專利名稱：岱衢族大黃魚和閩-粵東族大黃魚的鑒別引物及其鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)物種鑒別領(lǐng)域，尤其是涉及一種岱衢族大黃魚和閩-粵東族大黃魚的鑒別引物及其鑒別方法。
背景技術(shù)：
大黃魚{Pseudosciaena crocea),又名黃魚、黃花魚，隸屬于S盧形目(Perciformes)、石首魚科(Sciaenidae)、黃魚屬(Pseudosciaena),是我國(guó)海洋捕撈主要經(jīng)濟(jì)魚類之一，是中國(guó)海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的魚類品種。我國(guó)沿海大黃魚可大致分為岱
衢族、閩-粵東族和硇洲族3個(gè)地理種群。因岱衢族大黃魚在體色、體型和風(fēng)味方面等方面的優(yōu)勢(shì)，在市場(chǎng)上價(jià)格要比閩-粵東族大黃魚高；岱衢族大黃魚體色略顯金黃色，閩-粵東族大黃魚體色較淡；在體型上，岱衢族大黃魚體型較瘦長(zhǎng)，閩-粵東族大黃魚則略胖；在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味方面，岱衢族大黃魚肌肉組織中氨基酸總量、人體必需氨基酸、鮮味氨基酸以及脂肪酸等反映肉質(zhì)風(fēng)味的主要營(yíng)養(yǎng)價(jià)值指標(biāo)都顯著高于閩-粵東族官井洋家系大黃魚。此外，岱衢族大黃魚在生長(zhǎng)速度、成活率、發(fā)病率和餌料系數(shù)等方面比閩-粵東族大黃魚占有明顯優(yōu)勢(shì)。在寧波、舟山地區(qū)養(yǎng)殖的大黃魚絕大部分為閩-粵東族大黃魚，其在外觀上與岱衢族大黃魚很相似，采用傳統(tǒng)的性狀觀察，主觀性強(qiáng)，也很難進(jìn)行有效的區(qū)分。因此，開發(fā)岱衢族大黃魚區(qū)別于閩-粵東族大黃魚的鑒別方法，對(duì)于種質(zhì)資源保護(hù)、良種選育和市場(chǎng)銷售等方面都顯得非常重要?，F(xiàn)有的中國(guó)專利名稱為不同種群大黃魚的鑒別引物和鑒別方法(申請(qǐng)?zhí)枮镃N200610135259. 2)公開了岱衢族、閩粵東族和硇洲族大黃魚的鑒別弓I物和鑒別方法，采用單引物RAPD-PCR擴(kuò)增圖譜就可區(qū)分岱衢族大黃魚和閩-粵東族大黃魚，然而，RAPD-PCR技術(shù)對(duì)DNA模板的質(zhì)量、擴(kuò)增的條件和體系都有很高的要求，RAPD技術(shù)自身存在體系不穩(wěn)定、重復(fù)性低的缺點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種穩(wěn)定性高、重復(fù)性好的岱衢族大黃魚和閩-粵東族大黃魚的鑒別引物及其鑒別方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種岱衢族大黃魚和閩-粵東族大黃魚的鑒別引物，引物序列為
JI 上游引物 5' -GGCATTTAGGCACAAGGAC-3'，
JI 下游引物 5' -GGGGGCACAACTCAGAGG-3'；
J2 上游引物 5' -CAGGCCCCACCATACTAGT-3'，
J2 下游引物 5' -GGGTGCCGGTTCCTGAC-3'。一種岱衢族大黃魚和閩-粵東族大黃魚的鑒別方法，具體步驟如下
(I)大黃魚總DNA提取及定量檢測(cè)(2)配制PCR擴(kuò)增體系
PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的配制如下各種成分及終濃度分別為緩沖液lOmM，dNTP O. 2mM,Mg2+ 2mM，各引物均為O. 2mM，Taq酶1U，大黃魚模板DNA 10_50ng，用雙蒸水補(bǔ)齊到25ul，所述的引物序列為
JI 上游引物 5' -GGCATTTAGGCACAAGGAC-3'，
Jl 下游引物 5' -GGGGGCACAACTCAGAGG-3'；
J2 上游引物 5' -CAGGCCCCACCATACTAGT-3'，
J2 下游引物 5' -GGGTGCCGGTTCCTGAC-3'；
(3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)· 在PCR儀上于95 V加熱2-5min，使模板DNA充分變性，然后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)，94 V30sec，53-58°C 40sec,72°C 35sec，進(jìn)行 27-30 個(gè)循環(huán)，最后，在 72°C保持 5min，4_16°C保存；
(4)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)
PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察、照相，根據(jù)電泳結(jié)果與提供的標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)比，若在圖譜中300-400bp區(qū)間和600-700bp區(qū)間均出現(xiàn)I條條帶，則判定該DNA樣品來自岱衢族大黃魚；若沒有條帶或者只有一個(gè)條帶，則判定該DNA樣品來自閩-粵東族大黃魚。弓丨物對(duì)Jl的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中大黃魚模板DNAIOng,引物對(duì)J2的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中大黃魚DNA 40ng，PCR反應(yīng)程序是95°C 3min，擴(kuò)增循環(huán)94°C 30sec,55. 8°C40sec，72°C 35sec共28個(gè)循環(huán)，72°C 5min，4°C保存?？墒箶U(kuò)增產(chǎn)物電泳圖條帶較亮。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取產(chǎn)物IOul用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。采用酚氯仿抽提法提取大黃魚DNA。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明岱衢族大黃魚和閩-粵東族大黃魚的鑒別引物及其鑒別方法，使用鑒別引物對(duì)Jl和J2進(jìn)行PCR反應(yīng)，電泳拍照后，如果樣品分型為D1-N2型(圖2)、D2-1型(圖3)或D2-2型(圖4)，則判定其為閩-粵東族大黃魚；如果樣品OTU分型為Dl-Nl (即圖1)，則判定該樣品為岱衢族大黃魚，上述鑒別方法具有穩(wěn)定性高、重復(fù)性好，鑒別速度快、假陽性率低等優(yōu)點(diǎn)。
圖I為Dl-Nl型大黃魚的PCR產(chǎn)物電泳圖譜；
圖2為D1-N2型大黃魚的PCR產(chǎn)物電泳圖譜；
圖3為D2-1型大黃魚的PCR產(chǎn)物電泳圖譜；
圖4為D2-2型大黃魚的PCR產(chǎn)物電泳圖譜。
具體實(shí)施例方式 以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。具體實(shí)施例一
本發(fā)明一種岱衢族大黃魚和閩-粵東族大黃魚的鑒別引物，引物序列如下
JI 上游引物 5' -GGCATTTAGGCACAAGGAC-3'，
Jl 下游引物 5' -GGGGGCACAACTCAGAGG-3'；
J2 上游引物 5' -CAGGCCCCACCATACTAGT-3'，J2-下游引物 5' -GGGTGCCGGTTCCTGAC-3'。發(fā)明的原理用大黃魚高變異區(qū)2對(duì)擴(kuò)增引物；B1上游引物5 '-AGACCTTCTAGGCTTTGCAATC -3'，BI 下游引物 5' - GGAGCTTTCTAGGGCTCATCT -3' ;B2 上游引物 5' -TTATTTTCTATTCTACACCCTGGC-3'，B2 下游引物 5' - AGAGGGAATACCCCGCTGT-3'對(duì)岱衢族大黃魚和閩-粵東族大黃魚高變異區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆測(cè)序后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用BI擴(kuò)增大黃魚線粒體的D-Ioop區(qū)域，對(duì)該序列中的2部分序列片段結(jié)合分析，共檢測(cè)出 2 個(gè) 0TU，分別為 Dl 型GGCATTTAGGCACAAGGTC 和 CTTCTGAGTTGTGCCCCC，D2 型GGCATTTAGGCACAAGGTT和TTTCTGAGTTGTGCCCCC ;在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，使用引物對(duì)B2擴(kuò)增大黃魚線粒體的ND4區(qū)域，對(duì)該序列中的2部分序列片段也結(jié)合分析，檢測(cè)出2個(gè)0TU，分別為 NI 型CAGGCCCCACCATACTAAT 和 GACAGGAACCGGCACCC，N2 型CAGGCCCCACCATACTAAC 和AACAGGAACCGGCACCC ;對(duì)上述的D-Ioop和ND4區(qū)域的OTU分型進(jìn)行結(jié)合分析，可分為3個(gè)類型D1-N1、D1-N2和D2。岱衢族大黃魚為Dl-Nl型；而閩-粵東族大黃魚中可以分為2個(gè)類型D1-N2型和D2型，D2型有2種圖譜再細(xì)分為D2-1和D2-2型。 引物3’末端的幾個(gè)堿基對(duì)PCR擴(kuò)增的效率至關(guān)重要。錯(cuò)配I個(gè)堿基，PCR擴(kuò)增效率會(huì)出現(xiàn)一定的下降，而錯(cuò)配2個(gè)堿基，PCR擴(kuò)增效率會(huì)出現(xiàn)大幅的下降。本發(fā)明在設(shè)計(jì)岱衢族大黃魚和閩-粵東族大黃魚鑒別引物時(shí)，在上述序列各片段3’末端倒數(shù)第2位堿基處引入一個(gè)錯(cuò)配。這樣使得引物Jl上游引物和Jl下游引物，分別與Dl型DNA樣本在3’末端倒數(shù)第2個(gè)堿基有I個(gè)錯(cuò)配，與D2型DNA樣本在3’最末端錯(cuò)配2個(gè)堿基；也使得引物J2上游引物和J2下游引物，分別與NI型DNA樣本在3’末端倒數(shù)第2個(gè)堿基有I個(gè)錯(cuò)配，與N2型DNA樣本在3’最末端錯(cuò)配2個(gè)堿基。如圖所示，使用鑒別引物Jl和J2進(jìn)行PCR反應(yīng)，電泳拍照后，如果樣品分型為D1-N2型(圖2)、D2-1型(圖3)或D2-2型(圖4)，則DNA樣品來自閩-粵東族大黃魚；如果樣品OTU分型為Dl-Nl (即圖I )，則該DNA樣品來自岱衢族大黃魚。具體實(shí)施例二
本發(fā)明一種岱衢族大黃魚和閩-粵東族大黃魚的鑒別方法，具體步驟如下
(1)大黃魚總DNA提取及定量檢測(cè)
(2)配制PCR擴(kuò)增體系
PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的配制如下各種成分及終濃度分別為緩沖液lOmM，dNTP O. 2mM,Mg2+ 2mM，各引物均O. 2mM，Taq酶1U，大黃魚模板DNA 10_50ng，用雙蒸水補(bǔ)齊到25ul，所述的引物序列為
JI 上游引物 5' -GGCATTTAGGCACAAGGAC-3'
Jl 下游引物 5' -GGGGGCACAACTCAGAGG-3'
J2 上游引物 5' -CAGGCCCCACCATACTAGT-3'
J2 下游引物 5' -GGGTGCCGGTTCCTGAC-3'
(3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)
在PCR儀上于95 V加熱2-5min，使模板DNA充分變性，然后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)，94 V30sec，53-58°C 40sec,72°C 35sec，進(jìn)行 27-30 個(gè)循環(huán)，最后，在 72°C保持 5min，4_16°C保存；
(4)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察、照相，根據(jù)電泳結(jié)果與提供的標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)比，若圖譜中300-400bp區(qū)間，600-700bp區(qū)間的條帶均出現(xiàn)，則該DNA樣品來自岱衢族大黃魚；若沒有條帶或者只有一個(gè)條帶，則該DNA樣品來自閩-粵東族大黃魚。具體實(shí)施例三
本發(fā)明一種岱衢族大黃魚和閩-粵東族大黃魚的鑒別方法，具體步驟如下
(1)采用酚氯仿抽提法提取大黃魚DNA及定量檢測(cè)
(2)配制PCR擴(kuò)增體系
PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的配制如下各種成分及終濃度分別為緩沖液lOmM，dNTP O. 2mM,Mg2+ 2mM，各引物均O. 2mM，Taq酶1U，引物對(duì)Jl的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中大黃魚模板DNA10ng，引物對(duì)J2的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中大黃魚DNA 40ng，用雙蒸水補(bǔ)齊到25ul，所述的引物序列為
JI 上游引物 5' -GGCATTTAGGCACAAGGAC-3'
Jl 下游引物 5' -GGGGGCACAACTCAGAGG-3'
J2 上游引物 5' -CAGGCCCCACCATACTAGT-3'
J2 下游引物 5' -GGGTGCCGGTTCCTGAC-3'
(3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)
PCR 反應(yīng)程序是95°C 3min,擴(kuò)增循環(huán) 94°C 30sec, 55. 8°C 40sec, 72°C 35sec 共 28個(gè)循環(huán)，72 °C 5min，4°C保存;
(4)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)
PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取產(chǎn)物10ul，用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察、照相，根據(jù)電泳結(jié)果與提供的標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)比，圖譜中300-400bp區(qū)間，600-700bp區(qū)間的條帶均出現(xiàn)，則該DNA樣品來自岱衢族大黃魚?？紤]到岱衢族大黃魚的鑒別方法的實(shí)用性和可操作性。摸索出一套簡(jiǎn)易的標(biāo)準(zhǔn)化操作步驟和條件至關(guān)重要。最為關(guān)鍵的是優(yōu)選Jl和J2的兩個(gè)PCR反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行的反應(yīng)程序以及退火溫度。Real-time PCR技術(shù)有能實(shí)時(shí)定量出PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物的優(yōu)點(diǎn)，因此本研究采用此項(xiàng)技術(shù)對(duì)各項(xiàng)條件進(jìn)行優(yōu)化。采用同樣的反應(yīng)體系進(jìn)行Real-time PCR發(fā)現(xiàn)，在退火溫度55. 8°C時(shí)，Jl比J2的Ct值大2，因此加大前者PCR反應(yīng)體系中的模板DNA量至40ng，讓兩對(duì)引物的PCR擴(kuò)增能大致同步進(jìn)行，而PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)設(shè)為28，使得此時(shí)D1、N1型大黃魚樣品PCR擴(kuò)增的條帶較亮，而D2、N2型PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物還未能被凝膠成像系統(tǒng)所檢測(cè)到。使用Real-time PCR對(duì)擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，使得PCR擴(kuò)增能有效區(qū)分開Dl與D2型、NI與N2型。對(duì)于不同退火溫度、引物對(duì)和模板DNA樣品的Ct值見表1，退火溫度優(yōu)選55.8°C。采用同樣的反應(yīng)體系進(jìn)行Real-time PCR發(fā)現(xiàn)，在退火溫度55. 8°C時(shí)，Jl比J2的Ct值大2，因此加大前者PCR反應(yīng)體系中的模板DNA量至40ng，讓兩對(duì)引物的PCR擴(kuò)增能大致同步進(jìn)行，而循環(huán)數(shù)則優(yōu)選28。因此摸索出PCR的條件，使得Dl型和NI型的條帶能夠擴(kuò)增到可以用凝膠成像系統(tǒng)拍照出來，而D2型和N2型則檢測(cè)不到條帶，然后根據(jù)凝膠成像系統(tǒng)的圖片來鑒別岱衢族大黃魚和閩-粵東族大黃魚。表I不同退火溫度、引物對(duì)和模板DNA樣品的Ct值
權(quán)利要求
1.一種岱衢族大黃魚和閩-粵東族大黃魚的鑒別引物，其特征在于引物序列為 JI 上游引物 5' -GGCATTTAGGCACAAGGAC-3'， Jl 下游引物 5' -GGGGGCACAACTCAGAGG-3'； J2 上游引物 5' -CAGGCCCCACCATACTAGT-3'， J2 下游引物 5' -GGGTGCCGGTTCCTGAC-3'。
2.一種岱衢族大黃魚和閩-粵東族大黃魚的鑒別方法，其特征在于步驟如下 (1)大黃魚總DNA提取及定量檢測(cè) (2)配制PCR擴(kuò)增體系 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的配制如下各種成分及終濃度分別為緩沖液lOmM，dNTP O. 2mM,Mg2+ 2mM，各引物均為O. 2mM，Taq酶1U，大黃魚模板DNA 10_50ng，用雙蒸水補(bǔ)齊到25ul，所述的引物序列為 JI 上游引物 5' -GGCATTTAGGCACAAGGAC-3'， Jl 下游引物 5' -GGGGGCACAACTCAGAGG-3'； J2 上游引物 5' -CAGGCCCCACCATACTAGT-3'， J2 下游引物 5' -GGGTGCCGGTTCCTGAC-3'； (3)PCR擴(kuò)增反應(yīng) 在PCR儀上于95 V加熱2-5min，使模板DNA充分變性，然后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)，94 V30sec，53-58°C 40sec,72°C 35sec，進(jìn)行 27-30 個(gè)循環(huán)，最后，在 72°C保持 5min，4_16°C保存； (4)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察、照相，根據(jù)電泳結(jié)果與提供的標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)比，若在圖譜中300-400bp區(qū)間和600-700bp區(qū)間均出現(xiàn)I條條帶，則判定該DNA樣品來自岱衢族大黃魚；若沒有條帶或者只有一個(gè)條帶，則判定該DNA樣品來自閩-粵東族大黃魚。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的岱衢族大黃魚和閩-粵東族大黃魚的鑒別方法，其特征在于引物對(duì)Jl的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中大黃魚模板DNA IOng，引物對(duì)J2的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中大黃魚 DNA 40ng，PCR 反應(yīng)程序是95°C 3min，擴(kuò)增循環(huán) 94°C 30sec,55. 8°C 40sec,72°C35sec 共 28 個(gè)循環(huán)，72°C 5min，4°C保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的岱衢族大黃魚和閩-粵東族大黃魚的鑒別方法，其特征在于PCR反應(yīng)結(jié)束后，取產(chǎn)物IOul用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的岱衢族大黃魚和閩-粵東族大黃魚的鑒別方法，其特征在于采用酚氯仿抽提法提取大黃魚DNA。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種岱衢族大黃魚和閩-粵東族大黃魚的鑒別引物及其鑒別方法，特點(diǎn)是引物序列為引物對(duì)J15-GGCATTTAGGCACAAGGAC-3，5-GGGGGCACAACTCAGAGG-3；引物對(duì)J25-CAGGCCCCACCATACTAGT-3，5-GGGTGCCGGTTCCTGAC-3，鑒別方法具體如下大黃魚總DNA提取及定量檢測(cè)的步驟；配制PCR擴(kuò)增體系及擴(kuò)增反應(yīng)的步驟；最后取產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若圖譜中300-400bp區(qū)間和600-700bp區(qū)間的條帶均出現(xiàn)，則該DNA樣品來自岱衢族大黃魚；否則來自閩-粵東族大黃魚，優(yōu)點(diǎn)具有穩(wěn)定性高、重復(fù)性好，鑒別速度快、假陽性率低等。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102776284SQ20121024044
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月12日
發(fā)明者嚴(yán)小軍, 沈錫權(quán), 王夢(mèng)林, 閆旭紅 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)