實驗動物長爪沙鼠遺傳質(zhì)量檢測方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明以群體遺傳學(xué)理論為依據(jù)，通過種間轉(zhuǎn)移擴(kuò)增法從小鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)中篩選出長爪沙鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)，然后經(jīng)過分級篩選、優(yōu)化組合，最終優(yōu)選出了適于長爪沙鼠遺傳檢測的微衛(wèi)星位點(diǎn)，建立了適用于長爪沙鼠遺傳檢測的方法。本發(fā)明還采用篩選出的微衛(wèi)星位點(diǎn)對國內(nèi)的長爪沙鼠群體進(jìn)行了群體內(nèi)遺傳變異和群體間遺傳差異分析。
【專利說明】實驗動物長爪沙鼠遺傳質(zhì)量檢測方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及實驗動物遺傳質(zhì)量檢測方法及其應(yīng)用，具體為實驗動物長爪沙鼠遺傳質(zhì)量檢測方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]長爪沙鼠(Meriones unguiculatus)屬于卩齒齒目、沙鼠屬(Gerbillus)動物，又名黃耗子、砂耗子、長爪沙土鼠、蒙古沙鼠(Mongolian gerbil)等，是源自我國的實驗用動物。由于長爪沙鼠許多特殊的生物學(xué)特性，在許多方面可作為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的動物模型，并極具發(fā)展?jié)摿Γ哂兄匾_發(fā)價值，是當(dāng)今實驗動物科學(xué)發(fā)展最為迅速的領(lǐng)域之一。目前長爪沙鼠已在腦缺血、腦神經(jīng)、寄生蟲病、微生物、生殖、內(nèi)分泌、營養(yǎng)、代謝及藥理、腫瘤等研究中廣泛應(yīng)用。
[0003]在我國，長爪沙鼠的實驗動物化始于1978年和1985年，由浙江省實驗動物中心和首都醫(yī)科大學(xué)分別從野外捕獲沙鼠進(jìn)行馴化研究，成功的培育了兩個封閉群群體，并對其生物學(xué)特性、染色體組型等進(jìn)行了研究，在長爪沙鼠實驗動物化研究方面奠定了較好的基礎(chǔ)。目前我國有四個較大的長爪沙鼠封閉群，分別分布在北京(首都醫(yī)科大學(xué))、杭州(浙江省實驗動物中心)、大連(大連醫(yī)科大學(xué))和廣州(廣州醫(yī)學(xué)院)，這些生產(chǎn)單位的長爪沙鼠在國內(nèi)得到廣泛應(yīng)用。在群體遺傳學(xué)方面，杜小燕等[1]從小鼠的微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增沙鼠基因組DNA獲得長爪沙鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)，并對首都醫(yī)科大學(xué)長爪沙鼠群體、野生長爪沙鼠群體和浙江長爪沙鼠群體進(jìn)行了群體遺傳結(jié)構(gòu)對比分析，表明首都醫(yī)科大學(xué)群體變異程度比以前要高，雖然低于兩個野生群體，但差異不是很大。丁賢明等[2]用17個微衛(wèi)星DNA標(biāo)記對Z:ZCLA長爪沙鼠封閉群、野生群和近交系進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明Z:ZCLA封閉群和野生群都表現(xiàn)為中度多態(tài)，Z:ZCLA封閉群較野生群稍低；3個長爪沙鼠近交系品系基本符合近交系的要求，微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)適用于近交系長爪沙鼠的遺傳檢測。劉月環(huán)等M用已知的9個微衛(wèi)星對浙江省沙鼠群 體進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明該群體處于不平衡狀態(tài)。孫賀娟等[4]用篩選的28個生化基因位點(diǎn)對浙江省實驗動物中心群體和首都醫(yī)科大學(xué)群體進(jìn)行了群體遺傳結(jié)構(gòu)對比分析，表明兩群體內(nèi)均未出現(xiàn)明顯的遺傳分化現(xiàn)象，但群體均偏離了哈迪-溫伯格平衡；而兩群體間并未出現(xiàn)明顯的遺傳分化。國外有關(guān)長爪沙鼠的群體遺傳方面的研究報道也比較少，Neumann K等[5]通過用克隆方法找到的9個微衛(wèi)星位點(diǎn)對野生長爪沙鼠和人工飼養(yǎng)的長爪沙鼠進(jìn)行了多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)人工飼養(yǎng)群體的遺傳多態(tài)性較低。Yoshda等[6]比較了長爪沙鼠與人及大鼠編碼肝、胰及血白蛋白cDNA序列的差異。Shimizu等m通過乳酸脫氫酶和堿性磷酸酶的電泳分析表明在毛色表型之間無遺傳多態(tài)性。Okumura等M用23個蛋白酶位點(diǎn)研究了日本培育及保種的4個品系(MGS/Sea、Mon/JmsGbs、KML和Hos)的生化基因位點(diǎn)及遺傳變異性，結(jié)果除在肝酸性磷酸酶(Acp2)位點(diǎn)有多態(tài)性外，其它位點(diǎn)均未見多態(tài)性，表明在日本實驗長爪沙鼠的群體內(nèi)和群體間缺乏遺傳多樣性。
[0004]長期以來，人們一直注重研究長爪沙鼠的保種、生物學(xué)特性、遺傳結(jié)構(gòu)和開發(fā)應(yīng)用，而對長爪沙鼠的標(biāo)準(zhǔn)化，尤其是遺傳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究不夠。目前國家尚沒出臺長爪沙鼠遺傳質(zhì)量的國家標(biāo)準(zhǔn)，各地方也沒有成熟的長爪沙鼠遺傳質(zhì)量地方標(biāo)準(zhǔn)。因此，研究建立長爪沙鼠遺傳質(zhì)量檢測方法和遺傳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)就顯得尤為迫切。
[0005]長爪沙鼠的遺傳質(zhì)量對醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究結(jié)果的準(zhǔn)確性、重復(fù)性及科學(xué)性有重要影響，而遺傳質(zhì)量監(jiān)測是評價和保證實驗用長爪沙鼠質(zhì)量不可或缺的措施。因此，在長爪沙鼠實驗動物化過程中遺傳檢測是極其重要的。遺傳檢測的目的是為了證實各品種品系應(yīng)具有的遺傳特性，以及是否發(fā)生遺傳突變和遺傳污染等，以確保被監(jiān)測的樣品符合該品種品系的要求。由于品系特性易受許多因素的影響而發(fā)生變化，并可直接影響試驗結(jié)果的可靠性，使用遺傳污染的動物所進(jìn)行的實驗，往往導(dǎo)致錯誤的結(jié)論，因此對我國的長爪沙鼠群體進(jìn)行遺傳檢測具有重要意義。遺傳檢測的方法較多，有生物化學(xué)標(biāo)記基因檢測法、免疫學(xué)性狀標(biāo)記基因檢測法、DNA多態(tài)性法等。其中微衛(wèi)星DNA檢測法是DNA多態(tài)性法的一種，由于具有很多的優(yōu)點(diǎn)，是近幾年來發(fā)展較快的一種檢測方法。
[0006]微衛(wèi)星(Microsatellite)，又稱簡單序列重復(fù)(Simplesequence repeats，SSR)，是指以少數(shù)幾個核苷酸(一般為2~6個)為重復(fù)單位組成的簡單多次串聯(lián)重復(fù)序列[9]。在真核生物中大約每隔10-50kb就存在I個微衛(wèi)星_，且它們廣泛存在于染色體幾乎所有區(qū)域[11]。微衛(wèi)星標(biāo)記按其核心單位的堿基數(shù)可分為單、2、3、4、5、6核苷酸微衛(wèi)星。人和動物的微衛(wèi)星重復(fù)單位較為常見的是(TG)n和(CT)n[12];按微衛(wèi)星自身結(jié)構(gòu)，Webertl3]將微衛(wèi)星分為完全、不完全和復(fù)合微衛(wèi)星:完全型微衛(wèi)星是由不中斷的重復(fù)單位串聯(lián)而成；不完全微衛(wèi)星是指重復(fù)單位間有3個以下的非重復(fù)堿基間隔，且兩間隔間重復(fù)單位連續(xù)重復(fù)數(shù)不低于3 ;復(fù)合微衛(wèi)星是指由幾類串聯(lián)重復(fù)單位構(gòu)成，中間有3個以下堿基間隔，且重復(fù)單位連續(xù)重復(fù)數(shù)不低于5。微衛(wèi)星標(biāo)記由核心序列和兩側(cè)保守的側(cè)翼序列構(gòu)成，保守的側(cè)翼序列使微衛(wèi)星特異地定位于染色體某一區(qū)域，核心序列重復(fù)數(shù)的差異則形成微衛(wèi)星的高度多態(tài)性。利用微衛(wèi)星DNA側(cè)翼序列設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由于重復(fù)次數(shù)的不同形成片段長度不同，經(jīng)電泳分離，成像表現(xiàn)出不同的電泳帶型。
[0007]微衛(wèi)星DNA具有豐富的多態(tài)性、遺傳連鎖不平衡現(xiàn)象、數(shù)量多分布均勻、易檢測、重復(fù)性好、省時，適于自動化分析和在相關(guān)物種之間具有保守性等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的研究中。主要表現(xiàn)在以下幾個方面:(I)構(gòu)建基因圖譜微衛(wèi)星是一種共顯性標(biāo)記，其遺傳分析過程相對簡化，不僅利于作圖群體間標(biāo)記轉(zhuǎn)換[14]，而且也便于從遺傳圖譜向物理圖譜過渡[15]。(2)制作DNA指紋圖，微衛(wèi)星最早應(yīng)用之一就是制作DNA指紋圖來進(jìn)行個體、品種(系)鑒定。(3)定位功能基因和數(shù)量性狀基因座(QTL)利用微衛(wèi)星與某些功能基因或QTL間的連鎖關(guān)系，可將一些功能基因或QTL定位在染色體上或連鎖群中，這方面的研究在家畜(禽)中已有一些利用。(4)進(jìn)行血緣鑒定和血緣控制，在育種中，系譜記錄是十分重要的，最早用于血型和血液蛋白多態(tài)性分析，但因多態(tài)性不夠豐富而讓位于DNA指紋技術(shù)。(5)用于群體遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)及起源的研究，Nei等_(1994)認(rèn)為，用微衛(wèi)星估計親緣關(guān)系較近的群體間的遺傳距離、繪制系統(tǒng)發(fā)育樹時，比其它的遺傳標(biāo)記技術(shù)更精確和聞效。
[0008] 鑒于上述微衛(wèi)星標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，以及國內(nèi)外鮮于報道的有關(guān)長爪沙鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)，在GenBank和EMBL等國際知名的大型生物學(xué)數(shù)據(jù)庫中目前還查不到長爪沙鼠的基因組相關(guān)的序列，能查到的微衛(wèi)星位點(diǎn)僅有9個，且該9個位點(diǎn)在人工飼養(yǎng)群體中的多態(tài)性較差，因此目前長爪沙鼠可用的微衛(wèi)星位點(diǎn)相當(dāng)有限。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]本發(fā)明的目的是建立長爪沙鼠遺傳質(zhì)量檢測方法，進(jìn)而有助于長爪沙鼠遺傳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立，從而規(guī)范長爪沙鼠的生產(chǎn)和應(yīng)用。對長爪沙鼠的群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行全面、客觀、公正的評價，查清長爪沙鼠的遺傳概貌、特點(diǎn)，為實現(xiàn)我國長爪沙鼠的實驗動物化和資源保存，為提出長爪沙鼠質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)及相應(yīng)技術(shù)規(guī)范奠定基礎(chǔ)。遺傳質(zhì)量檢測技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)建立，也將進(jìn)一步豐富和完善我國實驗動物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，為我國制定動物源性生物技術(shù)藥物的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)規(guī)范提供支撐。
[0010]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明以群體遺傳學(xué)理論為依據(jù)，在匯集國內(nèi)外文獻(xiàn)資料的基礎(chǔ)上，通過對長爪沙鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行篩選、組合與優(yōu)化，建立了適用于封閉群長爪沙鼠遺傳檢測的方法，并運(yùn)用篩選出的微衛(wèi)星位點(diǎn)組合對國內(nèi)幾個長爪沙鼠群體進(jìn)行遺傳多樣性分析。
[0011]—方面,本發(fā)明參考相關(guān)文獻(xiàn)從GenBank中共挑選出536個小鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)，進(jìn)行引物合成。首先摸索并進(jìn)一步優(yōu)化這些位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增條件；536個微衛(wèi)星位點(diǎn)中經(jīng)過條件優(yōu)化后，獲得313個擴(kuò)增條帶清晰明亮、少或無雜帶的位點(diǎn)，將這些位點(diǎn)克隆測序后獲得129個長爪沙鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)，以及微衛(wèi)星位點(diǎn)大小。在多態(tài)性篩選方面，本實驗選用1.5%的瓊脂糖電泳篩選初步確定等位基因數(shù)目。匯集本實驗室篩選的129個長爪沙鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)和已經(jīng)報道的7個長爪沙鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)，共計136個微衛(wèi)星位點(diǎn)(DXMU39、DXMitl7、D19Mit21、D19Mitll、D19Mit9、D19Mit2、D19Mitl、D18Mit45、D18Mit49、D17Mitl3、D17Mit38、D17Mit42、D16Mit26、D16Mit7、D15Mit34、D15Mitl7、D14Mit6、D14Mit92、DllMit4、DllMit35、DllMit36、DllMit42、DllMitl28、DllMit263、D10Mit66、DlOMit86、D9Mit70、D9Mit55、D9Mit47、D9Mit6、D8Mitl84、D8Mit56、D8Mit35、D8Mit24、D7Mit26、D7Mit33、D7Mit46、D7Mit71、D7Mit227、D7Mit333、D7Ndsl、D6Mit5、D6Mit37、D6Mit52、D6Mit85、D6Mitl39、D5Mit9、D5Mit25、D5Mit34、D4Mitl、D4Mit5、D4Mit7、D3Mit258、D3Mitl30、D3Mit221、D3Mitll7、D3Mitl7、D2Mit76、D2Mit231、D2Mit425、D2Mit525、DlMit428、DlMit432、DlMitll9、DlMit65、D16Mitl70、D12Mitl35、D9Mit323、D9Mit253、D15Mit9、D16Mitl00、D17Mit27、D17Mitl94、DllMit242、D10Mit266、D8Mit46、D7Mitl45、D6Mit339、D4Mit54、D5Mit31、D13M8、D12Mit201、DllMitl63、D17Mitl23、D2Mit22、D2Mitl、D3Mit56、D3Mitl56、D4Mitl23、D6Mit9、D9Mitl20、D10Mit223、DllMitl20、DllMit65、D13Mit246、D14Mitl6、D15Mitl23、D15Mitl24、D17Mit36、DlMitll2、D2Mitl6.1、D3MitlO、D3Mit215、D5Mit367、D6Mit23、D7Mit39、D7Mit76、D8Mit83、D10Mit20、DllMit5、D8Mitl70、DlMit362、D3Mit268、D6Mitl02、D7Mitl90、D8Mitl70、D13Mitl、D13Mit3、D13Mitl71、D16Mitl21、D13Mit216、D15Mit267、D16Mitl08、D16Mitl32、D17Mitl43、D17Mitl94、D17Mit226、D6Mitl02 和 D10Mit90 ;AF200942、AF200943、AF200944、AF200946、AF200945、AF200941和AF200947)。根據(jù)位點(diǎn)的等位基因數(shù)、多態(tài)性和分布情況，從136個位點(diǎn)中選擇出多態(tài)性大于 3 的 39 個位點(diǎn)(AF200942、AF200943、AF200944、AF200946、AF200945、AF200941、AF200947、D 16Mit7、D 16Mit26、DlMit362、D8Mitl84、D7Mit33、D6Mit37、D5Mit31、D12Mit201、D2Mit22、D15Mitl24、DllMit36、D7Mit71、D2Mit76、D3Mitl30 、D19Mitl、DllMit35、D17Mit38、DXMitl7、D8Mit56、D10Mit66、D13Mitl、D3Mitl7、D15Mitl7、DllMit42、D17Mitl3、D19Mit9、DllMit4、D4Mit5、D3Mit56、D15Mit267、D6Mit9、D7Mit39)。這些位點(diǎn)均勻分布在染色體上，等位基因數(shù)平均3.7個。本發(fā)明篩選出的微衛(wèi)星位點(diǎn)信息含量高，分布廣泛，呈高度多態(tài)性，適合封閉群長爪沙鼠遺傳檢測。
[0012]另一方面，本發(fā)明利用篩選出的39個微衛(wèi)星位點(diǎn)分析已知的封閉群長爪沙鼠群體-浙江封閉群長爪沙鼠群體(ZF)、首都醫(yī)科大學(xué)長爪沙鼠群體(CMU)和西北野生長爪沙鼠群體(NW)，利用短串聯(lián)重復(fù)(STR)掃描技術(shù)得到該3個群體在39個微衛(wèi)星位點(diǎn)上的基因型，錄入數(shù)據(jù)，運(yùn)用Popgene3.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。利用觀察等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、香隆指數(shù)、觀察雜合度、有效雜合度等指標(biāo)分析該群體的群體內(nèi)遺傳變異，分析時使用的位點(diǎn)數(shù)依次減少，最后找出能夠反映該長爪沙鼠群體遺傳結(jié)構(gòu)的最少使用位點(diǎn)數(shù)量。結(jié)果顯示:運(yùn)用28個微衛(wèi)星位點(diǎn)對各群體的分析結(jié)果與39個微衛(wèi)星位點(diǎn)的分析結(jié)果沒有顯著性差異P > 0.05，據(jù)此確定對封閉群做遺傳檢測所需要的最少微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)目是 28 個(AF200942、AF200943、AF200944、AF200946、AF200945、AF200941、AF200947、D16Mit7、D16Mit26、DlMit362、D8Mitl84、D7Mit33、D6Mit37、D5Mit31、D12Mit201、D2Mit22、D15Mitl24、DllMit36、D7Mit71、D2Mit76、D3Mitl30、D19Mitl、DllMit35、D17Mit38、DXMitl7、D8Mit56、D10Mit66、D13Mitl)。
[0013]第三方面，本發(fā)明采用篩選出的28個微衛(wèi)星位點(diǎn)分析國內(nèi)首都醫(yī)科大學(xué)長爪沙鼠群體(CMU)、西北野生長爪沙鼠群體(NW)、浙江封閉群長爪沙鼠群體(ZF)、大連醫(yī)科大學(xué)長爪沙鼠群體(DL)和廣州醫(yī)學(xué)院長爪沙鼠群體(GZ)，利用STR掃描技術(shù)得到該5個群體在28個微衛(wèi)星位點(diǎn)上的基因型，錄入數(shù)據(jù)，運(yùn)用Popgene3.2軟件，分別進(jìn)行了群體內(nèi)遺傳變異和群體間遺傳差異分析。群體內(nèi)遺傳變異選用平均觀察等位基因數(shù)、平均有效雜合度、平均觀察雜合度、香隆指數(shù)4個分析指標(biāo)。群體間遺傳差異采用奈氏標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離(Nei’sstandard genetic distance, DS)、群體間遺傳分化系數(shù)Rst、分子方差分析(Analysisof Molecular Variance，AMQVA)。結(jié)果顯示五個群體的平均有效雜合度分別是0.6239、
0.6671,0.4185,0.4592,0.3972，表明首醫(yī)長爪沙鼠群體、西北野生長爪沙鼠群體兩個群體均具有較高的群內(nèi)遺傳變異，而浙江封閉群長爪沙鼠群體、大連醫(yī)科大學(xué)長爪沙鼠群體和廣州醫(yī)學(xué)院長爪沙鼠群體三個群體的群內(nèi)變異較低，五個群體的變異程度為廣州醫(yī)學(xué)院長爪沙鼠群體<浙江封閉群長爪沙鼠群體<大連醫(yī)科大學(xué)長爪沙鼠群體<首醫(yī)長爪沙鼠群體<西北野生長爪沙鼠群體。根據(jù)群體間遺傳分化系數(shù)Rst和奈氏標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離得到的親緣關(guān)系鄰接樹可以看出廣州醫(yī)學(xué)院長爪沙鼠群體與其它群體的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為長爪沙鼠基因組DNA0.8%瓊脂糖電泳圖， 1-10:為動物編號。
[0015]圖2為位點(diǎn)D11MU4測序結(jié)果圖。
[0016]圖3為12只長爪沙鼠在AF200941座位瓊脂糖凝膠電泳圖，M為50bp Marker, 1-12為動物編號。
[0017]圖4為純合子波形，主波大小172bp。
[0018]圖5為雜合子波形，第一個主波大小171bp，第二個主波大小183bp。
[0019]圖6為浙江封閉群長爪沙鼠基因組DNA0.8%瓊脂糖電泳圖。[0020]圖7為AF200941位點(diǎn)在西北野生長爪沙鼠群體的擴(kuò)增條帶圖片，M為50bpMarker, 1-20為動物編號。
[0021]圖8為AF200941位點(diǎn)在西北野生長爪沙鼠群體STR掃描結(jié)果帶圖片。
[0022]圖9為浙江封閉群長爪沙鼠基因組DNA0.8%瓊脂糖電泳圖。
[0023]圖10為D2MU22位點(diǎn)擴(kuò)增條帶圖片，M為50bp Marker, 1-10為動物編號。
[0024]圖11為D17MU38位點(diǎn)擴(kuò)增條帶圖片，M為50bp Marker, 1-12為動物編號。
[0025]圖12為D7MU71位點(diǎn)擴(kuò)增條帶圖片，M為50bp Marker, 1-12為動物編號。
[0026]圖13為D2MU22位點(diǎn)STR掃描結(jié)果帶圖片。
[0027]圖14為D17MU38位點(diǎn)STR掃描結(jié)果帶圖片。
[0028]圖15為D7MU71位點(diǎn)STR掃描結(jié)果帶圖片。
[0029]圖16為基于奈氏標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離Ds的五個品系長爪沙鼠的鄰接樹，Popl:CMU,pop2:NW, pop3:ZF, pop4:DL, pop5:GZ。
【具體實施方式】
[0030]實施例1
[0031]1.1 方法
[0032]長爪沙鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)篩選實驗采用首醫(yī)長爪沙鼠群體和浙江長爪沙鼠群體，首醫(yī)長爪沙鼠群體16只、浙江長爪沙鼠群體64只；采取腎組織，放入小無菌塑料袋中，_20°C冰凍保存?zhèn)溆谩?br>
[0033]1.1.1長爪沙鼠基因組DNA提取與檢測
[0034](I)取長爪沙鼠腎組織約0.1g于勻漿器中，加入1.7ml EDTA-Na2 (pH = 8.0) (NaCl2.19g，EDTA-Na24.47g，用IOM NaOH調(diào)至pH = 8.0，加蒸餾水至500ml)溶液，勻漿磨碎。將勻漿好的組織液加入10% SDS 100 μ I至終濃度為0.5%，再加入20mg/ml蛋白酶KlO μ 1，充分混勻后，置于37°C水浴過夜。
[0035](2)加入等體積(2ml)的Tris-飽和酚，充分混勻后(避免劇烈振蕩)以12000r/min離心lOmin，含DNA的水相位于上層，含雜質(zhì)的有機(jī)相位于下層。吸取上清液于另一個
試管中，重復(fù)2~3次。
[0036](3)向上清液中加入等體積的飽和酹/氯仿(2ml)充分混勻，12000r/min離心IOmin0吸取上清液于另一個試管中，加入等體積的氯仿(2ml)充分混勻，12000r/min離心IOmin0
[0037](4)吸取上清液于另一個試管中，加入飽和NaCl 200 μ I混勻,然后加入3~5ml冷的無水乙醇，混勻，可見絮狀沉淀物出現(xiàn)。稍加離心，可見DNA沉淀團(tuán)，吸出無水乙醇，加入Iml 75%乙醇洗滌兩次，吸出乙醇，空氣中干燥DNA樣品。
[0038](5)視沉淀塊大小加入 100 μ I ~200 μ I TE 緩沖液(0.5Μ Tris, 2ml, 0.5M EDTA，
0.2ml，加蒸餾水至100ml)，充分溶解DNA。核酸蛋白分析儀測樣品濃度、OD260, OD280以及兩者比值。DNA樣品-20 0C保存?zhèn)溆谩?br>
[0039]1.1.2微衛(wèi)星引物的選擇
[0040]實驗選用536個小鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)，以及GenBank中Neumann k等[5]于2001年報道的長爪沙鼠的9個微衛(wèi)星位點(diǎn)，引物序列參照相關(guān)數(shù)據(jù)(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/pubmed/)。所有引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司以及北京基諾博實生物技術(shù)有限公司合成。
[0041]1.1.3PCR反應(yīng)以及瓊脂糖電泳檢測
[0042]使用首醫(yī)長爪沙鼠群體16個樣本基因組DNA作為微衛(wèi)星位點(diǎn)篩選的PCR擴(kuò)增模版，篩選出長爪沙鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)；使用浙江長爪沙鼠群體64個樣本基因組DNA作為微衛(wèi)星位點(diǎn)優(yōu)化篩選的PCR擴(kuò)增模板，篩選多態(tài)性較好的長爪沙鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系為15μ 1，其中:10XBuffer 1.5μ 1，上下游引物(lOOpmol/μ I)各 I μ l，4XdNTP IOOymol/L:1μ I, Taq 酶 IU:1 μ I，50_100ng 基因組 DNA:1 μ I，純水(ddH20):8.5μ1 ;其中，Mg2+的終濃度為1.5~3.0mM。擴(kuò)增條件:94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，退火溫度(47~60°C )30s，72°C延伸30s，35個循環(huán)后72°C繼續(xù)延伸7min，擴(kuò)增產(chǎn)物4°C保存。取擴(kuò)增產(chǎn)物5μ I經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳140V，30min，成相拍照。
[0043]長爪沙鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)篩選PCR擴(kuò)增分為兩步:第一步，對首都醫(yī)科大學(xué)長爪沙鼠群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將PCR產(chǎn)物做克隆測序，篩選出長爪沙鼠的微衛(wèi)星位點(diǎn)，并確定最佳擴(kuò)增條件。影響PCR擴(kuò)增結(jié)果的主要因素是Mg2+濃度和退火溫度，固定其它因素，Mg2+濃度設(shè)為1.5禮、2.01111、2.51111和3.01111 4個梯度，退火溫度根據(jù)實驗室前期經(jīng)驗溫度值從47°C~60°C設(shè)12個梯度。經(jīng)瓊脂糖電泳后，對條帶清晰、只有一條或兩條，且條帶大小位于微衛(wèi)星大小范圍內(nèi)的位點(diǎn)進(jìn)行克隆測序，測序結(jié)果符合微衛(wèi)星定義的記錄這個優(yōu)化的Mg2+濃度和退火溫度，并把該位點(diǎn)作為被選位點(diǎn)。第二步，將篩選出的129個長爪沙鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)和GenBank中的7個位點(diǎn)(見表1.1)共136個對浙江長爪沙鼠群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選擴(kuò)增效率高，多態(tài)性良好的適用于封閉群長爪沙鼠遺傳檢測的微衛(wèi)星位點(diǎn)。將浙江長爪沙鼠群體64個基因組DNA 4個一組，隨機(jī)分為隨機(jī)16組混合DNA。選用6個多態(tài)性較好的位點(diǎn)篩選多態(tài)性好的基因組DNA，用長爪沙鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)對多態(tài)性好的基因組DNA進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后，根據(jù)瓊脂糖電泳結(jié)果，初步判斷該位點(diǎn)的多態(tài)性，把等位基因數(shù)達(dá)到3個的位點(diǎn)保留，淘汰等 位基因數(shù)量小于3的位點(diǎn)。
[0044]1.2.結(jié)果
[0045]1.2.1基因組DNA分析
[0046]兩個長爪沙鼠群體的基因組DNA (首醫(yī)長爪沙鼠群體16個，浙江長爪沙鼠群體64個，總計80個)，經(jīng)0.8%瓊脂糖電泳檢測顯示完整性好；核酸蛋白分析儀檢測所有樣品的OD260/OD280值均在1.8~2.0之間。動物編號1-10號的基因組DNA的瓊脂糖電泳圖如圖1。
[0047]1.2.2長爪沙鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選
[0048]536個微衛(wèi)星位點(diǎn)中擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測有清晰圖帶，且只有I條或2條，且擴(kuò)增結(jié)果有較好重復(fù)性，測序結(jié)果符合微衛(wèi)星位點(diǎn)特點(diǎn)的位點(diǎn)有129個，將序列測定的結(jié)果輸入Genbank數(shù)據(jù)庫。表1.1中列出了這些長爪沙鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)對應(yīng)的小鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)名稱及Genbank注冊號。其中，完美型微衛(wèi)星104個(80.62%)，不完美型微衛(wèi)星25個(19.38% )0把這些位點(diǎn)作為被選位點(diǎn)。
[0049]表1.1 GenBank中的長爪沙鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)名稱、注冊號及對應(yīng)的小鼠位點(diǎn)名稱
[0050]
【權(quán)利要求】
1.一種通過小鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)篩選長爪沙鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)的方法，包括: 獲得一個長爪沙鼠群體的長爪沙鼠基因組DNA樣品； 從GenBank中挑選小鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)，進(jìn)行引物合成； 將所述長爪沙鼠基因組DNA作為微衛(wèi)星位點(diǎn)篩選的PCR模板； 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并確定最佳擴(kuò)增條件； 瓊脂糖電泳，篩選條帶清晰、無雜帶或少雜帶的微衛(wèi)星大小范圍內(nèi)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 對篩選出的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序； 篩選出長爪沙鼠的微衛(wèi)星位點(diǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中篩選出長爪沙鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)共129個，分別為DXMit39、DXMitl7、D19Mit21、D19Mitll、D19Mit9、D19Mit2、D19Mitl、D18Mit45、D18Mit49、D17Mitl3、D17Mit38、D17Mit42、D16Mit26、D16Mit7、D15Mit34、D15Mitl7、D14Mit6、D14Mit92、DllMit4、DllMit35、DllMit36、DllMit42、DllMitl28、DllMit263、DlOMit66、D10Mit86、D9Mit70、D9Mit55、D9Mit47、D9Mit6、D8Mitl84、D8Mit56、D8Mit35、D8Mit24、D7Mit26、D7Mit33、D7Mit46、D7Mit71、D7Mit227、D7Mit333、D7Nds 1、D6Mit5、D6Mit37、D6Mit52、D6Mit85、D6Mitl39、D5Mit9、D5Mit25、D5Mit34、D4Mitl、D4Mit5、D4Mit7、D3Mit258、D3Mitl30、D3Mit221、D3Mitll7、D3Mitl7、D2Mit76、D2Mit231、D2Mit425、D2Mit525、DlMit428、DlMit432、DlMitll9、DlMit65、D16Mitl70、D12Mitl35、D9Mit323、D9Mit253、D15Mit9、D16Mitl00、D17Mit27、D17Mitl94、DllMit242、D10Mit266、D8Mit46、D7Mitl45、D6Mit339、D4Mit54、D5Mit31、D13M8、D12Mit201、DllMitl63、D17Mitl23、D2Mit22、D2Mitl、D3Mit56、D3Mitl56、D4Mitl23、D6Mit9、D9Mitl20、D10Mit223、DllMitl20、DllMit65、D13Mit246、D14Mitl6、D15Mitl23、D15Mitl24、D17Mit36、DlMitll2、D2Mitl6.1、D3MitlO、D3Mit215、D5Mit367、D6Mit23、D7Mit39、D7Mit76、D8Mit83、D10Mit20、DllMit5、D8Mitl70、DlMit362、D3Mit268、D6Mitl02、D7Mitl90、D8Mitl70、D13Mitl、D13Mit3、D13Mitl71、D16Mitl21、D13Mit216、D15Mit267、D16Mitl08、D16Mitl32、D17Mitl43、D17Mitl94、D17Mit226、D6Mitl02、D10Mit90。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，PCR反應(yīng)的上下游引物對分別為SEQID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和 SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12、SEQ IDNO:13 和 SEQ ID NO: 14,SEQ ID N0:15 和 SEQ ID NO: 16、SEQ ID N0:17 和 SEQ ID NO: 18,SEQID NO:19 和 SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 和 SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 和 SEQID NO:24,SEQ ID N0:25 和 SEQ ID NO:26、SEQ ID N0:27 和 SEQ ID NO:28、SEQ ID N0:29 和 SEQID NO:30, SEQ ID NO:31 和 SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33 和 SEQID NO:34、SEQID NO:35和 SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37和 SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39和 SEQ IDNO:40、SEQ IDN0:41 和 SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43 和 SEQ ID NO:44、SEQ ID N0:45 和 SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47 和 SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49 和 SEQID NO:50、SEQID NO:51 和 SEQ IDNO:52,SEQ ID NO:53 和 SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55 和 SEQ IDNO:56,SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59 和 SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61 和 SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:63 和 SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:65 和 SEQ ID NO:66、SEQID NO:67 和 SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69 和 SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71 和 SEQ IDNO:72, SEQ ID NO:73 和 SEQ ID
4.一種對長爪沙鼠群體進(jìn)行遺傳檢測的方法，所述方法包括: 獲得長爪沙鼠基因組DNA樣品； 選用適合于長爪沙鼠群體遺傳檢測的微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物，以長爪沙鼠基因組DNA樣品為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 瓊脂糖電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物； 短串聯(lián)重復(fù)掃描檢測； 利用統(tǒng)計學(xué)分析方法分析群體內(nèi)的遺傳變異性、群體間的遺傳距離。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述群體內(nèi)遺傳變異選用的分析指標(biāo)為平均觀察等位基因數(shù)、平均有效雜合度、平均觀察雜合度、香隆指數(shù)；所述群體間遺傳距離采用奈氏標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離、群體間遺傳分化系數(shù)Rst、分子方差分析。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其中選用39個微衛(wèi)星位點(diǎn)，包括權(quán)利要求2中所篩選的 32 個位點(diǎn):D16Mit7、D16Mit26、DlMit362、D8Mitl84、D7Mit33、D6Mit37、D5Mit31、D12Mit201、D2Mit22、D15Mitl24、DllMit36、D7Mit71、D2Mit76、D3Mitl30、D19Mitl、DllMit35、D17Mit38、DXMitl7、D8Mit56、D10Mit66、D13Mitl、D3Mitl7、D15Mitl7、DllMit42、D17Mitl3、D19Mit9、DllMit4、D4Mit5、D3Mit56、D15Mit267、D6Mit9 和 D7Mit39 ； 以及已知的 7 個位點(diǎn):AF200942、AF200943、AF200944、AF200946、AF200945、AF200941、AF200947。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中PCR反應(yīng)的上下游引物分別為SEQID NO:261和SEQ ID NO:262,SEQ ID NO:263 和 SEQ ID NO:264、SEQ ID NO:265 和 SEQ ID NO:266、SEQID NO:267 和 SEQ ID NO:268、SEQ ID NO:269 和 SEQ ID NO:270、SEQ ID NO:271 和 SEQID NO:272, SEQ ID NO:273 和 SEQ ID NO:274、SEQ ID N0:27 和 SEQ ID NO: 28、SEQID NO:，25 和 SEQ ID NO:26、SEQ ID NO :223 和 SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:63 和 SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:71 和 SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:85 和 SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:159 和 SEQID NO:160,SEQ ID NO:163 和 SEQ ID NO: 164,SEQ ID NO:169 和 SEQ ID NO: 170、SEQ IDNO:195 和 SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:41 和 SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:75 和 SEQID NO:，76,SEQ ID NO:115和 SEQ ID N0:116、SEQ ID NO:107和 SEQ ID NO: 108,SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:39 和 SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:21 和 SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:3 和 SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:63 和 SEQ ID NO:64、SEQ ID N0:49 和 SEQ IDNO:50、SEQID NO:233 和 SEQ ID NO: 234,SEQ ID NO:113和 SEQ ID NO: 114、SEQ IDNO:31 和 SEQ IDNO:32,SEQ ID NO:43 和 SEQ ID NO:44,SEQ ID N0:19 和 SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:9 和SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:37 和 SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:101 和 SEQID NO:102、SEQ IDNO:173 和 SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO:243 和 SEQ ID NO:244、SEQ IDNO: 93 和 SEQ ID NO:，94、SEQ ID NO:211 和 SEQ ID NO:212。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中選用28個微衛(wèi)星位點(diǎn)AF200942、AF200943、AF200944、AF200946、AF200945、AF200941、AF200947、D 16Mit7、D 16Mit26、D lMit362、D8Mitl84、D7Mit33、D6Mit37、D5Mit31、D12Mit201、D2Mit22、D15Mitl24、DllMit36、D7Mit71、D2Mit76、D3Mitl30、D19Mitl、DllMit35、D17Mit38、DXMitl7、D8Mit56、D10Mit66和 D13Mitl。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)的上下游引物分別為SEQIDNO:，261 和 SEQ ID NO:262、SEQ ID NO:263 和 SEQ ID NO:264、SEQ ID NO:265 和 SEQ IDNO:，266,SEQ ID NO:267 和 SEQ ID NO:268、SEQ ID NO:269 和 SEQ ID NO:270,SEQ IDNO:271和 SEQ ID NO:272,SEQ ID NO:273 和 SEQ ID NO:274、SEQ ID NO:27和 SEQ IDNO:28,SEQID NO:25 和 SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:223 和 SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:63 和 SEQ IDNO:64,SEQ ID NO:71 和 SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:85 和 SEQ ID NO:86、SEQID NO:159 和SEQ ID NO:160,SEQ ID NO:163 和 SEQ ID NO: 164,SEQ ID NO:169 和 SEQID NO: 170、SEQID NO:195 和 SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:41 和 SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:75 和 SEQ IDNO:76、SEQ ID NO:115 和 SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:107 和 SEQ IDNO:108、SEQ ID NO:13 和 SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO:39 和 SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:21 和 SEQ ID NO:22、SEQID NO:3 和 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:63 和 SEQ ID NO:64、SEQ IDNO:49 和 SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:233 和 SEQ ID NO:234。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法的應(yīng)用，用于進(jìn)行長爪沙鼠群體內(nèi)遺傳變異和群體間遺傳差異分析。
【文檔編號】C12Q1/68GK103484452SQ201210195672
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年6月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月14日
【發(fā)明者】陳振文, 杜小燕, 路靜, 薩曉嬰, 賀爭鳴, 王超, 李長龍 申請人:首都醫(yī)科大學(xué)