)的DNA序列即可。本發(fā)明一方面是填補在施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)環(huán)介導等溫擴增(LAMP)檢測技術方面的空白，使施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)檢測技術達到國際先進水平，檢測能力大幅提高，施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的環(huán)介導等溫擴增(LAMP)檢測方法的檢測限高于傳統(tǒng)檢測方法100 200倍；另一方面本發(fā)明的施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的環(huán)介導等溫擴增(LAMP)檢測方法具有儀器設備要求簡單(只需要簡單結構的恒溫箱)、檢測時間短(0. 5^1. 0小時)、特異性高(針對靶基因的8/6個區(qū)域設計6/4種特異引物)等特點，彌補了經(jīng)典聚合酶鏈式反應(PCR)擴增技術對儀器設備要求高(如PCR擴增儀、瓊脂凝膠電泳系統(tǒng)等)、技術較為復雜等諸多弊端，具有檢測能力強、檢測時間短、對儀器設備要求簡單的優(yōu)點，具有廣闊的應用前景。
圖I是實施例3中的樣品、陽性對照質(zhì)控品和陰性對照質(zhì)控品的環(huán)介導等溫擴增反應后的擴增產(chǎn)物的電泳圖，其中M marker ;1、2為陽性對照；3、4為陰性對照；5為樣品；圖2是實施例3中的樣品、陽性對照質(zhì)控品和陰性對照質(zhì)控品的環(huán)介導等溫擴增反應后的擴增產(chǎn)物經(jīng)熒光染色后的結果圖，其中1、2、3為陽性對照的三個重復，4、5是樣品的兩個重復，6、7、8為陰性對照的三個重復。
具體實施例方式以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。實施例I :引物的設計和合成按照環(huán)介導等溫擴增引物的設計原則，利用Genebank數(shù)據(jù)庫查找施羅氏弧菌中適用環(huán)介導等溫擴增的基因序列，選定toxR基因(Genebank登錄號為EU727208. I)為靶基因，針對施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的toxR基因設計環(huán)介導等溫擴增引物。按照LAMP引物設計原則，利用Genebank數(shù)據(jù)庫查找Vibrio shilonii的LAMP基因序列,選取其特異性序列，利用PrimerExplorer IV軟件進行進一步分析,針對施羅氏弧菌的祀基因設計一套引物。
由此設計的施羅氏弧菌的環(huán)介導等溫擴增檢測引物為前外引物F3 :5、-CAAACGGTTGGCGGTGTC-3、；后外引物B3 :5、-CCGCAAGATGCTGAAGGATC-3、；前內(nèi)引物 FIP : 5、-CTGCAAGAGCCAAACTCTGCGTCTTTTGGAGCTGGTGGGAT-3、；后內(nèi)引物BIP :5、-GCTTCTGATGAAGCGACAGGCAGTAAAGACGGTGCCTAAGCG-3、。實施例2:核酸提取從37°C搖床培養(yǎng)10小時的施羅氏弧菌菌懸液中吸取菌液lmL，12000r/min離心5min,去上清,在沉淀中加入100 u L無菌水,混勻后，于100°C水浴IOmin,再冰浴2min,12000r/min離心5min，上清液即為施羅氏弧菌基因組DNA，將其作為DNA模板用于環(huán)介導等溫擴增反應。實施例3 :環(huán)介導等溫擴增反應樣品的環(huán)介導等溫擴增反應體系，反應體系25 ii L，包括實施例2的DNA模板2 u L, I XThermoPol緩沖液(反應體系終濃度),8mmol/L MgSO4(反應體系終濃度)，I. Ommol/LdNTPs(反應體系終濃度)，0. 8mol/L betaine(反應體系終濃度)，I. 2u mol/L前內(nèi)引物FIP(反應體系終濃度)，I. 2 u mol/L后內(nèi)引物BIP (反應體系終濃度)，0. 2 u mol/L前外引物F3(反應體系終濃度)，0. 2 u mol/L后外引物B3 (反應體系終濃度)，IUBstDNA聚合酶，用滅菌去尚子水補齊至25 u L0陽性對照質(zhì)控品的環(huán)介導等溫擴增反應體系，反應體系25 UL，包括人工構建的含有施羅氏弧菌toxR基因的質(zhì)粒DNA2ii L，I X ThermoPol緩沖液(反應體系終濃度)，8mmoI/LMgSO4 (反應體系終濃度)，I. Ommol/L dNTPs (反應體系終濃度),0. 8mol/L betaine(反應體系終濃度)，I. 2 u mol/L前內(nèi)引物FIP (反應體系終濃度)，I. 2 u mol/L后內(nèi)引物BIP(反應體系終濃度)，0. 2 ii mol/L前外引物F3 (反應體系終濃度),0. 2 y mol/L后外引物B3(反應體系終濃度)，IU Bst DNA聚合酶，用滅菌去離子水補齊至25 iiL。所述的人工構建的含有施羅氏弧菌toxR基因的質(zhì)粒DNA的制備方法為以pUC19質(zhì)粒作為載體，根據(jù)Genebank中的基因序列人工合成toxR基因片度作為目的DNA片段，以E. coliDH5a作為感受態(tài)細胞。將pUC19質(zhì)粒以Hind III酶切后，與目的DNA片段在T4連接酶的催化下連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5a感受態(tài)細胞，經(jīng)氨芐青霉素平板篩選出陽性克隆，以堿裂解法提取重組質(zhì)粒,經(jīng)酶切電泳和PCR電泳檢測質(zhì)粒構建的正確性。陰性對照質(zhì)控品的環(huán)介導等溫擴增反應體系，反應體系25y L，包括陰性對照質(zhì)控品(以大腸桿菌(E. coli)基因組DNA作為陰性對照質(zhì)控品)2 u L，IXThermoPol緩沖液(反應體系終濃度)，8mmol/L MgSO4 (反應體系終濃度)，I. Ommol/L dNTPs (反應體系終濃度)，0. 8mol/Lbetaine (反應體系終濃度)，I. 2u mol/L前內(nèi)引物FIP (反應體系終濃度)，
I.2 ii mol/L后內(nèi)引物BIP (反應體系終濃度)，0. 2iimol/L前外引物F3 (反應體系終濃度)，0. 2 u mol/L后外引物B3 (反應體系終濃度)，IUBstDNA聚合酶，用滅菌去離子水補齊至25 u L0分別將上述三種環(huán)介導等溫擴增反應體系混合均勻后，放入恒溫水浴箱，設定反應條件65°C,60min ;80°C，lOmin，終止反應;10°C保存。環(huán)介導等溫擴增反應完成后取5 ii L上述三種擴增反應體系的擴增產(chǎn)物，于2%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，如圖I所示，電泳分析檢測結果顯示樣品的環(huán)介導等溫擴增反應體系和陽性對照質(zhì)控品的環(huán)介導等溫擴增反應體系的電泳條帶呈現(xiàn)特異性的梯狀條帶，而陰性對照質(zhì)控品的環(huán)介導等溫擴增反應體系無特異性的條帶，說明樣品的DNA模板含有施羅氏弧菌的特異性toxR基因，則說明樣品中含有施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)。分別取I ii L SYBR Green I熒光染料，與反應完成后的上述三種擴增體系混勻，觀察反應體系是否顏色發(fā)生變化。如圖2所示，SYBR Green I熒光染色顯色法檢測結果顯示樣品的環(huán)介導等溫擴增反應體系和陽性對照質(zhì)控品的環(huán)介導等溫擴增反應體系變成綠色，而陰性對照質(zhì)控品的環(huán)介導等溫擴增反應體系仍為橙色，說明樣品的DNA模板含有施羅氏弧菌的特異性toxR基因，則說明樣品中含有施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)。綜上所述，利用本發(fā)明的檢測引物及檢測方法，可以簡單、經(jīng)濟、快捷、靈敏地檢測 出施羅氏弧菌，且檢測結果準確可靠。
權利要求
1.一種施羅氏弧菌的環(huán)介導等溫擴增檢測引物，其特征在于，所述的檢測引物如下所示 前外引物 F3 :5、-CAAACGGITGGCGGTGTC-3、； 后外引物 B3 :5、-CCGCAAGATGCTGAAGGATC-3、；前內(nèi)引物 FIP 5, -CTGCAAGAGCCAAACTCTGCGTCTTTTGGAGCTGGTGGGAT-3,；后內(nèi)引物 BIP :5、-GCTTCTGATGAAGCGACAGGCAGTAAAGACGGTGCCTAAGCG-3、。
2.一種施羅氏弧菌的環(huán)介導等溫擴增檢測試劑盒，包括環(huán)介導等溫擴增反應液、BstDNA聚合酶、陽性對照質(zhì)控品、陰性對照質(zhì)控品和檢測引物，其特征在于，所述的檢測引物包括 前外引物 F3 :5、-CAAACGGITGGCGGTGTC-3、； 后外引物 B3 :5、-CCGCAAGATGCTGAAGGATC-3、；前內(nèi)引物 FIP 5, -CTGCAAGAGCCAAACTCTGCGTCTTTTGGAGCTGGTGGGAT-3,；后內(nèi)引物 BIP :5、-GCTTCTGATGAAGCGACAGGCAGTAAAGACGGTGCCTAAGCG-3、。
3.根據(jù)權利要求2所述的施羅氏弧菌的環(huán)介導等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于，所述的陽性對照質(zhì)控品為含有施羅氏弧菌的toxR基因的質(zhì)粒DNA。
4.根據(jù)權利要求2所述的施羅氏弧菌的環(huán)介導等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于，所述的陰性對照質(zhì)控品為不同于施羅氏弧菌的toxR基因的DNA序列。
5.一種非診斷目的的施羅氏弧菌的環(huán)介導等溫擴增檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)對樣品進行增菌培養(yǎng)，提取增菌液中菌體的基因組DNA作為模板； (2)使用權利要求I所述的施羅氏弧菌的環(huán)介導等溫擴增檢測引物，與環(huán)介導等溫擴增反應液、Bst DNA聚合酶和樣品菌體的基因組DNA混合形成擴增反應體系，進行環(huán)介導等溫擴增反應，以陽性對照質(zhì)控品和陰性對照質(zhì)控品分別作為陽性對照和陰性對照； (3)擴增反應完成后，通過與陽性對照和陰性對照進行對比，判斷樣品擴增反應體系中是否擴增得到擴增產(chǎn)物，來判斷樣品中是否含有施羅氏弧菌。
6.根據(jù)權利要求5所述的非診斷目的的施羅氏弧菌的環(huán)介導等溫擴增檢測方法，其特征在于，通過與陽性對照和陰性對照進行對比，判斷樣品擴增反應體系中是否擴增得到擴增產(chǎn)物，來判斷樣品中是否含有施羅氏弧菌具體為通過電泳分析或SYBR Green I熒光染色顯色法同時檢測陽性對照、陰性對照和樣品擴增反應體系的擴增產(chǎn)物，根據(jù)是否有梯狀電泳條帶或反應體系的顏色來判斷樣品中是否有施羅氏弧菌。
7.根據(jù)權利要求5所述的非診斷目的的施羅氏弧菌的環(huán)介導等溫擴增檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)的擴增反應體系為8mmol/L MgSO4、I. OmmoI/L dNTPs、0. 8mol/Lbetaine、I. 2 u mol/L 前內(nèi)引物 FIP、I. 2u mol/L 后內(nèi)引物 BIP、0. 2 u mol/L 前外引物 F3、0. 2iimol/L后外引物B3、4X104U/LBst DNA聚合酶、I X ThermoPol buffer、適量的模板DNA和水。
8.根據(jù)權利要求5所述的非診斷目的的施羅氏弧菌的環(huán)介導等溫擴增檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)的進行環(huán)介導等溫擴增反應，其反應參數(shù)為65°C溫育I小時，然后80°C滅活lOmin，最后10°C保存。
9.根據(jù)權利要求5所述的非診斷目的的施羅氏弧菌的環(huán)介導等溫擴增檢測方法，其特征在于，所述的陽性對照質(zhì)控品為含有施羅氏弧菌的toxR基因的質(zhì)粒DNA。
10.根據(jù)權利要求5所述的非診斷目的的施羅氏弧菌的環(huán)介導等溫擴增檢測方法，其特征在于，所述的陰性對照質(zhì)控品為不同于施羅氏弧菌的toxR基因的DNA序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種施羅氏弧菌的環(huán)介導等溫擴增檢測引物、檢測試劑盒和檢測方法。檢測引物為前外引物F35'-CAAACGGTTGGCGGTGTC-3'；后外引物B35'-CCGCAAGATGCTGAAGGATC-3'；前內(nèi)引物FIP5'-CTGCAAGAGCCAAACTCTGCGTCTTTTGGAGCTGGTGGGAT-3'；后內(nèi)引物BIP5'-GCTTCTGATGAAGCGACAGGCAGTAAAGACGGTGCCTAAGCG-3'。使施羅氏弧菌檢測技術達到國際先進水平，檢測能力大幅提高，施羅氏弧菌的環(huán)介導等溫擴增檢測方法的檢測限高于傳統(tǒng)檢測方法100~200倍；另一方面本發(fā)明的施羅氏弧菌的環(huán)介導等溫擴增檢測方法具有儀器設備要求簡單、檢測時間短(0.5~1.0小時)、特異性高(針對靶基因的8/6個區(qū)域設計6/4種特異引物)等特點，彌補了經(jīng)典PCR擴增技術對儀器設備要求高、技術較為復雜等諸多弊端，具有檢測能力強、檢測時間短、對儀器設備要求簡單的優(yōu)點，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N15/11GK102719551SQ201210240479
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月11日 優(yōu)先權日2012年7月11日
發(fā)明者任春華, 劉助紅, 胡超群, 陳償, 高磊 申請人:中國科學院南海海洋研究所