專利名稱：一種產(chǎn)胞外普魯蘭酶的方法及其專用微生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種產(chǎn)胞外普魯蘭酶的方法及其專用微生物，屬于微生物發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭酶的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
普魯蘭多糖是麥芽三糖通過α-l，6-糖苷鍵連接而成的直鏈寡糖，而普魯蘭酶是指能夠高效水解普魯蘭多糖的ー類水解酶。根據(jù)普魯蘭酶對(duì)底物特異性及水解產(chǎn)物的種類，可以將普魯蘭酶分為4種類型I型普魯蘭酶(EC 3. 2. I. 41)、II型普魯蘭酶(EC3. 2. I. 41)、新普魯蘭酶(EC 3. 2. I. 135)和異普魯蘭酶(EC 3.2.1.57)。I型普魯蘭酶可 以水解普魯蘭多糖和支鏈寡糖中的α -I, 6-糖苷鍵生成麥芽三糖和直鏈寡糖；而能水解普魯蘭多糖中的α-1，6-糖苷鍵同時(shí)也能水解其它多糖中的α-1，4-糖苷鍵的為II型普魯蘭酶；新普魯蘭酶和異普魯蘭酶作用于普魯蘭多糖中α -I, 4-糖苷鍵分別產(chǎn)生潘糖和異潘糖。由于I型普魯蘭酶對(duì)α -1,6-糖苷鍵的特異性及可以將最小単位的支鏈分解，在淀粉制糖エ業(yè)中與糖化酶混合使用能最大限度地利用淀粉，因此，普魯蘭酶在以淀粉為原料的發(fā)酵エ業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用前景。普魯蘭酶與糖化酶并用時(shí)，在降低糖化酶用量一半的同時(shí)可以使DE值上升至高達(dá)98%，從而大大提高原料的利用率和葡萄糖的收率，例如應(yīng)用在酒精エ業(yè)中，可以顯著提高淀粉的轉(zhuǎn)化率，降低生產(chǎn)成本。普魯蘭酶與β_淀粉酶混合使用時(shí)，幾乎可以全部將淀粉轉(zhuǎn)化為麥芽糖，從而可以生產(chǎn)出80%以上的超高麥芽糖漿，在α-糖苷酶的作用下，超高麥芽糖漿轉(zhuǎn)化為功能性異麥芽低聚糖，可以用于糖尿病人，肥胖病人以及兒童糖果中使用，有效地防止齲齒。在啤酒生產(chǎn)的糖化エ藝中，添加普魯蘭酶可以有效地提高麥汁中可發(fā)酵性糖的含量，提高麥汁的利用率、縮短糖化時(shí)間，生產(chǎn)出優(yōu)級(jí)干啤酒。普魯蘭酶還可以用來生產(chǎn)具有穩(wěn)定的凝膠性能、良好的韌性和增稠作用的直鏈淀粉，進(jìn)而利用直鏈淀粉生產(chǎn)出可生物降解的薄膜或是作為添加劑或輔料用于食品エ業(yè)和紡織エ業(yè)中。此外，普魯蘭酶還存在較強(qiáng)的反向合成能力，在高底物濃度下可以將麥芽糖基等接枝到環(huán)糊精分子上，制備得到麥芽糖基環(huán)糊精等。由于普魯蘭酶在酒精、食品、環(huán)保產(chǎn)業(yè)上極其重要的用途，它將和淀粉酶、糖化酶ー樣成為ー個(gè)與國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展相關(guān)的重大產(chǎn)業(yè)。普魯蘭酶的生產(chǎn)和應(yīng)用主要由諾維信和杰能科等國(guó)際公司所壟斷。從20世紀(jì)60年代Bender在出芽短梗霉{Aureobasidium的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)普魯蘭酶到80年代初，普魯蘭酶的研究一直處于產(chǎn)酶微生物的篩選和酶學(xué)性質(zhì)的鑒定方面。近幾年，國(guó)際上對(duì)普魯蘭酶的研究主要集中在普魯蘭酶在革蘭氏陰性細(xì)菌中的分泌機(jī)制。而國(guó)內(nèi)針對(duì)普魯蘭酶的研究主要集中在普魯蘭酶生產(chǎn)菌的篩選、發(fā)酵優(yōu)化及普魯蘭酶編碼基因的異源表達(dá)等方面，篩選獲得的產(chǎn)酶微生物主要包括產(chǎn)氣氣桿菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等，以及高溫厭氧菌、嗜熱古細(xì)菌、海棲熱袍菌、深海古菌等極端微生物。但是其酶活較低，一般野生菌發(fā)酵普魯蘭酶活力均低于10 U/mL，且不能有效分泌至胞外，因而很難達(dá)到エ業(yè)化生產(chǎn)的要求。目前，尚沒有通過篩選利用黑座克雷伯氏菌發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭酶的報(bào)道。本發(fā)明篩選獲得產(chǎn)胞外普魯蘭酶的菌株黑座克雷伯^mebsiella variicolaXCTCC NO M 2012108，并通過發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化使該菌株產(chǎn)胞外普魯蘭酶的活力達(dá)到11 U/mL。
發(fā)明內(nèi)容
( I)要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)胞外普魯蘭酶的方法及其專用微生物。本發(fā)明目的不僅僅在于通過微生物菌株發(fā)酵生產(chǎn)胞外普魯蘭酶，而是通過篩選獲得可以生產(chǎn)普魯蘭酶的新菌株，而且通過培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件優(yōu)化進(jìn)一步提高野生菌株生產(chǎn)普魯蘭酶的能力，并進(jìn)一歩考察該菌株所產(chǎn)普魯蘭酶的酶學(xué)性質(zhì)，以開發(fā)其生產(chǎn)和應(yīng)用價(jià)值。(2)技術(shù)方案 本發(fā)明首先從微生物出發(fā)，篩選能夠高效生產(chǎn)胞外普魯蘭酶的菌株。在此基礎(chǔ)上，對(duì)該菌種的培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，并考察以該菌種進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)的普魯蘭酶的酶學(xué)性質(zhì)及水解普魯蘭的過程中產(chǎn)物的組成變化，進(jìn)而確定普魯蘭酶的類型?！?、產(chǎn)胞外普魯蘭酶菌株的篩選及分類鑒定 培養(yǎng)基
基本培養(yǎng)基支鏈淀粉 10 g/L，酵母粉 5 g/L, KH2PO4 3 g/L，MgSO4 ·7Η20 I g/L, NH4Cl
2g/L, pH 5. O0鑒別培養(yǎng)基紅色普魯蘭多糖10 g/L，蛋白胨10 g/L, KH2PO4 3 g/L，MgSO4 · 7H20I g/L, NH4Cl 2 g/L，瓊脂 20 g/L, pH 5. 0o初始發(fā)酵培養(yǎng)基可溶性淀粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，KH2PO4 5g/L, MgSO4 · 7H20 O. I g/L, NH4Cl 2 g/L, pH 5. 0。主要試劑
3，5-ニ硝基水楊酸購(gòu)于國(guó)藥試劑公司
紅色普魯蘭購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司
普魯蘭購(gòu)于上海TCI試劑公司
酵母粉購(gòu)于Oxiod
蛋白胨購(gòu)于Oxiod
菌種的培養(yǎng)和篩選
將所采集的土壤樣品適量加入到基本培養(yǎng)基中于40°C、200 rpm的恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)48小吋。取培養(yǎng)物進(jìn)行適當(dāng)稀釋之后，涂布于鑒別培養(yǎng)基的平板上，于37°C的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)2天左右。將其上生成較大透明圈的菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中于上述條件下進(jìn)行培養(yǎng)48小時(shí)左右，同時(shí)接種于斜面上進(jìn)行菌種的保存。菌種在裝液量為10%的50 mL搖瓶中于30°C、150 rpm振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液于10000 rpm離心10分鐘后得發(fā)酵上清用于菌株胞外酶活的測(cè)定和產(chǎn)酶菌株的再次確認(rèn)。普魯蘭酶測(cè)定方法
取100 μ L用100 mM、pH 5. O的醋酸緩沖適當(dāng)稀釋的酶液與等體積的溶于100 mM、pH
5.O醋酸緩沖中的10 g/L普魯蘭相混合于50°C水浴中保溫30分鐘。加入DNS試劑300μ L搖勻，置于沸水中煮沸15分鐘，取出以流動(dòng)水迅速冷卻后，于540 nm波長(zhǎng)處，以O(shè). 5 cm比色杯，測(cè)定反應(yīng)液的吸光度值。酶活單位定義在上述指定的條件下，每分鐘催化分解普魯蘭多糖生成相當(dāng)于Iμ mo I葡萄糖的還原糖所需的酶為I個(gè)酶活單位(U)。產(chǎn)酶菌株的分類鑒定
利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(VI0GENE公司)提取產(chǎn)酶菌株的基因組，以細(xì)菌的通用引物 27F (5，- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG -3，)和 1492R (5，- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3，)擴(kuò)增其 16S rDNAoPCR 反應(yīng)體系ddH20 37. 75 μ L，10 X Reaction Buffer 5 μ L，dNTP (2· 5 mmol/L)4 yL，引物 27F (20 pmol/μ L)1 yL，引物 1492R (20 pmol/μ L) I μ L，基因組 DNA I μ L, Taq DNA polymerase (5 U/ μ L) 0. 25 μ L。PCR 反應(yīng)過程94 °C 預(yù)變性 5 min ；98°C 10 s，55°C 15 s，72°C 4 min，進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸10 min。利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)純化PCR反應(yīng)獲得的DNA片斷，純化后進(jìn)行測(cè)序，并提交NCBI (登錄號(hào)為HM037179)對(duì)菌株進(jìn)行分類鑒定。通過比對(duì)，結(jié)果顯示得到的產(chǎn)酶菌株為黑座克雷伯氏菌variicola ) CCTCC NO :M2012108。ニ、發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化 培養(yǎng)基成分優(yōu)化
分別考察了碳源、氮源、磷源及硫酸鎂等對(duì)菌株產(chǎn)胞外普魯蘭酶的影響，并經(jīng)過正交實(shí)驗(yàn)最終確定所得菌株黑座克雷伯氏菌GWe/wieBa variicola) CCTCC NO M 2012108發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為
優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基可溶性淀粉10 g/L，蛋白胨15 g/L，酵母膏5 g/L，KH2PO4 5 g/L,MgSO4 · 7H20 0. I g/L, NH4Cl 0. 5 g/L, FeSO4 · 7H20 0. I g/L，用超純水配制，pH 6· 5。培養(yǎng)條件優(yōu)化
分別考察了起始pH、裝液量、溫度、培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化及菌體量的影響。最終確定了出發(fā)菌株黑座克雷伯氏菌{Klebsiella variicola ) CCTCC NO M2012108培養(yǎng)條件為起始pH5. 0 7. O,裝液量10 20%，搖床轉(zhuǎn)速100 300 rpm,培養(yǎng)溫度30 37°C，培養(yǎng)時(shí)間48 72小時(shí)。優(yōu)化后，黑座克雷伯氏菌(Z/e/wieWa variicolaXCTCC NO M 2012108產(chǎn)胞外普魯蘭酶的能力達(dá)到11 U/mL。三、胞外普魯蘭酶的制備及其酶學(xué)性質(zhì) 胞外普魯蘭酶酶液的制備
黑座克雷伯氏菌variicola ) CCTCC NO M 2012108接種于優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為10 20%的250 mL搖瓶中于3(T37°C、10(T300 rpm振蕩培養(yǎng)48 72小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液于10000 rpm離心30分鐘，棄去細(xì)胞，得到的上清即為胞外普魯蘭酶的粗酶液，用于普魯蘭酶最適PH值、溫度的測(cè)定及普魯蘭多糖的水解。pH值對(duì)普魯蘭酶活性的影響
將普魯蘭酶的粗酶液超濾濃縮10倍后，取適量用不同pH的緩沖液進(jìn)行稀釋至I U/mL左右，與溶于相同緩沖液、具有相同pH值的10 g/L的普魯蘭多糖溶液等體積混合后于50°C的水浴中保溫30分鐘后測(cè)定普魯蘭酶的活力，以確定其作用的最適pH值。以pH 5.0、50°C測(cè)定的普魯蘭酶酶活作為100%，計(jì)算不同pH對(duì)普魯蘭酶活力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該普魯蘭酶在ρΗ5· (Γ7· O的范圍內(nèi)保持90%以上的活力，當(dāng)pH低于5. O時(shí)活力明顯下降。溫度對(duì)普魯蘭酶活性的影響
將普魯蘭酶的粗酶液超濾濃縮10倍后，取適量用100 mM、pH 5. O的醋酸緩沖液進(jìn)行稀釋至I U/mL左右，與溶于相同緩沖液、具有相同pH值的10 g/L的普魯蘭多糖溶液等體積混合后于45 70°C的水浴中保溫30分鐘后測(cè)定普魯蘭酶的活力，以確定其作用的最適作用溫 度。以pH 5. 0、55°C測(cè)定的普魯蘭酶酶活作為100%，計(jì)算不同溫度對(duì)普魯蘭酶活力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該普魯蘭酶在55°C時(shí)活力最高，當(dāng)溫度高于55°C后普魯蘭酶的活力明顯下降。普魯蘭酶水解普魯蘭多糖的產(chǎn)物及其類型
將普魯蘭酶的粗酶液超濾濃縮10倍后，取適量用100 mM、pH 5. O的醋酸緩沖液進(jìn)行稀釋至5 U/mL左右，與溶于相同緩沖液、具有相同pH值的10 g/L的普魯蘭多糖溶液等體積混合后于55°C的水浴中保溫，分別在0、10、20和30分鐘取樣后加入沸水浴中保持10分鐘滅活普魯蘭酶。冷卻后加入3倍體積的無(wú)水こ醇沉淀蛋白和未被水解的普魯蘭，離心去除沉淀后，利用高效液相色譜測(cè)定上清液中成分的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)物中麥芽三糖的量逐漸增加，因此確定黑座克雷伯氏菌variicola)CCTCCM2012108所產(chǎn)的普魯蘭酶為I型普魯蘭酶。高效液相色譜測(cè)定普魯蘭酶水解普魯蘭多糖上清液中成分的條件液相色譜柱Kromasil NH2，示差折光檢測(cè)器，流動(dòng)相為こ臆/水(7 3)，流速I mL/min，進(jìn)樣量50 μし黑座克雷伯氏菌(Z/e/wieBavariicola) CCTCC NO M 2012108
菌落形態(tài)為灰白到乳白色粘液菌落，表面光滑，有光澤，菌落不透明。菌體形態(tài)為短粗桿狀，大小O. 5 0. 8Xf 2 ym，単獨(dú)、成雙或短鏈狀排列。無(wú)芽孢，無(wú)鞭毛，有較厚的莢膜，革蘭氏陰性，不運(yùn)動(dòng)，氧化酶陰性，其生長(zhǎng)不需要特殊的生長(zhǎng)因子。生理生化特征表現(xiàn)為甲基紅試驗(yàn)為陰性，VP試驗(yàn)為陽(yáng)性，可以發(fā)酵葡萄糖，L-阿拉伯糖、乳糖、D-甘露醇、鼠李糖、蔗糖、葡萄糖、棉籽糖和D-山梨醇，可以利用檸檬酸鹽等，脲酶試驗(yàn)為陽(yáng)性，精氨酸雙水解酶和鳥氨酸脫羧酶為陰性，賴氨酸膠羧酶為陽(yáng)性。最適生長(zhǎng)溫度為37°C左右，最適pH為
6.5 7. 5之間。(3)有益效果
本發(fā)明通過篩選得到一株具有產(chǎn)較高胞外普魯蘭酶的菌株黑座克雷伯氏菌{Klebsiella variicola ) CCTCC NO M 2012108。經(jīng)過培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件優(yōu)化后，用該菌株進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)胞外普魯蘭酶時(shí)可以獲得達(dá)到11 U/mL的普魯蘭酶。用該菌株所產(chǎn)胞外普魯蘭酶水解普魯蘭多糖時(shí)所得到的主要產(chǎn)物為麥芽三糖，從而確定該菌株所產(chǎn)的普魯蘭酶為I型普魯蘭酶。生物材料樣品保藏黑座克雷伯氏菌(J1 ebsi ella vari I cola ) SHN-1 ;保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)寫CCTCCJii :中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)CCTCC NO M2012108，保藏日期為2012年4月11日。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例I
采用黑座克雷伯氏菌variicola) CClCC NO M 2012108發(fā)酵生產(chǎn)胞外普
魯蘭酶
黑座克雷伯氏菌variicola ) CCTCC NO M 2012108接種于優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為10%的250 mL搖瓶中于30°C、100 rpm振蕩培養(yǎng)48小吋。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液于10000 rpm離心30分鐘，棄去細(xì)胞，得到的上清即為胞外普魯蘭酶的粗酶液。取100μ L粗酶液用100 mM、pH 5. O的醋酸緩沖適當(dāng)稀釋的酶液與等體積的溶于100 mM、pH 5.0醋酸緩沖中的10 g/L普魯蘭相混合于50で水浴中保溫30分鐘，測(cè)得普魯蘭酶酶活為5U/mL ο實(shí)施例2
采用黑座克雷伯氏菌OWeZwieBa variicola) CClCC NO M 2012108發(fā)酵生產(chǎn)胞外普
魯蘭酶
黑座克雷伯氏菌variicola ) CCTCC NO M 2012108接種于優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為10%的250 mL搖瓶中于37°C、200 rpm振蕩培養(yǎng)72小吋。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵 液于10000 rpm離心30分鐘，棄去細(xì)胞，得到的上清即為胞外普魯蘭酶的粗酶液。取100μ L粗酶液用100 mM、pH 5. O的醋酸緩沖適當(dāng)稀釋的酶液與等體積的溶于100 mM、pH 5.0醋酸緩沖中的10 g/L普魯蘭相混合于50°C水浴中保溫30分鐘，測(cè)得普魯蘭酶酶活為11U/mL ο
權(quán)利要求
1.一株產(chǎn)胞外普魯蘭酶的菌株，分類命名為黑座克雷伯氏菌variicola、SHN-I，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NO M 2012108。
2.—種用權(quán)利要求I所述菌株生產(chǎn)胞外普魯蘭酶的方法，其特征在于 出發(fā)菌株采用黑座克雷伯氏菌variicolaXCTCC NO M 2012108，經(jīng)過菌株的培養(yǎng)和產(chǎn)酶條件的優(yōu)化用于生產(chǎn)胞外I型普魯蘭酶；優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成為可溶性淀粉10 g/L，蛋白胨15 g/L，酵母膏5 g/L, KH2PO4 5g/L, MgSO4 · 7H20 O. I g/L, NH4Cl 0. 5 g/L, FeSO4 · 7H20 0. I g/L，用超純水配制，pH 6. 5 ；培養(yǎng)條件為起始PH5. (Γ7. 0，接種在優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為10°/Γ20%的250 mL搖瓶中，于3(T37°C、10(T300 rpm振蕩培養(yǎng)48 72小時(shí)；培養(yǎng)結(jié)束后將發(fā)酵液于10000 rpm離心30 min，棄去細(xì)胞，得到普魯蘭酶的粗酶液； 經(jīng)過培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化，黑座克雷伯氏菌variicola) CCTCC NO M2012108生產(chǎn)胞外普魯蘭酶的酶活提高到11 U/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于生產(chǎn)得到的為胞外I型普魯蘭酶。
全文摘要
一種產(chǎn)胞外普魯蘭酶的方法及其專用微生物，屬于微生物發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭酶的技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明篩選得到一株產(chǎn)胞外普魯蘭酶的新菌種，分類命名為黑座克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)SHN-1，保藏編號(hào)CCTCC NOM2012108。以該菌株作為出發(fā)菌種，經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)基和產(chǎn)酶培養(yǎng)條件的優(yōu)化，最終獲得的胞外普魯蘭酶酶活達(dá)到11U/mL。通過對(duì)黑座克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)CCTCC NOM2012108產(chǎn)胞外普魯蘭酶酶學(xué)性質(zhì)的考察，確定了該普魯蘭酶的最適pH值為pH5.0、最適溫度為55℃，其水解普魯蘭類型為I型普魯蘭酶。本發(fā)明有助于了解產(chǎn)胞外普魯蘭酶菌種的生物多樣性，對(duì)于今后改善胞外普魯蘭酶的生產(chǎn)工藝、促進(jìn)胞外普魯蘭酶的高效生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102676437SQ201210187070
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月8日
發(fā)明者徐巖, 聶堯, 陳文波 申請(qǐng)人:江南大學(xué)