細(xì)鱗魚Cathelicidin抗微生物肽CATH_BRALE及其基因、制備、應(yīng)用的制作方法

專利名稱：細(xì)鱗魚Cathelicidin抗微生物肽CATH_BRALE及其基因、制備、應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種來源于細(xì)鱗魚(Brachymystax Ienok)的cathelicidin家族廣譜抗微生物肽CATH_BRALE及其基因，制備方法和在醫(yī)療、生物制藥及水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
Cathelicidin是一類由N端信號肽 區(qū)域、中間保守cathelin結(jié)構(gòu)域和C端高度特異的成熟肽區(qū)域構(gòu)成的具有多功能的抗菌肽家族，在幾乎所有種類的動物體內(nèi)(哺乳類、鳥類、兩棲類和魚類)都有發(fā)現(xiàn)。與防御素(defensin) —樣,Cathelicidin是包括人類在內(nèi)的大多數(shù)脊椎動物所特有的宿主防御肽，構(gòu)成了脊椎動物自然免疫反應(yīng)的關(guān)鍵組分，是連接自然免疫和特異性免疫的橋梁。Cathelicidin具有廣譜的抗菌活性，不僅對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、某些真菌以及病毒具有非常強(qiáng)的殺菌活性，而且對許多臨床耐藥細(xì)菌同樣具有作用。除此之外，Cathelicidin還具有許多其他生物學(xué)活性，如對多種免疫細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞和T細(xì)胞)具有趨化作用、誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫粒和組織胺釋放、調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、促進(jìn)傷口愈合、誘導(dǎo)血管發(fā)生、誘導(dǎo)變異細(xì)胞系細(xì)胞凋亡和淋巴細(xì)胞活化等。Cathelicidin基因的缺失或異常表達(dá)都將導(dǎo)致人類嚴(yán)重疾病的發(fā)生。最新研究發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡和牛皮癬的發(fā)病與人體內(nèi)Cathelicidin LL-37的過度表達(dá)有關(guān)。由于具有如此眾多的活性，Cathelicidin —直是國際上研究的熱點(diǎn)。針對Cathelicidin的藥用開發(fā)則蘊(yùn)含著巨大的臨床治療藥物制備價(jià)值。由于近年來抗生素的濫用，導(dǎo)致致病性微生物耐藥性的問題日益嚴(yán)重，在臨床上已經(jīng)出現(xiàn)了大量能夠完全耐受青霉素等傳統(tǒng)抗生素的微生物。最近，一種攜帶編寫NDM-I酶基因的“超級病菌”的出現(xiàn)，罪魁禍?zhǔn)渍强股氐臑E用和誤用。這種酶可分解β_內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)，因此可使目前為止臨床最常用的抗生素，包括青霉素與頭孢菌素，以及新發(fā)展的頭霉素類、硫霉素類、單環(huán)內(nèi)酰胺類等其他非典型內(nèi)酰胺類抗生素失效。而Cathelicidin家族抗微生物肽的殺菌機(jī)制是通過破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性介導(dǎo)的通過靜電相互作用吸引并結(jié)合到帶負(fù)電的細(xì)菌細(xì)胞膜表面，進(jìn)一步在細(xì)菌細(xì)胞膜上形成跨膜的孔洞，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)容物的外泄,從而導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞的死亡。除此之外,越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道表明抗菌肽還具有其他的殺菌機(jī)制，如抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成、改變細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜抑制隔膜形成、激活自溶素、抑制細(xì)胞內(nèi)酶活性、抑制DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成等。正是由于作用方式的不同，Cathelicidin介導(dǎo)的殺菌作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于傳統(tǒng)抗生素，并且不會產(chǎn)生耐藥性。體外抗微生物測試中，大多數(shù)Cathelicidin成熟肽可以在微摩爾和亞微摩爾的濃度下快速殺死廣泛的微生物。Cathelicidin成熟肽表現(xiàn)抗微生物肽的典型特征大多數(shù)Cathelicidin成熟肽分子量小于5000，中性pH條件下帶凈正電荷，緣于它們含有多個堿性氣基酸殘基；富含疏水喊基，整體具有兩未性的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。目前Cathelicidin抗菌肽藥物研究熱點(diǎn)主要集中在消炎、抗感染和抗真菌等方面，應(yīng)用方式可以是局部的也可以是系統(tǒng)的，劑型可以是口服也可以外用。尤其由于陽離子抗菌肽的表達(dá)與皮炎、侵入性燒傷膿血癥、腫瘤病毒引起的肉贅等之間的病理聯(lián)系，這些抗菌肽對這些疾病的局部治療有較好的開發(fā)前景。例如中科院昆明所優(yōu)選出蛇cathelicidin抗菌肽對500多株臨床耐藥菌株顯示了較強(qiáng)的抗菌活性，同時(shí)具有極低的哺乳動物細(xì)胞毒性以及溶血活性，優(yōu)于美國正進(jìn)行III期臨床的同類候選藥物pexiganan;來源于豬protegrin的IB-367用于治療腫瘤患者口腔潰瘍，已進(jìn)入臨床III期試驗(yàn)。LL-37作為治療囊腫性纖維化支氣管炎的局部殺菌劑、及人抗菌肽CAP-18及其衍生物用于治療上呼吸道感染、呼吸道感染、鼻竇炎、中耳炎等疾病的藥物均已經(jīng)成為生物制藥領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點(diǎn)。不僅限于醫(yī)藥領(lǐng)域，在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和日化用品領(lǐng)域，cathelicidin也存在巨大的應(yīng)用潛能。我國是漁業(yè)大國，水產(chǎn)品總產(chǎn)量位居世界首位。但是，近幾年，隨著高密度、集約化養(yǎng)殖模式的發(fā)展，水環(huán)境的污染程度加重，各種細(xì)菌性和病毒性疾病頻發(fā)，防治疾病大量使用抗生素破壞水環(huán)境的微生態(tài)平衡，導(dǎo)致某些病原體對藥物產(chǎn)生了耐藥性，危害人體健康等。相繼發(fā)生的水產(chǎn)養(yǎng)殖或水產(chǎn)品加工過程中過量使用漁用藥物或加入禁用藥物導(dǎo)致的 “孔雀石綠事件”、“多寶魚事件”、“氯霉素事件”等，給水產(chǎn)業(yè)蒙上一層濃厚的陰影，對消費(fèi)者的人身安全造成威脅，也因此食品安全問題更加受到人們的關(guān)注。近年來，我國已有研究利用抗菌肽替代傳統(tǒng)抗生素針對抗水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中常見病原菌，如嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、梅氏弧菌(Vibrio metschnikovi)、遲純愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)及溫和氣單胞菌(Aobria)均有較好的抑菌效果。通過飼料攝入抗菌肽，對南美白對奸親蟲下產(chǎn)卵、孵化率及蝦苗飼養(yǎng)，和對成蝦的飼養(yǎng)效果明顯優(yōu)于金霉素?？咕闹破吩趯ξr的飼料或水體中能對水中的微生物加以控制，使致病微生物如弧菌等均能殺滅，通過飼料攝入蝦體內(nèi)能提聞免疫力和促進(jìn)生長等功效。由于世界范圍內(nèi)對Cathelicidin的研究歷史并不長，我國在此類活性多肽家族的研究還鮮有報(bào)道。細(xì)鱗魚(Brachymystax lenok)屬鮭科,細(xì)磷魚屬，生長在高寒冷水區(qū)域，是重要的冷水性經(jīng)濟(jì)魚類。由于肉質(zhì)鮮美，過量捕撈，已列入我國國家二級保護(hù)動物名單。本次發(fā)明的細(xì)鱗魚抗微生物肽CATH_BRALE，將其全序列氨基酸結(jié)構(gòu)經(jīng)NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜尋比對，未發(fā)現(xiàn)有任何相同多肽。發(fā)明人將本發(fā)明的細(xì)磷魚CATH_BRALE編碼基因經(jīng)NCBI基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜尋比對，未發(fā)現(xiàn)有任何相同基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種在亞微摩爾劑量下即具有很強(qiáng)的抗微生物活性的來源于細(xì)鱗魚的一種抗微生物肽，CATH_BRALE及其基因、化學(xué)合成方法和應(yīng)用。本發(fā)明的目的是基于上述理論研究和現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)，提供一種具有強(qiáng)烈的抗菌活性，尤其針對水產(chǎn)養(yǎng)殖中幾種常見病原菌的細(xì)磷魚CATH_BRALE及其應(yīng)用，著重水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案CATH_BRALE是細(xì)鱗魚Cathelicidin基因編碼的一種直鏈多肽，含有53個氨基酸殘基，理論等電點(diǎn)(Pl)為12. 43，理論分子量為5200. 6，含有15個堿性氨基酸殘基(11個精氨酸和4個賴氨酸)，含有兩個酸性氨基酸殘基(天冬氨酸)，靜電荷為+13，說明它是一種較強(qiáng)的堿性多肽。CATH_BRALE不含半胱氨酸，因此沒有分子內(nèi)和分子間二硫鍵，結(jié)構(gòu)簡單。cath_brale全序列為精氨酸-精氨酸-絲氨酸-賴氨酸-丙氨酸-精氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸-甘氨酸-絲氨酸-賴氨酸-甲硫氨酸-甘氨酸-精氨酸-賴氨酸-天冬氨酸-絲氨酸-賴氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-絲氨酸-異亮氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸-絲氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-精氨酸-甘氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-精氨酸-天冬酰胺-丙氨酸細(xì)鱗魚抗菌肽CATH_BRALE基因的克隆包括細(xì)鱗魚脾臟總RNA提取，mRNA純化，mRNA反轉(zhuǎn)錄及cDNA文庫構(gòu)建，設(shè)計(jì)引物，利用PCR方法篩選細(xì)鱗魚抗菌肽CATH_BRALE基因。5’端引物分別為Pl(5，-ACATGAAGATGAAGGCTCTGGCG-3’)和 P2 (5，-CCCAGACTGAGACCAGGTACGAAG-3’)，PCR 另一擴(kuò)增引物為 CL0NTECH 公司 CreatorTM SMART TM cDNA Library Construction Kit 中的3’ PCR Primer引物，其序列為5’ - CGGGGTACGATGAGACACCAT - 3’。所獲陽性單克隆進(jìn)行基因核苷酸序列測定?；驕y序結(jié)果表明編碼細(xì)鱗魚抗菌肽CATH_BRALE前體cathelicidin的基因由909個核苷酸組成，自5’端至3’端序列為 I ATGAAGATGA AGGCTCTGGC GAGATCTCTT CTCTTGCTCG CTGTGACTGG51 CCTGCTGGTC AGAGGTCATT CCCAGACTGA GACCAGGTAC GAAGACATCA101 TCACAGCTGC TTCAACTCAG CTGCTTCCTG TGGAAGAGCA GGCTTTCCGT151 CCGCTTCTGA ACCAGCTGGA AGTCGAGACT TTGAATACAG AGGATGTGGA201 CCAGTCTGAG GTATCTGTAA AGTTGAGCTT TCCCCTGCAG GAGACTCTCT251 GCAGAAAGGC ACAAGGCCAA CCATGCCCTC TGAAGAAAAA TGGGAAACGA301 ATGATGTGCA GCATGGAGGT CAGACATCCG ATTCTGGATA CTGGCAACAC351 CCTCAACACT GACTGGTCTG ACATTTCTTG TGAATACATG GAGGCAGAAG401 ATGCTATGCC AGTACTGAGC ACTCAGAAGA TTCGGACAAG AAGAAGCAAG451 GCCAGGGGAG GCTCTAGGGG CTCTAAGATG GGTAGAAAAG ATTCCAAGGG501 GGGTAGCAGA GGTCGTCCTG GGAGTGGCTC TCGTCCTGGG GGTGGCTCCT551 CCATTGCTGG AGCTAGCAGA GGAGACCGTG GTGGAACTCG CAATGCATAG601 AACAGCACAA CACACCCTCT GGATAACTGC AAAATATCTC ACCAATCAAA651 GGAACTTCAA AAGCACTCAA AGTTGAGTTT AACGGATGAA CATGCAACCT701 TAAGCTTCTG GTAACTCTTT TGTCTACATT CTGAATTGGT TTGTATTTTG751 TAGCTATCGT TGTTTGTAAT AATGTACCTA TTCTTACATG CCAATCCTTG801 AATTTTAACT ACGGAAAATT GTTTCCAGTT CATGTTTACT GCACTAATAA851 ACTGCTAAAT AAGTTTCCAA AAAAAAAAAA AAAAAATGGT GTCTCATCGT901 ACCCCGAAT編碼細(xì)鱗魚cathelicidin成熟肽CATH_BRALE為第367 — 445位核苷酸，其氨基酸序列為Arg1 Arg2 Ser3 Lys4 Ala5 Arg6 Gly7 Gly8 Ser9 Argici Gly11 Ser12 Lys13 Met14 Gly15
a 16 τ 17 a 18c1 19 τ 20 -\ 21 -\ 2223 a 24 -\ 25 a 26 27 -\ 28 c1 29 -\ 30 c1 31
Arg Lys Asp Ser Lys Crly Crly Ser Arg Crly Arg rro Crly Ser Crly SerArg32 Pro33 Gly34 Gly35 Gly36 Ser37 Ser38 He39 Ala40 Gly41 Ala42Ser43 Arg44 Gly45 Asp46Arg47 Gly48 Gly49 Thr50 Arg51 Asn52 Ala53
細(xì)鱗魚抗菌肽CATH_BRALE基因作為基因工程制備細(xì)鱗魚抗菌肽CATH_BRALE的應(yīng)用。CATH_BRALE的化學(xué)制備方法根據(jù)編碼細(xì)鱗魚cathelicidin抗微生物肽基因推斷的成熟肽CATH_BRALE氨基酸序列，用自動多肽合成儀(433A, Applied Biosystems)合成其全序列。通過HPLC反相柱層析脫鹽純化，并確定其純度大于95%。用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-T0F)測定其分子量，等電聚焦電泳測定等電點(diǎn)，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。合成的CATH_BRALE抗菌肽可以溶于滅菌超純水，用于藥理活性檢測。本發(fā)明的有益效果在于基因克隆得到編碼細(xì)鱗魚cathelicidin抗微生物肽的基因，通過化學(xué)合成方法得到成熟肽CATH_BRALE。該抗微生物肽富含堿性氨基酸，對水產(chǎn)養(yǎng)殖常見病原菌A. salmonicida, A. hydrophila殺菌作用很強(qiáng),結(jié)構(gòu)簡單,不含有二硫鍵及環(huán)狀結(jié)構(gòu),方便化學(xué)合成及基因工程制備。抗菌實(shí)驗(yàn)顯示其對多種臨床耐藥菌也有較好的殺滅作用。此外還具有無溶血性，無細(xì)胞毒性等特點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合技術(shù)方案詳細(xì)敘述本發(fā)明的具體實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。實(shí)施例I抗微生物肽CATH_BRALE前體基因的克隆及基因測序，包括米用RNeasy AxyPrep Multisource Total RNA Miniprep Kit (Qiagen,union city, CA, USA)提取細(xì)鱗魚脾臟總RNA，mRNA分離純化采用美國PR0MEGA公司的PolyATtract mRNA Isolation Systems 試劑盒。利用 In-Fusion SMARTer DirectionalcDNA Library Construction Kit建庫試劑盒構(gòu)建細(xì)鱗魚骨髓cDNA文庫。PowerScriptReverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,引物為正向SMARTer V Oligonucleot 引物5，- AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX - 3’反向 In-Fusion SMARTer CDS III引物5，- CGGGGTACGATGAGACACCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’ (N = A, C，G, or T; V = A, G, or C) ·利用Advantage DNA Polymerase 合成第二鏈，引物為正向 5’ - AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT-3’，反向引物同為 In-Fusion SMARTer CDS III。.設(shè)計(jì)兩條特異性正向引物(Pl、P2)和一條反向非特異性通用引物(⑶S III)，以細(xì)鱗魚脾臟cDNA為模板，采用半巢式PCR的方法擴(kuò)增cathelicidin的cDNA。正向Pl :5，-ACATGAAGATGAAGGCTCTGGCG-3，；正向P2 :5，-CCCAGACTGAGACCAGGTACGAAG-3，；反向非特異性通用引物為In-Fusion SMARTer CDS III，其序列為5 ‘一CGGGGTACGATGAGACACCAT-3，。所獲陽性單克隆進(jìn)行基因核苷酸序列測定，pMD19-T Vecter測序通用引物正向M13F :5，-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3，；反向M13R :5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’ ；
具體步驟如下第一步、細(xì)鱗魚脾臟總RNA提取(以下實(shí)驗(yàn)所用器具和試劑均經(jīng)過處理，無RNase)A.從新鮮宰殺的細(xì)鱗魚各種新鮮組織上分別剪下Ig左右的小塊，分別放入液氮預(yù)冷的細(xì)胞凍存管中，然后迅速放入液氮中保存；B.將保存在液氮中的組織材料取出，放入預(yù)冷的研缽內(nèi)，迅速充分研磨，期間不斷向研缽內(nèi)加入少許液氮；將大約30 mg的組織粉末轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的I. 5 ml離心管中，向其中分別加入400 μ I Buffer R-I(裂解液，RNA Miniprep Kit提供)，用21-25號針頭的注射器反復(fù)抽吸8-10次，轉(zhuǎn)入I. 5ml離心管中，加入150 μ I Buffer R-Π，渦旋振蕩15_30s，4 C，12000 rpm 離心 5 min ；C.將離心后的上清轉(zhuǎn)移至新的I. 5 ml離心管中，加入250ul異丙醇，迅速吸打混
勻；將混合液分別轉(zhuǎn)移至離心吸附柱，室溫，6000 rpm離心Imin ;棄廢液,然后加入500 μ IBuffer W1A,4 C，12000 rpm 離心 Imin ;棄廢液，加入 700 μ I BufferW2A，4 C，12000rpm 離心 Imin ;棄廢液,加入 700 μ I Buffer W2A, 4 C，12000 rpm 離心 I min;棄廢液，空管12000 rpm離心I min ;將離心吸附柱轉(zhuǎn)移至新的I. 5 ml離心管中，然后直接向吸附膜上滴加70-100 μ I Buffer TE，室溫放置lmin，12000 rpm離心I min洗脫得到總RNA ;第二步、cDNA文庫的構(gòu)建第一鏈的合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄):A.在新的O. 2ml PCR管(無DNase和RNase)中配制下列混合液模板RNAI μ g3，In-Fusion SMARTer CDS Primer (50 μ Μ) I μ I去離子水2·5μ1混合均勻，短暫離心；PCR儀中72 C保溫5 min后，然后42 C2 min ;短暫離心
后，在上述管中配制如下反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液
上述混合液4.5μ1
5Χ First-Strand Buffer2.0μ1
DTT(IOOmM)0.25μ1
dNTP Mix (ΙΟπιΜ )Ι.ΟμΙ
SMARTer V Oligonucleotide (12 μ.Μ.)1.0μ14μ1
RNase Inhibitor (40 /μ1)0,25μ1
SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 (J)*I .ΟμΙ混合均勻后，短暫離心；在PCR儀中完成以下程序42 C，90min;68 C，IOmin ;4 C，保存。cDNA 保存于-80 C。第二鏈的合成第一鏈 cDNA2μ1
去離子水80μ1
1OxAdvantage 2 PCR buffer10μ1 50xdNTP Mix2μ1
5’ PCR primer2μ1
In-Fusion SMARTerCDSlllprimer2μ1
50X Advantage 2 Polymerase Mix2μ!
第三步、采用半巢式PCR進(jìn)行細(xì)鱗魚cathelicidin的基因克隆篩選引物使用前先12000 rpm離心5min，然后根據(jù)標(biāo)明的摩爾數(shù)加入相應(yīng)體積的ddH20溶解至20 μ M的濃度。以合成的骨髓cDNA為模板，以Pl和In-Fusion SMARTer⑶S為引物，進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增。在O. 2ml PCR管中加入下列試劑(總體積20 μ I):
ddH208μ1 cDNA 模板 Ιμ
正向引物 Ρ1(20μΜ)0.5μ1
反向引物 In-Fusion SMARTer CDS (20μΜ)0.5μ1
2X Pfu PCR MasterMixI ΟμΙ混勻后，短暫離心。PCR條件為94 C變性5min ;25個循環(huán)94 C變性30s，60 C退火30s，72 C延伸lmin;72 C延伸IOmin ;4 C保存。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μ I產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。取上步PCR產(chǎn)物I μ I加入99 μ I ddH20稀釋100倍作為模板，以P2和CDS III為引物，進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增。在O. 2 ml PCR管中先后加入下列試劑(總體積20 μ I)
ddH207μ1
一次PCR產(chǎn)物稀釋液模板Iμ
正向引物Ρ2(20μΜ)Ιμ
反向引物 CDS 111(20 μΜ)Iμ
2xPfu PCR Masti rMixI ΟμΙPCR 條件為94 C 變性 5min ;25 個循環(huán)94 C 變性 30s，58 C 退火 30s，72 C延伸lmin ；72 C延伸IOmin ；4 C保存。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μ 1，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。擴(kuò)增完成后用膠回收試劑盒(天根生物)進(jìn)行目的片段回收。將回收的目的DNA片段與測序載體PMD19-T Vecter連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)CaCl2-MgCl 2法制備好的DH5a感受態(tài)細(xì)胞。取100 μ I轉(zhuǎn)化菌液均勻涂布在含有100 μ lg/ml氨芐青霉素(Amp)的LB瓊脂培養(yǎng)基平板上；表面晾干后，放在37 C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12-16 h。挑取單菌落用M13引物PCR檢測插入片段大小。挑取陽性菌落,搖菌提取質(zhì)粒,使用Applied Biosystems DNAsequencer, model ABI PRISM 377 進(jìn)行核苷酸測序。第四步、細(xì)鱗魚cathelicidin的基因序列測定和結(jié)果基因測序結(jié)果表明編碼CATH_BRALE前體cathelicidin的基因由909個核苷酸組成，自5’端至3’端序列為I ATGAAGATGA AGGCTCTGGC GAGATCTCTT CTCTTGCTCG CTGTGACTGG51 CCTGCTGGTC AGAGGTCATT CCCAGACTGA GACCAGGTAC GAAGACATCA
101 TCACAGCTGC TTCAACTCAG CTGCTTCCTG TGGAAGAGCA GGCTTTCCGT151 CCGCTTCTGA ACCAGCTGGA AGTCGAGACT TTGAATACAG AGGATGTGGA201 CCAGTCTGAG GTATCTGTAA AGTTGAGCTT TCCCCTGCAG GAGACTCTCT251 GCAGAAAGGC ACAAGGCCAA CCATGCCCTC TGAAGAAAAA TGGGAAACGA301 ATGATGTGCA GCATGGAGGT CAGACATCCG ATTCTGGATA CTGGCAACAC351 CCTCAACACT GACTGGTCTG ACATTTCTTG TGAATACATG GAGGCAGAAG401 ATGCTATGCC AGTACTGAGC ACTCAGAAGA TTCGGACAAG AAGAAGCAAG451 GCCAGGGGAG GCTCTAGGGG CTCTAAGATG GGTAGAAAAG ATTCCAAGGG501 GGGTAGCAGA GGTCGTCCTG GGAGTGGCTC TCGTCCTGGG GGTGGCTCCT551 CCATTGCTGG AGCTAGCAGA GGAGACCGTG GTGGAACTCG CAATGCATAG601 AACAGCACAA CACACCCTCT GGATAACTGC AAAATATCTC ACCAATCAAA651 GGAACTTCAA AAGCACTCAA AGTTGAGTTT AACGGATGAA CATGCAACCT701 TAAGCTTCTG GTAACTCTTT TGTCTACATT CTGAATTGGT TTGTATTTTG751 TAGCTATCGT TGTTTGTAAT AATGTACCTA TTCTTACATG CCAATCCTTG801 AATTTTAACT ACGGAAAATT GTTTCCAGTT CATGTTTACT GCACTAATAA851 ACTGCTAAAT AAGTTTCCAA AAAAAAAAAA AAAAAATGGT GTCTCATCGT901 ACCCCGAAT細(xì)鱗魚cathelicidin編碼區(qū)的cDNA核苷酸的序列表為序列長度為909個堿基，序列類型核酸，鏈數(shù)單鏈，拓?fù)鋵W(xué)直鏈狀，序列種類cDNA，來源細(xì)鱗魚骨髓。編碼細(xì)鱗魚cathelicidin成熟肽CATH_BRALE為第367 — 445位核苷酸，其氨基酸序列為Arg1 Arg2 Ser3 Lys4 Ala5 Arg6 Gly7 Gly8 Ser9 Argici Gly11 Ser12 Lys13 Met14 Gly15
a 16 τ 17 a 18c1 19 τ 20 -\ 21 -\ 2223 a 24 -\ 25 a 26 27 -\ 28 c1 29 -\ 30 c1 31
Arg Lys Asp Ser Lys Crly Crly Ser Arg Crly Arg rro Crly Ser Crly SerArg32 Pro33 Gly34 Gly35 Gly36 Ser37 Ser38 He39 Ala40 Gly41 Ala42Ser43 Arg44 Gly45 Asp46Arg47 Gly48 Gly49 Thr50 Arg51 Asn52 Ala53CATH_BRALE的化學(xué)制備方法I、根據(jù)編碼細(xì)鱗魚cathelicidin基因推斷的成熟肽CATH_BRALE氨基酸序列，用自動多肽合成儀(Applied Biosystems)合成其全序列,通過HPLC反相柱層析脫鹽純化,并確定其純度大于95%。
II、分子量測定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-T0F)，等電聚焦電泳測定等電點(diǎn)，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。合成的CATH_BRALE抗菌肽可以溶于滅菌超純水，用于藥理活性檢測。細(xì)磷魚抗微生物肽CATH_BRALE的藥理實(shí)驗(yàn)I. CATH_BRALE 抗菌活性檢測將化學(xué)合成的CATH_BRALE以2mg/ml的濃度溶解在無菌超純水中；用接種環(huán)挑取新活化的微生物，然后均勻涂布在新的LB瓊脂板上；將直徑O. 5 cm的圓形無菌濾紙片放在上述瓊脂板上，然后向紙片上滴加10 μ I CATH_BRALE樣品溶液；放入37 ° C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-24 h ;觀察抑菌圈形成與否，將對CATH_BRALE敏感的菌株記錄下來。2. CATH_BRALE對敏感菌株最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)的測定。該實(shí)驗(yàn)以人cathelicidin LL-37，無菌液體LB作陰性對照；最小抑菌濃度的定義為肉眼可以觀察到的完全抑制微生物生長的最低多肽濃度，或者是光吸收值不高于陰 性對照5%的最低濃度。挑取新活化的微生物，接種至無菌液體LB培養(yǎng)基，37 °C恒溫振蕩器中200 rpm培養(yǎng)10-16h至對數(shù)生長期；用紫外分光光度計(jì)測菌液600 nm光波處的吸光值，吸光值為I時(shí)，濃度大約為IO9 cfu/ml，將菌液用無菌液體LB培養(yǎng)基稀釋至IO6 cfu/ml，冰上待用；在96微孔板上配制濃度梯度為 200 μ g/ml> 100 μ g/ml、50 μ g/ml、25 μ g/ml> 12. 5 μ g/ml、6.25 μ g/ml、3. 13 μ g/ml>I. 56 μ g/ml、0. 78 μ g/ml、0. 39 μ g/ml、0. 20 μ g/ml 的經(jīng)O. 22 μ m孔徑膜過濾的CATH_BRALE樣品溶液，每孔50 μ I ;每孔加入50 μ I上述稀釋菌液；在恒溫振蕩器中37 °C，100 rpm振蕩培養(yǎng)10-16h ;使用酶標(biāo)儀測600 nm吸光值或肉眼觀察；上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。另取一塊96孔板，同樣操作，僅是每孔多加IOOmMNaCl，仍然重復(fù)3次，取平均值。由表I可見，cath_brale對測試的微生物具有廣譜的抗菌活性，特別是對兩種水產(chǎn)養(yǎng)殖常見病原菌株Aeromonas salmonicida,(殺鮭氣單胞菌)Aeromonas hydrophila(嗜水氣單胞菌)。CATH_BRALE不僅對革蘭氏陽性菌(G+)和革蘭氏陰性菌(G-)具有抗菌活性，還對部分真菌也有抗菌活性，而LL-37對革蘭氏陰性菌(G-)基本無活性。與人LL-37相t匕，CATH_BRALE對革蘭氏陰性菌(G-)抗菌活性更強(qiáng)CATH_BRALE對P. aeruginosa(銅綠假單胞菌)最為敏感，最小抑菌濃度僅為I. 17 μ M0 CATH_BRALE對兩種水產(chǎn)養(yǎng)殖常見病原菌株A. salmonicida和A. hydrophila都具有非常強(qiáng)的抗菌活性，最小抑菌濃度僅為9. 38 μ M,而LL37在2mg/ml的高濃度下仍未顯示抑菌活性。此外，CATH_BRALE還具有一定的抗真菌活性，對白色念珠菌ATCC2002的最小抑菌濃度也僅為2. 34μΜ。表I CATH_BRALE的最小抑菌濃度(MIC)
權(quán)利要求
1.ー種細(xì)磷魚Cathelicidin家族廣譜抗微生物肽CATH_BRALE，是細(xì)鱗魚Cathelicidin基因編碼的一種直鏈多肽，富含堿性氨基酸，其全序列為精氨酸_精氨酸-絲氨酸-賴氨酸-丙氨酸-精氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸-甘氨酸-絲氨酸-賴氨酸-甲硫氨酸-甘氨酸-精氨酸-賴氨酸-天冬氨酸-絲氨酸-賴氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-絲氨酸-異亮氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸-絲氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-精氨酸-甘氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-精氨酸-天冬酰胺-丙氨酸。
2.權(quán)利要求I所述抗微生物肽CATH_BRALE的基因，其特征在于編碼細(xì)鱗魚抗微生物肽CATH_BRALE前體cathelicidin的基因由909個核苷酸組成，自5’端至3’端序列為I ATGAAGATGA AGGCTCTGGC GAGATCTCTT CTCTTGCTCG CTGTGACTGG51 CCTGCTGGTC AGAGGTCATT CCCAGACTGA GACCAGGTAC GAAGACATCA101 TCACAGCTGC TTCAACTCAG CTGCTTCCTG TGGAAGAGCA GGCTTTCCGT151 CCGCTTCTGA ACCAGCTGGA AGTCGAGACT TTGAATACAG AGGATGTGGA201 CCAGTCTGAG GTATCTGTAA AGTTGAGCTT TCCCCTGCAG GAGACTCTCT251 GCAGAAAGGC ACAAGGCCAA CCATGCCCTC TGAAGAAAAA TGGGAAACGA301 ATGATGTGCA GCATGGAGGT CAGACATCCG ATTCTGGATA CTGGCAACAC351 CCTCAACACT GACTGGTCTG ACATTTCTTG TGAATACATG GAGGCAGAAG401 ATGCTATGCC AGTACTGAGC ACTCAGAAGA TTCGGACAAG AAGAAGCAAG451 GCCAGGGGAG GCTCTAGGGG CTCTAAGATG GGTAGAAAAG ATTCCAAGGG501 GGGTAGCAGA GGTCGTCCTG GGAGTGGCTC TCGTCCTGGG GGTGGCTCCT551 CCATTGCTGG AGCTAGCAGA GGAGACCGTG GTGGAACTCG CAATGCATAG601 AACAGCACAA CACACCCTCT GGATAACTGC AAAATATCTC ACCAATCAAA651 GGAACTTCAA AAGCACTCAA AGTTGAGTTT AACGGATGAA CATGCAACCT701 TAAGCTTCTG GTAACTCTTT TGTCTACATT CTGAATTGGT TTGTATTTTG751 TAGCTATCGT TGTTTGTAAT AATGTACCTA TTCTTACATG CCAATCCTTG801 AATTTTAACT ACGGAAAATT GTTTCCAGTT CATGTTTACT GCACTAATAA851 ACTGCTAAAT AAGTTTCCAA AAAAAAAAAA AAAAAATGGT GTCTCATCGT901 ACCCCGAAT 編碼細(xì)鱗魚cathelicidin成熟肽CATH_BRALE為第439 — 597位核苷酸，其氨基酸序列為Arg1 Arg2 Ser3 Lys4 Ala5Arg6 Gly7 Gly8 Ser9 Arg10 Gly11 Ser12 Lys13 Met14 Gly15 Arg16T 17 a 18<-^ 19 T 20 /-Ai 21 /-Ai 2223 a 24 /-a t 25 a 26 t) 27 r^-\ 2829 /-a i 3031 a 32Lys Asp Ser Lys Gly Gly Ser Arg Gly Arg Pro Gly Ser Gly Ser ArgPro33 Gly34 Gly35 Gly36 Ser37 Ser38 He39 Ala40 Gly41 Ala42Ser43 Arg44 Gly45 Asp46 Arg47Gly48 Gly49 Thr50 Arg51 Asn52 Ala53
3.權(quán)利要求I所述抗微生物肽CATH_BRALE的制備方法，其特征在于根據(jù)編碼細(xì)鱗魚cathelicidin抗微生物肽基因推斷的成熟肽CATH_BRALE氨基酸序列，用自動多肽合成儀合成其全序列；通過HPLC反相柱層析脫鹽純化，并確定其純度大于95% ;用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜測定其分子量；等電聚焦電泳測定等電點(diǎn)，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
4.權(quán)利要求2所述細(xì)磷魚抗微生物肽CATH_BRALE基因在醫(yī)療、生物制藥及水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治中的應(yīng)用，其特征在干，合成的CATH_BRALE抗菌肽具有很強(qiáng)的殺菌作用，尤其對于水產(chǎn)養(yǎng)埴常見的病原菌A. salmonicida、A. hydrophila及真菌。溶于滅菌超純水,用于藥理活性檢測。
全文摘要
一種細(xì)鱗魚Cathelicidin抗微生物肽CATH_BRALE及其基因、制備、應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。CATH_BRALE的基因由909個核苷酸組成，其中編碼成熟肽部分的為第439－597位核苷酸。成熟肽CATH_BRALE富含堿性氨基酸，對水產(chǎn)養(yǎng)殖常見病原菌殺菌作用很強(qiáng)。結(jié)構(gòu)簡單，不含有二硫鍵及環(huán)狀結(jié)構(gòu)，方便化學(xué)合成及基因工程制備。其對多種臨床耐藥菌，尤其是真菌也有較好的殺滅作用。
文檔編號C12N15/12GK102816223SQ20121018694
公開日2012年12月12日 申請日期2012年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月8日
發(fā)明者于海寧, 王義鵬, 厲政, 張嵩巖 申請人:大連理工大學(xué)