一種米曲霉分泌木質(zhì)素制備過氧化物酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明一種米曲霉分泌木質(zhì)素制備過氧化物酶的方法，涉及生物工程領(lǐng)域。其生產(chǎn)工藝流程是秸稈經(jīng)過粉碎、預(yù)濕等預(yù)處理工藝，米曲霉經(jīng)過液體搖瓶培養(yǎng)、一級種子培養(yǎng)、與秸稈混合進行固態(tài)發(fā)酵，得到含有木質(zhì)素過氧化物酶的秸稈發(fā)酵物，酶活性3～800U/g干發(fā)酵物，發(fā)酵物經(jīng)過水提取、分子截留、冷凍干燥可以獲得酶制劑粗品,酶活性達到900～8000U/g干粗品。此發(fā)酵工藝簡便，不會對環(huán)境造成污染，也不會對資源造成浪費。采用此方法制得的木質(zhì)素過氧化物酶可以用于降解木質(zhì)素大分子結(jié)構(gòu)、釋放小分子物質(zhì)，提高含有木質(zhì)素秸稈的消化利用率，從而有助于提高秸稈的飼用價值。
【專利說明】一種米曲霉分泌木質(zhì)素制備過氧化物酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，特指未經(jīng)高溫、高壓處理的秸桿培養(yǎng)基經(jīng)發(fā)酵制備木質(zhì)素過氧化物酶制品，該制品用水提取，提取液經(jīng)過分子截留，冷凍干燥獲得木質(zhì)素過氧化物酶的粗品。
【背景技術(shù)】
[0002]我國是農(nóng)業(yè)大國，每年農(nóng)作物秸桿年產(chǎn)量逾6億噸，除少量被用作紡織、造紙行業(yè)，但大部分以堆積、焚燒的形式傾入環(huán)境，既浪費了資源也給環(huán)境造成了極大地危害。
[0003]秸桿含有植物光合作用所積累的一半以上的能量，富含粗糖、粗蛋白質(zhì)等有利于家畜家禽所需的成分，作為非競爭性的飼料資源，只要能夠進行合理的加工調(diào)制，用來飼喂畜禽，特別是用來飼喂牛、羊等反芻家畜，有可能成為優(yōu)質(zhì)的飼料資源。同時，我國又是一個飼料(尤其是蛋白質(zhì)飼料)嚴重短缺的大國，每年需進口大量的魚粉以彌補蛋白質(zhì)飼料的不足。所以能否將秸桿纖維轉(zhuǎn)化為動物可利用且營養(yǎng)價值高的蛋白質(zhì)飼料，以解決飼料需求的嚴重不足，就顯得尤為重要。
[0004]植物的秸桿主要有木質(zhì)素和纖維素構(gòu)成。木質(zhì)素是一類由苯酚和非苯酚結(jié)構(gòu)單元通過醚鍵和碳碳鍵等連接而成的具有芳香族特性的天然聚合物，其在組分種類和連接鍵類型方面的多樣性，意味著其結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性與不規(guī)則性，也決定了對木質(zhì)素進行生物降解的復(fù)雜性和特殊性，且其在植物細胞壁中與半纖維素以共價鍵形式結(jié)合后，將纖維素分子包埋在其中，形成堅固的天然屏障，使一般的微生物很難進入其中分解纖維素，因此，木質(zhì)素的降解也是能否有效利用秸桿資源的關(guān)鍵因素。
[0005]目前降解秸桿的主要方法中有代表性的包括蒸汽汽爆預(yù)處理、硫酸預(yù)處理、氫氧化鈉預(yù)處理、氨水預(yù)處理和生物預(yù)處理等5種方法。蒸汽汽爆則是以高壓蒸汽滲入纖維內(nèi)部，以氣流的方式從封閉的空隙中釋放出來，纖維發(fā)生一定的機械斷裂，使原料中大部分半纖維素和少量木質(zhì)素、纖維素降解溶出，該方法成分較高，需要大型的設(shè)備，木質(zhì)素還需要處理；酸處理法是利用硫酸水解糖苷鍵、酯鍵等，使玉米秸桿纖維的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)疏松，但是該方法耗用大量的有機酸或無機酸，木質(zhì)素仍需要進一步處理，不適應(yīng)大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。堿處理和氨水處理是利用木質(zhì)素溶于堿性溶液，與酸處理一樣同樣存在環(huán)境污染問題。這些方法普遍都存在反應(yīng)條件較難掌握、反應(yīng)溫度高、處理時間長、占用空間大、處理效果不理想，不能去除木質(zhì)纖維素等問題，近年來生物處理秸桿越來越受到人們的重視，生物降解木質(zhì)素的關(guān)鍵是微生物能夠分泌降解木質(zhì)素的酶:錳過氧化物酶、木質(zhì)素過氧化物酶和漆酶。
[0006]對于生物法生產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶的專利、研究都較少。專利(申請?zhí)?200610109413)的目的在于克服目前白腐真菌降解木質(zhì)素的不足之處，而提供一種新型的降解木質(zhì)素的微生物菌劑以及利用上述菌劑降解木質(zhì)纖維素的方法。微生物菌劑是由假單胞菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌組成。米曲霉是被美國食品藥物管理局(FDA)和美國飼料公定協(xié)會(AAFCO)、我國農(nóng)業(yè)部認定的可以直接飼喂動物的飼料級微生物添加劑菌種，但是未見米曲霉分泌木質(zhì)素過氧化物酶的專利及其相關(guān)文獻報道。
[0007]本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，摸索出一種以秸桿為主要原料，通過米曲霉菌體固態(tài)培養(yǎng)獲得木質(zhì)素過氧化物酶的方法。該方法不同于過去的方法之處在于所使用的菌種是被美國食品藥物管理局(FDA)和美國飼料公定協(xié)會(AAFCO)、我國農(nóng)業(yè)部認定的可以直接飼喂動物的飼料級微生物添加劑的米曲霉菌種，采用秸桿作為主要原料，通過固態(tài)發(fā)酵獲得含有木質(zhì)素過氧化物酶的發(fā)酵物制品，該制品可以經(jīng)過進一步提取制得木質(zhì)素過氧化物酶粗品。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本發(fā)明一個目的是提供了一種以米曲霉為菌種，以秸桿為原料進行固態(tài)發(fā)酵的方法，以及由該方法制備的米曲霉發(fā)酵物，該發(fā)酵物中含有木質(zhì)素過氧化物酶。
[0009]本發(fā)明一種米曲霉分泌木質(zhì)素制備過氧化物酶的方法，按照下述步驟進行:以米曲霉為出發(fā)菌株，進行試管擴大培養(yǎng)、液體搖瓶培養(yǎng)、一級種子培養(yǎng)和固體發(fā)酵培養(yǎng)，得到含有木質(zhì)素過氧化物酶的米曲霉固體發(fā)酵物，然后進行提取得到含有木質(zhì)素過氧化物酶粗品。
[0010]其中所述的菌種是任何一種米曲霉菌種，如中國普通微生物菌種保藏管理中心(CCGMC)、中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)、中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)、中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心(CMCC)、國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心(CVCC)和抗生素菌種保藏管理中心等等保藏的菌種。
[0011]其中所述的含有木質(zhì)素的農(nóng)作物秸桿原料是任意一種秸桿，如玉米秸桿、稻草秸桿、麥秸桿、高粱秸桿、大豆秸桿、棉花秸桿等等所有含有木質(zhì)素的農(nóng)作物秸桿，秸桿首先經(jīng)過粉碎，過20-100目的篩。`
[0012]其中所述的試管擴大培養(yǎng)工藝中，其擴大培養(yǎng)基為馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基；
其中所述的液體搖瓶培養(yǎng)和一級種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基均為:葡萄糖5-30克，酒石酸銨
0.1-5克，苯甲醇0.2-3克，硫酸鎂0.2-I克，吐溫80 0.5-10克，磷酸二氫鉀2-9克，鄰苯二甲酸3-18克，加水定容到I升，pH 5-8克，120-140°C滅菌20-40分鐘。
[0013]其中所述的搖瓶培養(yǎng)工藝條件為，接種一環(huán)米曲霉試管斜面孢子于裝有體積比16-48%培養(yǎng)基的三角瓶中，在轉(zhuǎn)速:150轉(zhuǎn)/分，25-35°C，培養(yǎng)24-72小時；在進行搖瓶培養(yǎng)之前，首先將米曲霉菌種接入新配置的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25-35°C，培養(yǎng)時間48-144小時；4-10°C保存?zhèn)溆谩?br>
[0014]其中所述的一級種子培養(yǎng)工藝為，按I-20% (體積比)的接種量將搖瓶培養(yǎng)種子液接種到一級種子培養(yǎng)基中，在溫度25-35°C，攪拌轉(zhuǎn)速50-200轉(zhuǎn)/分，通氣量0.2-
2: I體積/體積/每分鐘(通氣氣體體積/發(fā)酵液體積/每分鐘),培養(yǎng)18-72小時；
其中所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)中固體發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:秸桿10千克，水20-60千克，葡萄糖0.5-3千克，黃豆餅粉0.5-2千克；硫酸銅5-15克，硫酸亞鐵5-15克，硫酸錳5-20克，該培養(yǎng)基各成分可以按此比例放大；
其中所述的發(fā)酵工藝為:按2-20% (種子液體積/發(fā)酵培養(yǎng)基重量)，培養(yǎng)料厚度為
0.1-0.4米，料寬0.5-2米，長度不限，通氣量為0.3-1.5:1 (氣體體積/發(fā)酵培養(yǎng)基重量)/每分鐘，培養(yǎng)時間為3天-23天，中途翻料I-2次。[0015]其中所述的生產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶粗品的工藝，將上述的固態(tài)發(fā)酵物粉碎，過20~100目篩，粉碎的發(fā)酵培養(yǎng)物與水按1: 10~50比例混合，50~300轉(zhuǎn)/分鐘攪拌，5~10°C提取4~8小時，抽濾，濾渣用10~50倍的水混合，50~300轉(zhuǎn)/分鐘攪拌，5~10°C提取4~8小時，抽濾，兩次濾液合并，通過分子量5000~10000的膜截留濃縮50~100倍，-20°C冷凍干燥，得到酶制劑粗品。由此工藝得到的酶制劑粗品，色質(zhì)白色至褐色，木質(zhì)素過氧化物酶活性可達到900~8000U/g干粗品。
[0016]由本發(fā)明獲得秸桿發(fā)酵物含有大量的黃綠色米曲霉孢子，發(fā)酵物桔黃色至褐色，含有酒曲香味，木質(zhì)素過氧化物酶活性達到3~800U/g干發(fā)酵物。
[0017]根據(jù)本發(fā)明所述的發(fā)酵培養(yǎng)工藝，結(jié)合本領(lǐng)域的基本知識，可以根據(jù)生產(chǎn)需要，增加二級、三級甚至四級種子罐，進一步擴大固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)規(guī)模，以進行工業(yè)化生產(chǎn)。二級、三級甚至四級種子罐采用的培養(yǎng)基與搖瓶培養(yǎng)基和一級種子培養(yǎng)基相同，接種量為5~20%，培養(yǎng)條件同于一級種子培養(yǎng)，
采用此工藝的優(yōu)點采用固態(tài)發(fā)酵，并且不經(jīng)高溫高壓處理，這樣不會給環(huán)境造成污染，也不會浪費資源。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為本專利的工藝流程圖。
[0019]
【具體實施方式】
[0020]根據(jù)此工藝采用的木質(zhì)素過氧化物酶測定方法為:準確稱取I克發(fā)酵物或酶制劑粗品，溶于50mL水中，室溫振蕩2小時，抽濾，濾液定容至50mL，即為酶液。準確移取200mM酒石酸緩沖液0.5 mL于容積為1.4 mL的比色皿中，加入40 mM黎蘆醇0.1 mL。準確加入待測酶液Χμ L(X=0~400)，加入純凈水(400-Χ)μ L。30°C水浴，加入濃度為20 mM H2O2溶液0.01 mL啟動反應(yīng)，迅速測定310 nm處的吸光度，I min后再測定I次計算二者之差，即為每分鐘的吸光度變化(0D310變化)。
【權(quán)利要求】
1.一種米曲霉分泌木質(zhì)素制備過氧化物酶的方法，其特征在于按照下述步驟進行:以米曲霉為出發(fā)菌株，進行試管擴大培養(yǎng)、液體搖瓶培養(yǎng)、一級種子培養(yǎng)和固體發(fā)酵培養(yǎng)，得到含有木質(zhì)素過氧化物酶的米曲霉固體發(fā)酵物，然后進行提取得到含有木質(zhì)素過氧化物酶粗品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種米曲霉分泌木質(zhì)素制備過氧化物酶的方法，其特征在于其中所述的菌種是任何一種米曲霉菌種，如中國普通微生物菌種保藏管理中心(CCGMC)、中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)、中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)、中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心(CMCC)、國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心(CVCC)和抗生素菌種保藏管理中心等等保藏的菌種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種米曲霉分泌木質(zhì)素制備過氧化物酶的方法，其特征在于其中所述的含有木質(zhì)素的農(nóng)作物秸桿原料是任意一種秸桿，如玉米秸桿、稻草秸桿、麥秸桿、高粱秸桿、大豆秸桿、棉花秸桿等等所有含有木質(zhì)素的農(nóng)作物秸桿，秸桿首先經(jīng)過粉碎，過20-100目的篩。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種米曲霉分泌木質(zhì)素制備過氧化物酶的方法，其特征在于其中所述的試管擴大培養(yǎng)工藝中，其擴大培養(yǎng)基為馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種米曲霉分泌木質(zhì)素制備過氧化物酶的方法，其特征在于其中所述的液體搖瓶培養(yǎng)和一級種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基均為:葡萄糖5-30克，酒石酸銨0.1-5克，苯甲醇0.2-3克，硫酸鎂0.2-I克，吐溫80 0.5-10克，磷酸二氫鉀2-9克，鄰苯二甲酸3-18克，加水定容到I升，pH 5-8克，120-140°C滅菌20-40分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種米曲霉分泌木質(zhì)素制備過氧化物酶的方法，其特征在于其中所述的搖瓶培養(yǎng)工藝 條件為，接種一環(huán)米曲霉試管斜面孢子于裝有體積比16-48%培養(yǎng)基的三角瓶中，在轉(zhuǎn)速:150轉(zhuǎn)/分，25-35°C，培養(yǎng)24-72小時；在進行搖瓶培養(yǎng)之前，首先將米曲霉菌種接入新配置的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25-35°C，培養(yǎng)時間48-144小時；4-10°C保存?zhèn)溆谩?br>
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種米曲霉分泌木質(zhì)素制備過氧化物酶的方法，其特征在于其中所述的一級種子培養(yǎng)工藝為，按I-20% (體積比)的接種量將搖瓶培養(yǎng)種子液接種到一級種子培養(yǎng)基中，在溫度25-35°C，攪拌轉(zhuǎn)速50-200轉(zhuǎn)/分，通氣量0.2-2:1體積/體積/每分鐘(通氣氣體體積/發(fā)酵液體積/每分鐘),培養(yǎng)18-72小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種米曲霉分泌木質(zhì)素制備過氧化物酶的方法，其特征在于其中所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)中固體發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:秸桿10千克，水20-60千克，葡萄糖0.5-3千克，黃豆餅粉0.5-2千克；硫酸銅5-15克，硫酸亞鐵5-15克，硫酸錳5-20克，該培養(yǎng)基各成分可以按此比例放大。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種米曲霉分泌木質(zhì)素制備過氧化物酶的方法，其特征在于其中所述的發(fā)酵工藝為:按2-20%(種子液體積/發(fā)酵培養(yǎng)基重量)，培養(yǎng)料厚度為0.1-0.4米，料寬0.5-2米，長度不限，通氣量為0.3-1.5:1 (氣體體積/發(fā)酵培養(yǎng)基重量)/每分鐘，培養(yǎng)時間為3天-23天，中途翻料I-2次。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種米曲霉分泌木質(zhì)素制備過氧化物酶的方法，其特征在于其中所述的生產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶粗品的工藝，將上述的固態(tài)發(fā)酵物粉碎，過20-100目篩，粉碎的發(fā)酵培養(yǎng)物與水按1: 10-50比例混合，50-300轉(zhuǎn)/分鐘攪拌，5-10°C提取4-8小時，抽濾，濾渣用10-50倍的水混合，50-300轉(zhuǎn)/分鐘攪拌，5-10°C提取4-8小時，抽濾，兩次濾液合并，通過分子量5000-10000的膜截留濃縮50-100倍，-20°C冷凍干燥，得到酶制劑粗品，由此工藝得到的酶制劑粗品，色質(zhì)白色至褐色，木質(zhì)素過氧化物酶活性可達到900-8 000U/g干粗品。
【文檔編號】C12N9/08GK103451161SQ201210169793
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月29日
【發(fā)明者】張志才, 陳鈞, 任曉鋒, 李佳少, 黃達明 申請人:江蘇大學(xué)