專利名稱：茶樹fps基因及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于茶樹基因工程領(lǐng)域；具體地說，本發(fā)明涉及茶樹法呢基焦磷酸合酶(famesyI diphosphate synthase, FPS)基因的分離和分析,還涉及利用調(diào)節(jié)該基因表達強度進行茶樹病害預防。
背景技術(shù)：
茶樹病害的發(fā)生和流行是茶樹和病菌相互作用的結(jié)果，常導致茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)下降，嚴重時還會引起樹勢衰退。 從病菌侵入到茶樹出現(xiàn)病害癥狀的過程，一般可分為侵入期、潛育期和發(fā)病期3個階段。侵入期是指從病菌接觸茶樹到與茶樹建立營養(yǎng)或寄生關(guān)系的階段；潛育期是指從病菌與茶樹建立寄生關(guān)系到出現(xiàn)明顯病害癥狀的過程；發(fā)病期是指染病茶樹在外部形態(tài)上反映出病理變化和病菌產(chǎn)生繁殖體的階段。侵入期是影響病害發(fā)生發(fā)展的重要階段，在該階段病菌在茶樹組織表面萌發(fā)、產(chǎn)生附著器，并通過氣孔或傷口入侵茶樹組織間隙，茶樹細胞對于病菌入侵產(chǎn)生一系列的應激反應，諸如誘導合成植保素抑制病菌附著和生長、通過多酚氧化酶產(chǎn)生鄰醌物質(zhì)毒殺病菌、形成胼胝質(zhì)阻擋病菌深入、產(chǎn)生它感物質(zhì)通知鄰近植株等，該階段病原菌和茶樹的互作決定了病菌能否侵染茶樹，或者說決定了茶樹抗病性強弱。茶樹病害發(fā)生和流行主要受到病菌種類、茶樹品種、生長狀況和發(fā)育階段、以及環(huán)境因子等諸多因素的影響，其中病菌和茶樹品種是主要的決定因子，環(huán)境則主要起誘發(fā)作用。茶樹病害通常在病菌致病性強、茶樹品種抗性差、環(huán)境條件適宜時，才會發(fā)生和流行。茶樹病害防控主要有三種途徑即通過選育抗性茶樹品種、農(nóng)藥控制病菌發(fā)生與蔓延、以及營造良好環(huán)境抑制病害發(fā)生。其中選育抗性品種是優(yōu)選途徑，但是該途徑因為機理不明確，致使困難重重；農(nóng)藥控制具有投入少、見效快特點，但容易造成產(chǎn)品和環(huán)境污染、以及誘發(fā)病菌抗藥性；通過農(nóng)藝措施控制環(huán)境因素具有環(huán)境友好的優(yōu)點，但見效慢。如何通過現(xiàn)代分子生物學手段，明確茶樹對病害的反應機制，提出相應的病害控制措施是目前乃至今后一段時間內(nèi)茶學領(lǐng)域的重要研究內(nèi)容之一。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種茶樹法呢基焦磷酸合酶(famesyldiphosphate synthase, FPS)的基因序列及其編碼的蛋白質(zhì),通過誘導該基因表達可提高茶樹抗病性。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種茶樹FPS基因，其具有SEQ ID No:l所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了上述FPS基因編碼的蛋白質(zhì),其具有SEQ ID NO 2所不的氣基酸序列。本發(fā)明還提供了上述FPS基因用途該基因表達與茶樹抗病應激有關(guān)，誘導高表達可提高茶樹抗病性。本發(fā)明還同時提供了一種提高茶樹抗病性的方法，包括用具有SEQ ID No 1所示的核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)化茶樹細胞，再將轉(zhuǎn)化后的茶樹細胞培育成植株。 本發(fā)明主要針對目前病害發(fā)生過程茶樹和病菌互作機理不明確等實際問題，通過對茶樹病害發(fā)生葉片和健康葉片差異基因篩選和克隆，以及基因表達活性與抗病性相關(guān)性研究，明確本發(fā)明基因表達活性上調(diào)與茶樹病害發(fā)生之間的關(guān)系。為通過調(diào)節(jié)該基因表達活性進行茶樹病害控制創(chuàng)造了條件，同時也為通過基因工程手段進行高抗病茶樹新材料的創(chuàng)制奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明是采用了以下技術(shù)方案來實現(xiàn)采用抑制性消減雜交(suppressionsubtractive hybridization, SSH)和RACE技術(shù)分離了與茶樹病害響應相關(guān)的FPS基因,其具有SEQ ID No :1所不的核昔酸序列；提供一種茶樹FPS全長的蛋白質(zhì)序列,其具有如SEQID No 2所示序列。本發(fā)明還提供了茶樹FPS基因表達特性，證明本發(fā)明提高FPS基因表達活性可以·提高茶樹抗病性。實現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下一、茶樹FPS基因分離和分析在茶樹品種園中采集同品種的病菌侵染葉片和相同成熟度的健康葉片，分別置于液氮中充分研磨后，以TRIZOL (Invitrogen公司)提取總RNA，并以UNIQ-10柱式mRNA抽提純化試劑盒(上海生工生物工程有限公司)處理，分別獲得病、健葉片的mRNA樣本。分別以病、健葉的 2Kg mRNA 為起始物，米用 PCR-Select cDNA Subtraction Kit (ClontechLaboratories, Inc)進行雙鏈cDNA合成、酶切、接頭連接、消減雜交和擴增，具體操作參照該試劑盒使用說明，獲得在病葉中上調(diào)表達的差異基因片段，插入TaKaRa pMD 18_TVector (寶生物工程(大連)有限公司)，并轉(zhuǎn)化JM109 (寶生物工程(大連)有限公司)感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)藍白斑篩選，挑取白斑擴增，以M13通用引物(序列如SEQ ID No: 3和SEQID No: 4所示)進行菌液PCR，將有插入片段的陽性克隆，委托上海英維捷基公司進行測序。經(jīng)與美國國家生物信息中心NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)提供的Blastn工具在線比對發(fā)現(xiàn)，其中有I條長244bp差異片段與杜仲(Eucommia ulmoides)和葡萄(Vitisvinifera)等植物FPS基因的中間序列高度同源。根據(jù)獲得的244bp的片段序列，設計了5’端RACE序列特異性引物SEQ ID No: 5和SEQ ID No:6 (預計產(chǎn)物長度約530bp)、以及3’端RACE序列特異性引物SEQ ID No:7和SEQ ID No:8 (預計產(chǎn)物長度為880bp)，以上述病菌為害葉片的 mRNA 為起始物，采用 TaKaRa 5’-Full RACE Core Set,TaKaRa 3’-FullRACE Core Set和TaKaRa Taq (寶生物工程(大連)有限公司)進行FPS 5’端和3’端序列克隆(具體操作參照試劑盒使用說明)，對獲得5’ RACE和3’ RACE產(chǎn)物進行I. 5%瓊脂糖凝膠電泳，以 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit (寶生物工程(大連)有限公司)對目標條帶進行割膠純化，將純化的目標條帶插入TaKaRa pMD 18_T Vector,并轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)藍白斑篩選，挑取白斑擴增，以M13通用引物(SEQ ID No: 3和SEQ ID No: 4)進行菌液PCR，將有插入片段的陽性克隆，委托上海英維捷基公司進行測序，獲得了 5’端524bp (與中間片段重疊區(qū)長118)的RACE產(chǎn)物和3’端870bp (與中間片段的重疊區(qū)長IOlbp)的RACE產(chǎn)物，經(jīng)與NCBI已知序列比對，上述序列與杜仲和甘草(Glycyrrhiza uralensis)等植物FPS基因的5’端和3’端高度同源。以DNAStar包中SeqMan軟件(DNASTAR，Inc.)對獲得茶樹FPS基因5’端、中間序列和3’端序列進行拼接，得到了茶樹FPS基因全長序列。該基因長1419bp，如SEQ ID No I所示(加下劃線的為對應SEQ ID No :2的序列，下劃線最后三個堿基為終止密碼子);具有1029bp(84th -1112th)的開放閱讀框，編碼342個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，如SEQ ID No. 2所示。經(jīng)與NCBI數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，茶樹FPS氨基酸序列與甘草(Glycyrrhiza uralensis)、人參(Panax ginseng)FPS有86%的一致性和93%的相似性。證明在病葉中高表達的差異序列為茶樹FPS基因。根據(jù)PredictProtein (http://www. predictprotein. org/)分析顯不，茶樹 FPS 定位于細胞質(zhì)中，具有多聚異戍烯基合酶(polyprenyl synthase)簽名序列[LIVMFY]Gx2[FYL]Q[LIVM]xDD[LIVMFY]x[DNG] (x為任意氨基酸殘基)，屬于法尼基焦磷酸(FPP) /櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸(GGPP)合酶家族。研究顯示，F(xiàn)PS是植物細胞質(zhì)異戊二烯代謝途徑中一個重要酶類，主要負責催化二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)與異戊烯基焦磷酸(IPP)首尾相接，生成含10碳的櫳牛兒基焦磷酸(GPP)，進而再與IPP經(jīng)首尾相接，合成含15碳的法尼烯基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP)。FPP不僅是許多重要代謝產(chǎn)物如留體、多職醇、泛醌等的合成前體；同時在倍半萜環(huán)化酶的作用下，生成包括植保素和揮發(fā)油成分在內(nèi)的倍半萜衍
生物，而植保素和揮發(fā)油成分在植物自身免疫和病蟲防御反應中起重要作用。此外，F(xiàn)PS催化過程中的中間體GPP等還能進入葉綠體(質(zhì)體)參與單萜、二萜、四萜化合物的合成。由此可見，“龍井43”茶樹病葉中FPS基因表達上調(diào)可能是機體對病原菌侵染所起的一種防御性應激反應之一，以使機體產(chǎn)生更多的抑菌性物質(zhì)限制病菌生長和進一步侵染。二、FPS基因表達強度與病害關(guān)聯(lián)分析根據(jù)上述獲得的茶樹FPS基因序列，采用DNAStar軟件包(DNAStar Inc.)中PrimerSelect設計表達引物，序列如SEQ ID No: 9和SEQ ID No: 10所示(預計產(chǎn)物長度406bp)，同時以茶樹肌動蛋白(Actin，ACT)基因(http:// www. ncbi. nlm. nih. rov/nuccore/FJ355923)為參比基因，設計用于ACT基因表達的引物，序列如SEQ ID No : 11和SEQ ID No 12所示(預計產(chǎn)物344bp)。在品種園中采集不同品種病害發(fā)生的葉片，同時采集相同品種同等成熟度的健康葉片為對照，分別提取這些品種的病、健葉總RNA，合成cDNA第一鏈，采用設計的引物對病、健樣品進行RT-PCR，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳和目的條帶光密度分析，并以FPS基因目的條帶光密度與參比ACT基因目的條帶光密度之比作為FPS基因的相對表達強度，結(jié)果顯示，不管不同品種罹患的是相同的病害還是不同的病害，這些品種病葉中FPS基因相對表達強度均顯著高于同品種的健康葉片。說明FPS基因表達上調(diào)是茶樹對于病菌入侵的一種普遍應激響應之一，兩者之間存在密切的因果關(guān)聯(lián)關(guān)系。進一步的，以茉莉酸甲酯(該化合物是已知的、重要的與損傷應激反應相關(guān)的植物激素或信號分子)處理茶樹葉片，模擬病菌侵染損傷信號，并采用上述RT-PCR技術(shù)分析茉莉酸甲酯對FPS基因表達的影響，結(jié)果顯示，茉莉酸甲酯處理后，茶樹葉片F(xiàn)PS基因相對表達強度顯著上調(diào)，同時后期病害調(diào)查顯示，經(jīng)茉莉酸甲酯處理的茶樹病害發(fā)生程度顯著下降。說明FPS基因表達可受病菌入侵等損傷信號誘導，通過外源信號誘導FPS基因高表達，可提高茶樹抗病性。在此基礎(chǔ)上，設計了用于克隆茶樹FPS基因整個開放閱讀框、并嵌入有NdeI和SacI酶切位點的引物對，其序列如SEQ ID No 13和SEQ ID No 14所示，提取茶樹葉片mRNA，并以RT-PCR方法獲得茶樹FPS基因開放閱讀框序列，將其插入TaKaRa pMD 18_TVector,并轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)大腸桿菌擴增，經(jīng)測序驗證后，以UNIQ-IO柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒(上海生工生物有限公司)提取含F(xiàn)PS基因開放閱讀框序列的重組pMD 18-T Vector,并將該質(zhì)粒命名為pMD 18-T-FPS。以組合酶NdeI和SacI (寶生物工程(大連)有限公司)對pMD 18-T-FPS質(zhì)粒進行雙酶切獲得FPS基因開放閱讀框，并插入同樣酶切的真核雙元表達載體TaKaRa pRI 201-AN DNA (寶生物工程(大連)有限公司)，轉(zhuǎn)化TGl感受態(tài)大腸桿菌擴增后，以UNIQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取重組有FPS基因開放閱讀框序列的雙元表達載體，并將其命名為pRI-201-AN-DNA-FPS。采用凍融交替法將pRI-201-AN-DNA-FPS導人野生發(fā)根農(nóng)桿菌15834。采用農(nóng)桿菌侵染法將CaMV35S強啟動子驅(qū)動下的外源FPS基因“浙農(nóng)25”無菌苗莖段。從產(chǎn)生的轉(zhuǎn)FPS基因發(fā)根誘導愈傷組織，將該愈傷組織命名為FPS轉(zhuǎn)基因愈傷。以類似的方法，以無外源FPS基因的野生發(fā)根農(nóng)桿菌15834侵染“浙農(nóng) 25”無菌苗莖段誘導產(chǎn)生的發(fā)根和愈傷組織，將該愈傷組織命名為對照愈傷。采用針刺方法將茶樹炭疽病菌(Gloeosporium theae-sinesis Miyake)接種于兩種愈傷塊上，于12h光照/12h黑暗、28°C條件下培養(yǎng)3-5d，觀察病斑大小。同時采用引物SEQ ID No 9和SEQ IDNo: 10 (FPS基因)和SEQ ID No:ll和SEQ ID No: 12對兩種愈傷接種病菌后的FPS基因相對表達強度進行分析。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)FPS基因愈傷塊病斑顯著小于對照愈傷塊上的病斑，而且轉(zhuǎn)FPS基因愈傷塊中FPS基因表達強度也顯著高于對照愈傷。顯然，轉(zhuǎn)FPS基因的愈傷中，在CaMV35S強啟動子的驅(qū)動下，大量表達外源轉(zhuǎn)入的FPS基因，并使愈傷塊的抗炭疽病能力顯著提高。由此可見，F(xiàn)PS基因上調(diào)是茶樹對病菌入侵的一種防御性反應之一，提高FPS基因表達水平可提高茶樹對病菌的抵御能力。
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖I是“龍井43”茶樹健康(左)和罹患炭疽病(右)的葉片對比圖；圖2是“浙農(nóng)25”茶樹健康(左)和罹患炭疽病(右)的葉片對比圖；圖3是“鳩坑”茶樹健康(左)和罹患云紋葉枯病(右)的葉片對比圖；圖4是茶樹病健葉片F(xiàn)PS基因表達情況對比圖；圖4中ACT為茶樹肌動蛋白參比基因，F(xiàn)PS為茶樹法呢烯焦磷酸合酶基因；1為“龍井43”病菌侵害葉、2為“龍井43”健康葉，3為“浙農(nóng)25”病菌侵害葉、4為“浙農(nóng)25”健康葉，5為“鳩坑”病菌侵害葉、6為“鳩坑”健康葉；圖5是“龍井43”茶樹噴施茉莉酸甲酯后FPS基因表達情況對比圖；圖5中ACT為茶樹肌動蛋白參比基因，F(xiàn)PS為茶樹法呢烯焦磷酸合酶基因；1為噴清水6h后葉片、2為噴茉莉酸甲酯6h后葉片，3為噴清水24h后葉片、4為噴茉莉酸甲酯24h后葉片。圖6是轉(zhuǎn)FPS基因茶樹愈傷與非轉(zhuǎn)FPS基因茶樹愈傷炭疽病斑比較圖；圖6中左邊為轉(zhuǎn)FPS基因茶樹愈傷，右邊為非轉(zhuǎn)FPS基因茶樹愈傷，箭頭所指為炭疽病斑。
具體實施例方式實施例I在茶樹品種園中采摘“龍井43”被炭疽病菌為害葉片和相同成熟度的健康葉片(圖I)，分別置于液氮中充分研磨后，以TRlZOUInvitrogen公司)提取總RNA，并以UNIQ-10柱式mRNA抽提純化試劑盒(上海生工生物工程有限公司)處理，分別獲得病、健葉片的mRNA樣本。分別以病、健葉的2Kg mRNA為起始物,米用PCR-Select cDNA Subtraction Kit(Clontech Laboratories, Inc)進行雙鏈cDNA合成、酶切、接頭連接、消減雜交和擴增，具體操作參照該試劑盒使用說明，獲得在“龍井43”病葉中上調(diào)表達的差異基因片段，插入TaKaRa pMD 18_T Vector (寶生物工程(大連)有限公司)，并轉(zhuǎn)化JM109 (寶生物工程(大連)有限公司)感受態(tài)大腸桿菌，具體實驗操作參照載體和工程菌使用說明。經(jīng)藍白斑篩選，挑取白斑，轉(zhuǎn)接于Iml液體LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)1 ;取菌液100 μ I于新離心管中，6000印111離心21^11，棄上清后，加2(^1重蒸去離子水(ddH20)稀釋，用做菌液PCR模板。以
M13通用引物(序列如SEQ ID No: 3和SEQ ID No: 4所示)進行菌液PCR，PCR溶液配制和程序設置如表I所示。表I
PCR反應液配置
2xEasv Taq PCR SuperMix (北京全式金生物技術(shù)
12.5 (μ )
有限公司)
Μ13通用引物(SEQ ID No: 3和SEQ IDNo: .4)上下游引物各0.5 (μ )
菌液0.5 (μ )
ddH2011.0 ( μ!)
總體積25.0 (μ )
PCR反應程序
94°C預變性 4min; 94°C變性 45s、55°C退火 lmin、72°C延伸 1.5min，30 個循環(huán)；72°C后 延伸10 min。SEQ ID No: 3 (Ml3 上游引物)5，-cgccagggttttcccagtcacgacSEQ ID No: 4 (M13 下游引物)5，-agcggataacaatttcacacagga將PCR產(chǎn)物進行I. 5%瓊脂糖凝膠電泳，將有插入片段的陽性克隆，委托上海英維捷基公司進行測序。經(jīng)與美國國家生物信息中心NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih.gov/)提供的Blastn工具在線比對發(fā)現(xiàn),其中有I條長244bp的差異片段與杜仲(Eucommiaulmoides)和葡萄(Vitis vinifera)等植物FPS基因的中間序列高度同源。根據(jù)獲得的244bp的片段序列，設計了 5’端RACE序列特異性引物SEQ ID No: 5和SEQ ID No:6 (預計產(chǎn)物長度約530bp)、以及3’端RACE序列特異性引物SEQ ID No:7和SEQ ID No:8 (預計產(chǎn)物長度為880bp)。SEQ ID No: 5 (FPS 5，RACE out) 5，-tcatctgtccacaagttgtctgSEQ ID No: 6 (FPS 5’ RACE in) 5’ -cagcagatccacataataaggSEQ ID No: 7 (FPS 3，RACE out) 5，-tgccaatgatggcgtaattctcSEQ ID No: 8 (FPS 3，RACE in) 5，-agacaacttgtggacagatgatag 。以上述病菌為害葉片的mRNA為起始物，采用TaKaRa 5’-Full RACE Core Set、TaKaRa 3’-Full RACE Core Set和TaKaRa Taq (寶生物工程(大連)有限公司)進行茶樹FPS基因5 ’端和3 ’端序列克隆(具體操作參照試劑盒使用說明)，對獲得的5 ’ RACE和3 ’ RACE產(chǎn)物進行 I. 5% 瓊脂糖凝膠電泳，以 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit
(寶生物工程(大連)有限公司)對目標條帶進行割膠純化，將純化的目標條帶插入TaKaRapMD 18-T Vector,并轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)大腸桿菌，具體操作參照純化試劑盒、載體和工程菌使用說明。經(jīng)藍白斑篩選，挑取白斑，轉(zhuǎn)接于LB細菌培養(yǎng)基中擴增，采用上述相同的方法以M13通用引物(SEQ ID No: 3和SEQ ID No: 4)進行菌液PCR，PCR反應溶液配置和程序設置如表I所示。將有插入片段的陽性克隆，委托上海英維捷基公司進行測序，獲得了5’端524bp (與中間片段重疊區(qū)長118bp)的RACE產(chǎn)物和3’端870bp (與中間片段的重疊區(qū)長IOlbp)的RACE產(chǎn)物,經(jīng)與NCBI已知序列比對,上述序列與杜仲和甘草(Glycyrrhizauralensis)等植物FPS基因的5’端和3’端高度同源。以DNAStar包中SeqMan軟件(DNASTAR, Inc.)對獲得茶樹FPS基因5’端、中間序列和3’端序列進行拼接，得到了茶樹FPS基因全長序列。該基因長1419bp，如SEQ ID No :I所示，具有1029bp (84th -1112th)的開放閱讀框，編碼342個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，如SEQ ID No. 2所示。經(jīng)與NCBI數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，茶樹FPS氨基酸序列與甘草(Glycyrrhiza uralensis)、人參(Panax ginseng)FPS有86%的一致性和93%的相似性。證明在病葉中高表達的差異序列為茶樹FPS基因。根據(jù) PredictProtein (http://www. predictprotein. org/)分析顯不，茶樹 FPS 定位于細胞質(zhì)中，具有多聚異戍烯基合酶(polyprenyl synthase)簽名序列[LIVMFY]Gx2[FYL]Q[LIVM]xDD[LIVMFY]x[DNG] (x為任意氨基酸殘基)，屬于法尼基焦磷酸(FPP) /櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸(GGPP)合酶家族。研究顯示，F(xiàn)PS是植物細胞質(zhì)異戊二烯代謝途徑中一個關(guān)鍵酶，主要負責催化二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)與異戊烯基焦磷酸(IPP)首尾相接，生成含10碳的櫳牛兒基焦磷酸(GPP)，進而再與IPP經(jīng)首尾相接，合成含15碳的法尼烯基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP)。FPP不僅是許多重要代謝產(chǎn)物如留體、多職醇、泛醌等的合成前體，同時在倍半萜環(huán)化酶的作用下，生成包括植保素和揮發(fā)油成分在內(nèi)的倍半萜衍生物，而植保素和揮發(fā)油成分在植物自身免疫和病蟲防御反應中起重要作用。此外FPS催化過程中的中間體GPP等還能進入葉綠體(質(zhì)體)參與單萜、二萜、四萜化合物的合成。由此可見，“龍井43”茶樹病葉中FPS基因表達上調(diào)可能是機體對病原菌侵染所起的一種防御性應激反應之一，以使機體產(chǎn)生更多的抑菌性物質(zhì)限制病菌生長和進一步侵染。實施例2根據(jù)上述獲得的茶樹FPS基因序列，采用DNAStar軟件包(DNAStar Inc.)中PrimerSelect設計表達引物，序列如SEQ ID No: 9和SEQ ID No : 10所示(預計產(chǎn)物長度 406bp),同時以茶樹肌動蛋白(Actin, ACT)基因(http://www. ncbi. nlm. nih. rov/nuccore/FJ355923)為參比基因，設計用于ACT基因表達的引物，序列如SEQ ID No. 11和SEQ ID No. 12所示(預計產(chǎn)物344bp)。在品種園中米集摧患炭痕病的“龍井43”(圖I)和“浙農(nóng)25”(圖2)、以及摧患z 紋葉枯病的“鳩坑”(圖3)等品種的病害葉，同時采集相同品種同等成熟度的健康葉片為對照，各取約lOOmg，以TRIZOL試劑(Invitrogen公司)提取葉片總RNA，以電泳法檢測RNA質(zhì)量，并將各樣本RNA濃度調(diào)節(jié)至500 μ g/ml，以MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒(上海生工生物工程有限公司)合成cDNA第一鏈，具體操作參照試劑盒使用說明。以上述cDNA第一鏈為模板，分別以 SEQ ID No 9 和 SEQ ID No 10 (FPS 基因表達)和 SEQ ID No 11 和 SEQ IDNo 12 (ACT基因表達)為引物對，進行PCR，PCR反應液配制和程序控制見表2。表權(quán)利要求
1.茶樹FPS基因，其特征是具有SEQID No : I所示的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求I所述的茶樹FPS基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征是具有SEQID NO 2所示的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求I所述的茶樹FPS基因的用途，其特征是該基因表達與茶樹抗病應激有關(guān)，誘導聞表達能提聞茶樹抗病性。
4.一種提高茶樹抗病性的方法，其特征是包括用具有SEQ ID No :1所示的核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)化茶樹細胞，再將轉(zhuǎn)化后的茶樹細胞培育成植株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種茶樹FPS基因，其具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還同時公開了上述茶樹FPS基因編碼的蛋白質(zhì)，其具有SEQ ID NO2 所示的氨基酸序列。 本發(fā)明還同時公開了上述茶樹FPS基因的用途該基因表達與茶樹抗病應激有關(guān)，誘導高表達能提高茶樹抗病性。
文檔編號C12N9/10GK102876689SQ20121023977
公開日2013年1月16日 申請日期2012年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月11日
發(fā)明者陸建良, 范方媛, 徐燕, 梁月榮, 鄭新強, 李娜娜 申請人:浙江大學